全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（12）：2419–2428 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–06–29；修回日期：2013–11–20
基金项目：国家自然科学基金项目（31101555）；山西省青年基金项目（2011021032-2）；山西省留学基金项目（2011051）；山西省高等
学校优秀青年学术带头人项目（2012）；山西人才引进与开发专项（614191）；山西农业大学科技创新基金项目（2010021）
* 并列第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：rli2001@hotmail.com；gtang1@mtu.edu）
致谢：感谢构建 pCAMBIA2300-PacI 载体的康文俊同学。
拟南芥 At-pri-miR828 基因的克隆及其对番茄的
遗传转化
贾小云 1，于治芹 1,*，梁建萍 1，唐贵良 1,2,3,**，金雷皓 1，张 莉 4，贺立恒 4，
李润植 4,**
（1 山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801；2 密歇根理工大学生物科学院，美国霍顿 49931；3 河南农业大
学，郑州 450002；4 山西农业大学农学院，山西太谷 030801）
摘 要：MicroRNA828（miRNA828）是一种新近发现的生物学功能还未全面研究的 miRNA。为从
不同角度阐明 miRNA828 的生物学功能，从拟南芥中克隆到 At-pri-miR828 基因并构建了该基因过量表达
的植物表达载体 pC2300-pOT2-At-pri-miR828，通过农杆菌介导的叶盘法将 pC2300-pOT2-At-pri-miR828
导入异源植物番茄品种‘Ailsa Craig’中。PCR 鉴定结果显示，外源基因 At-pri-miR828 已成功整合到转
基因番茄基因组中，共获得 9 个转基因株系，67 株转基因植株。定量 PCR 检测结果显示，与野生型番茄
植株相比，转基因植株中 miR828 的表达量显著增加，而生物信息学所预测的 miR828 靶基因 Sly-myb-like1
的表达水平则相应降低。花青素含量测定结果显示，miR828 过量表达的转基因番茄植株花青素含量明显
低于野生型植株，表明 miR828 参与了番茄花青素的生物合成调控。
关键词：番茄；miR828；Sly-myb-like1；花青素；实时定量 PCR
中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）12-2419-10

Cloning of Arabidopsis At-pri-miR828 Gene and Its Genetic Transformation
into Tomato
JIA Xiao-yun1，YU Zhi-qin1,*，LIANG Jian-ping1，TANG Gui-liang1,2,3,**，JIN Lei-hao1，ZHANG Li4，
HE Li-heng4，and LI Run-zhi4,**
（1College of Life Sciences，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi 030801，China；2Department of Biological
Sciences，Michigan Technological University，Houghton，MI 49931，USA；3Henan Agricultural University，Zhengzhou
450002，China；4College of Agriculture，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi 030801，China）
Abstract：MicroRNA828（miR828）is a newly identified small RNA whose biological functions are
still not very clear. To explore the biological functions of miR828，particularly in tomato，the At-pri-
miR828 gene was isolated from Arabidopsis thaliana，and cloned into the corresponding site of the
pCAMBIA2300 to construct the plant expression vector pC2300-pOT2-At-pri-miR828. This At-pri-miR828

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overexpressing vector was then introduced into tomato（Solanum lycopersicum Mill.‘Ailsa Graig’）using
Agrobacterium-mediated transformation. Total of 9 transgenic lines and 67 transgenic plants carrying the
At-pri-miR828 gene under the control of the 35S promoter were generated. PCR amplification showed that
At-pri-miR828 was integrated into the genome DNA of transgenic tomatoes. Real-time PCR analysis
demonstrated that miR828 mRNA level in the transgenic tomatoes was increased greatly. Accordingly，
expression of Sly-myb-like1，a potential target gene of miR828 predicted by informatics，was suppressed.
Further anthocyanin content analysis revealed that anthocyanin content was greatly reduced in miR828
overexpressed transgenic plants，demonstrating miR828 might function in the anthocyanin biosynthesis of
tomato.
Key words：tomato；miR828；Sly-myb-like1；anthocyanin；real-time PCR

MicroRNA（miRNA），也称微小 RNA，是一类内源性的单链非编码小分子 RNA，长度约为 21 ~
24 个核苷酸（Bartel，2004）。miRNA 介导了一种新的基因表达调控模式，在植物体内，主要在转
录后水平通过与靶 mRNA的互补配对来负调控靶 mRNA的转录或翻译（Mallory & Vaucheret，2004）。
miRNA 的表达比蛋白基因更迅速，并且不受翻译过程的影响，所以对目标基因的表达调控效率更高
（Floyd & Bowman，2004）。作为重要的调节分子，miRNA 介导的基因表达调控在植物器官的形态
建成、生长发育、激素分泌、信号转导以及与环境互作等多种生理生化过程中起重要作用（Li et al.，
2005；Sunkar et al.，2006；Jia et al.，2009）。MicroRNA828（miR828）是新近测序发现的生物学功
能还未全面研究的一种 miRNA。在拟南芥中，通过生物信息学预测和 5′RACE 体外剪切试验发现
miR828 的靶基因为 TAS4（Trans-acting SiRNA 4）、PAP1/MYB75 和 PAP2/MYB90（PRODUCTION OF
ANTHOCYANIN PIGMENT 1 and 2）以及 MYB113（Rajagopalan et al.，2006；Luo et al.，2012）。PAP1、
PAP2 和 MYB113 属于 MYB 转录因子，在植物发育过程中参与花青素、黄酮类、苯基丙酸类等次生
代谢物的合成（Borevitz et al.，2000）。超表达 PAP1/MYB75 转录因子导致转基因番茄植株花青素合
成增加（Zuluaga et al.，2008）。谢烨等（2013）的最新研究表明，miR828 负调控拟南芥蔗糖诱导下
花青素的生物合成。本实验室前期通过生物信息学方法预测，在番茄中，miR828 的靶基因为乙烯不
敏感基因（ethylene-insensitive 2，EIN2，SGN-U319128）和花青素合成相关基因 Sly-myb-like1
（SGN-320618）。这预示着 miR828 可能参与番茄花青素合成途径和调控网络。
花青素是一类重要的、源于苯丙酸途径的天然多酚化合物，具有独特的生物活性。富含花青素
的植物源食品对人类具有诸多保健医疗功效。作为一种重要的大众化果蔬作物，普通番茄果实中花
青素含量甚低。因此，近年来提高番茄果实花青素含量已成为番茄品质改良的一个重要研究领域。
在番茄植株中通过超表达单个异源参与类黄酮合成途径的酶基因和调节基因来提高果实花青素含量
效果欠佳。在番茄果实中同时特异共表达由 E8 启动子驱动的 2 个转录因子，即源于金鱼草的 Del
（bHLH-type TF）和 Ros1（R2R3 MYB-type TF），获得了果肉组织中花青素含量显著增加的表型
（Butelli et al.，2008）。但目前还未见应用 miRNA 调控策略提高普通番茄花青素合成积累的报道。
为深入解析 miR828的生物学功能和建立通过遗传修饰 miRNA提高番茄果实花青素含量的技术
策略，本研究从拟南芥中分离到 At-pri-miR828 基因，并构建过量表达载体。通过农杆菌介导的叶盘
法，将 At-pri-miR828 导入番茄品种‘Ailsa Craig’基因组。目前，已获得了 9 个转基因株系共 67
株转基因植株。实时荧光定量 PCR 分析显示，与野生型相比，转基因番茄植株中 miR828 的表达量
显著增加，相反其靶基因 Sly-myb-like1 表达量则明显下降。初步花青素含量测定发现，miR828 过量
表达的转基因番茄植株花青素含量明显低于野生型植株。这些研究结果为从 miRNA 角度研究番茄
花青素生物合成积累机制提供了新思路。
12 期 贾小云等：拟南芥 At-pri-miR828 基因的克隆及其对番茄的遗传转化 2421

1 材料与方法
1.1 材料
哥伦比亚生态型（Columbia-0）的野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子及野生型番茄种子
（Solanum lycopersicum L.‘Ailsa Craig’）由山西农业大学的韩渊怀教授实验室惠赠。大肠杆菌（E.
coli）菌株 DH5α，农杆菌菌株 GV3101，改造后的带有 2 个 35S 启动子的克隆载体 pOT2 和改造后
带有 PacⅠ单酶切位点的表达载体 pCAMBIA2300（pC2300）（由美国密歇根理工大学的唐贵良教授
惠赠）。
LA Taq 和普通 Taq DNA 聚合酶，T4 连接酶，纯化回收、质粒提取、反转录和荧光定量试剂盒，
Marker DL2000 和 DL1000 均购自中国 TaKaRa 公司；Tans2KTM PlusⅡDNA Marker 购自北京全式金
公司；高保真限制性内切酶 Hind Ⅲ、EcoRⅠ、PacⅠ购自英国 NEB 公司；Trizol 购自美国 Invitrogen。
PCR 引物和其它药品、试剂由生工生物工程（上海）有限公司合成或购自该公司的 BBI 系列产品。
1.2 方法
1.2.1 DNA和 RNA的提取
参照 CTAB 法分别从幼嫩的拟南芥和番茄叶片中提取 DNA（Fulton et al.，1995）。采用 Trizol
法从幼嫩的番茄叶片中提取 RNA。
1.2.2 At-pri-miR828原始转录本序列的获得及引物设计与 PCR扩增
查询 miRBase（http：//microrna.sanger.ac.uk/sequences）数据库获得拟南芥 miR828 前体的序列
（pre-miR828，MI0005384），位于 4 号染色体 13 846 971 ~ 13 847 161 位点，全长 190 bp。根据 pre-miR828
序列 Blast 拟南芥基因组数据库 The Arabidopsis Information Resource（http：//www.arabidopsis.org/cgi-
bin/Blast/TAIRblast.pl），点击网页中的 AT4G27765.1，依次进入 locus detail、gene model detail、
SeqViewer Close-up View 和 SeqViewer Nucleotide View 网页，获得 pre-miR828 序列的上下游序列，
然后在 pre-miR828 序列的两侧各添加 200 bp 左右的侧翼序列，得到 miR828 的原始转录本
pri-miR828。借助 Primer 3.0 软件，对基因序列及载体序列分析，并设计扩增引物。为了便于 miR828
过表达载体的构建，在上下游引物的 5′端分别引入 Hind Ⅲ 酶切位点和 EcoRⅠ酶切位点（下划线
部分）及保护碱基。引物序列如下：miR828-PF：5′-CCGAAGCTTTGGTAGCCTGGGTTGGTG-3′；
miR828-PR：5′-CCCGAATTCTTAAAGGCTTGACTCATACGACA-3′。PCR 反应体系：拟南芥基因组
DNA 1 μL，10× LA PCR 缓冲液 5 μL，2.5 mmol · L-1 dNTPs 5 μL，10 μmol · L -1 的上下游引物各 5 μL，
5 U · μL -1 LA Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 28.5 μL。扩增条件如下：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，
72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 反应结束后，取 2 μL 反应液进行 2%琼脂糖凝胶电泳
检测反应产物。
1.2.3 PCR产物的纯化与测序
PCR 产物经 PCR 产物纯化试剂盒回收后送华大基因公司测序。
1.2.4 克隆载体 pOT2-At-pri-miR828和植物表达载体 pC2300-pOT2-At-pri-miR828的构建
用 Hind Ⅲ和 EcoRⅠ对 pOT2 载体和 At-pri-miR828 的纯化产物分别进行双酶切，然后用 T4 DNA
酶 16 ℃进行过夜连接，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，在含有 Chloramphenicol（Chl）的 LB 平
板上挑选阳性单克隆，质粒 PCR、Hind Ⅲ和 EcoRⅠ双酶切和测序验证后命名为 pOT2-At-pri-miR828。
用 PacⅠ分别单酶切实验室改造后带有 PacⅠ单酶切位点的植物表达载体 pC2300 和 pOT2-
At-pri-miR828 克隆载体，然后分别用 PCR 产物纯化试剂盒进行纯化。将纯化产物用 T4 DNA 酶 16 ℃
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连接过夜，转化 DH5α 感受态细胞，在含有 Chl 和 Kanamycin（Kan）的双抗生素 LB 平板上挑选单
克隆，提取质粒，经 PacⅠ酶切和测序验证后命名为 pC2300-pOT2-At-pri-miR828。
1.2.5 农杆菌介导的叶盘法转化番茄
无菌苗培养：番茄种子的灭菌参照 Sun 等（2006）的方法。将灭好菌的种子均匀的接种于 MSR3
培养基（4.4 g · L-1 MS + 30 g · L-1 蔗糖 + 1 mL · L-1 R3 Vitamins + 10 g · L-1 琼脂粉，pH 5.9）上，置
于 26 ℃（16 h 光照）/18 ℃（8 h 黑暗）的培养箱中培养大约 8 ~ 10 d。
预培养：待无菌苗长至子叶完全展开但真叶没有长出时，将子叶切下并切掉子叶的两个尖端，
置于 MS + 2,4-D 液体培养液（4.4 g · L-1 MS + 30 g · L-1 蔗糖 + 0.2 g · L-1 KH2PO4 + 1 mL · L-1 R3
Vitamins + 0.1 mg · L-1 Kinetin + 0.2 mg · L-1 2,4-D，pH 5.7）中浸泡，然后将浸泡后的子叶外植体放
置在 M1 预培养基（MSR3 培养基 + 0.87 mg · L-1 IAA + 1.75 mg · L-1 Zeatin）上弱光（用布遮盖）预
培养 1 d，培养皿要倒置以防止水凝聚流出。
外植体的侵染、共培养、筛选、芽诱导、根诱导及移苗参考 Sun 等（2006）的方法。筛选培养
基为 MSR3 培养基 + 0.87 mg · L-1 IAA + 1.75 mg · L-1 Zeatin + 75 mg · L-1 Kan + 400 mg · L-1
Augmentin；芽诱导培养基为 MSR3 培养基 + 0.87 mg · L-1 IAA + 1.75 mg · L-1 Zeatin + 50 mg · L-1
Kan + 300 ~ 400 mg · L-1 Augmentin；生根培养基为 MSR3 培养基 + 1 mg · L-1 IAA + 20 mg · L-1 Kan +
200 ~ 300 mg · L-1 Augmentin。
1.2.6 转基因番茄植株的 PCR鉴定
以转基因番茄叶片的基因组 DNA 为模板，以野生型为阴性对照，pC2300-pOT2-At-pri-miR828
质粒为阳性对照，分别扩增目的基因 At-pri-miR828 及载体上的氯霉素抗性基因 Cmr，进行阳性转基
因植株的鉴定。目的基因的扩增引物为 miR828-PF 和 miR828-PR（见 1.2.2），扩增片段长度为 467 bp。
扩增 Cmr 基因的引物为 Cmr-PF：5′-TGGAAGCCATCACAAACG-3′和 Cmr-PR：5′-ATCGCTCTGGAG
TGAATACC-3′，扩增片段长度为 291 bp。
1.2.7 转基因番茄植株的实时荧光定量 PCR分析
从两个 PCR 鉴定结果为阳性的 miR828 过表达转基因株系中各选取一棵转基因植株的嫩叶用
Trizol 提取总 RNA，并用 DNaseⅠ进行处理。分别以番茄 Sly-U6 和 Sly-CAC 为内参基因，用实时
荧光定量法检测 miR828 和其靶基因 Sly-myb-like1（SGN320618）的表达量。引物序列如表 1 所示。
cDNA 第 1 链的合成按 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis 试剂盒的方法合成。荧光定量分析用
SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒在 Stratagene Mx3005P system PCR 仪上完成。数
据分析根据 Livak 和 Schmittgen（2001）的方法进行，即 ΔCT = CT 目标基因–CT 内参基因，目标基因的相对
表达量（相对于内参基因）为 2-ΔCT，转基因植株基因表达的变化表示为对照的 2-ΔCT 记为 1 时目标
基因 2-ΔCT 的相对值（即 2-ΔΔCT），各基因表达量用均值 ± 标准差表示。

表 1 实时定量 PCR 引物
Table 1 Real-time PCR primers
引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence（5′–3′）
Sly-U6（正向引物 Forward primer） CATCCGATAAAATTGGAACGA
Sly-U6（反向引物 Reverse primer） TTTGTGCGTGTCATCCTTGCG
miR828 stem-loop RT（引物 Primer） GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAGGTC
miR828（正向引物 Forward primer） CGAGTTTCGTTGTCTGTTC
miRNA（通用反向引物 Common primer） CGAGCAGTGCAGGGTCCGAGGT
Sly-CAC（正向引物 Forward primer） CCTCCGTTGTGATGTAACTG
Sly-CAC（反向引物 Reverse primer） ATTGGTGGAAAGTAACATCATC
Sly-myb-like1（SGN-U320618，正向引物 Forward primer） GAAGCACAGGAATTGAACCA
Sly-myb-like1（SGN-U320618，反向引物 Reverse primer） AATCCTTATGGGCTTTGGTG
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图 2 pOT2-At-pri-miR828 质粒 PCR 鉴定
M：DNA 分子量 DL1000；1：质粒；2：阴性对照；
3 ~ 6：质粒 PCR 产物。
Fig. 2 PCR identification of pOT2-At-pri-miR828 plasmid
M：DNA marker DL1000；1：Plasmid；2：Negative control；
3–6：PCR product of plasmids.
图 3 pOT2-At-pri-miR828 的 Hind Ⅲ和 EcoRⅠ双酶切鉴定
M：DNA 分子量 DL5000；1、3、5：未酶切质粒；
2、4、6：双酶切质粒。
Fig. 3 Characterization of pOT2-At-pri-miR828 plasmids by
Hind Ⅲ and EcoRⅠdigestions
M：DNA marker DL5000；1，3，5：Undigested plasmids；
2，4，6：Digested plasmids.
图 1 At-pri-miR828 基因 PCR 扩增产物的电泳鉴定
Fig. 1 Electrophoresis of the PCR product of At-pri-miR828
1.2.8 花青素含量的测定
取初果期转基因和野生型植株的嫩叶称重后，用 0.6 mL 含有 1% HCl 的甲醇溶液浸泡提取花青
素，并在 4 ℃黑暗中过夜萃取。第 2 天加入 1 mL 氯仿和 0.5 mL 双蒸水，充分混匀。12 000 r · min-1
离心 3 min，吸取上清。用分光光度计（DU530 spectrophotometer，Life Science，美国）检测在 530 nm
和 657 nm 这 2 个波长下的吸光值，所有样品均重复 3 次。花青素相对含量计算公式为（A530–0.25 ×
A657）· g-1（Rabino & Mancinelli，1986）。
2 结果与分析
2.1 拟南芥 At-pri-miR828 基因的扩增
采用基因特异性引物，以野生型拟南芥总
DNA 为模板，进行高保真 PCR，其产物经电
泳分离获得一条大小约 500 bp 的特异性条带
（图 1），条带表达量高，光信号强，无非特异
性杂带。该片段经纯化、测序及比对，发现与
GenBank 中的 At-pri-miR828（AT4G27765.1）
基因序列同源性为 100%，表明已成功扩增出
拟南芥 miR828 的原始转录本 At-pri-miR828 序
列。
2.2 At-pri-miR828 过表达克隆载体 pOT2-At-pri-miR828 的构建及鉴定
用 Hind Ⅲ和 EcoRⅠ双酶切本实验室改造后的 pOT2 克隆载体，并回收大片段。用 T4 DNA 连
接酶将经 Hind Ⅲ和 EcoRⅠ双酶切的 At-pri-miR828 PCR 纯化产物插入回收的 pOT2 载体中，获得
pOT2-At-pri-miR828 重组质粒。对该质粒用引物 miR828-PF 和 miR828-PR 进行 PCR 及 Hind Ⅲ和
EcoRⅠ双酶切，结果显示（图 2，图 3）目标基因片段大小正确，说明 At-pri-miR828 过表达克隆载
体 pOT2-At-pri-miR828（图 4）构建成功。









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图 5 植物表达载体 pC2300-pOT2-At-pri-miR828
的 PacⅠ酶切鉴定
M：DNA 分子量；1、3、5：未酶切质粒；2、4、6：酶切质粒。
Fig. 5 Characterization of pC2300-pOT2-At-pri-miR828
recombinant vectors by PacⅠdigestion
M：DNA marker；1，3，5：Undigested plasmids；
2，4，6：Digested plasmids.
图 6 植物表达载体 pC2300-pOT2-At-pri-miR828
Fig. 6 Plant expression vector of
pC2300-pOT2-At-pri-miR828


图 4 miR828 过表达克隆载体 pOT2-At-pri-miR828
Fig. 4 pOT2-At-pri-miR828 cloning vector over-expressing miR828

2.3 植物表达载体 pC2300-pOT2-At-pri-miR828 的构建及鉴定
用 T4 DNA 连接酶连接纯化后的经 PacⅠ酶切的 pCAMBIA2300（pC2300）植物表达载体和
pOT2-At-pri-miR828 克隆载体，获得 At-pri-miR828 过表达的重组表达载体 pC2300-pOT2-At-pri-
miR828，提取质粒。PacⅠ单酶切鉴定结果（图 5）说明，pC2300-pOT2-At-pri-miR828 植物表达载
体（图 6）构建成功。最后将鉴定正确的质粒进行测序，结果与 GenBank 中 At-pri-miR828（AT4G27765.1）
的序列一致。






2.4 农杆菌介导 At-pri-miR828 对番茄的遗传转化
应用农杆菌介导的叶盘法进行番茄的遗传转化。部分番茄子叶外植体经预培养、农杆菌侵染、
共培养、筛选培养、芽诱导、生根培养等一系列过程后长成了卡那霉素抗性的植株（图 7）。在转化
的 40 个外植体中共获得了 9 个卡那霉素抗性株系，再生的生根植株总数为 67 株，转化效率为 22.5%。

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图 7 农杆菌介导 At-pri-miR828 对番茄的遗传转化
A：诱导出愈伤组织的外植体；B、C：抗性芽的诱导、伸长及生根；D：抗性植株的盆栽培育。
Fig. 7 Tomato genetic transformation by Ago-mediated At-pri-miR828
A：Explants with callus；B，C：Induction，elongation and rooting of transgenic shoots；
D：Culturing of the rooted tomato plants in pot filled with soil.

2.5 转基因番茄植株的 PCR 鉴定
所获得的 67 株卡那霉素抗性植株嫩叶提取 DNA，以野生型植株 DNA 为阴性对照，以质粒 DNA
为阳性对照，分别进行 At-pri-miR828 及载体上 Cmr 基因的 PCR 扩增。检测结果表明，67 株转基因
植株中，有 58 株为阳性，9 株为假阳性，阳性率为 86.6%。图 8 为 9 株转基因植株 miR828-1 ~ miR828-9
的 PCR 检测结果，除野生型和转化株 miR828-8 以外，其它转基因植株均扩增出约 467 bp 的
At-pri-miR828 基因特异条带（图 8，A）和约 291 bp 的 Cmr 基因特异条带（图 8，B），表明 At-pri-miR828
基因已整合进番茄基因组。


图 8 At-pri-miR828 转基因番茄植株的 PCR 检测
A：目的基因 At-pri-miR828 的检测；B：载体上的 Cmr 基因检测。M：DL1000 DNA 分子量；1：野生型植株；2 ~ 10：转基因植株。
Fig. 8 PCR analysis of At-pri-miR828 transgenic tomatoes
A：Analysis of At-pri-miR828 gene；B：Analysis of Cmr gene；M：DNA marker DL1000；1：Wild type；2–10：Transgenic plants.
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图 11 miR828 转基因番茄植株叶片的花青素含量
1 ~ 6：miR828 过表达转基因番茄。
Fig. 11 Anthocyanin content in leaves of miR828 transgenic tomatoes
1–6：Transgenic tomato plants over-expressing miR828.
图 10 miR828 转基因番茄植株表型
Fig. 10 Phenotype of miR828 transgenic tomatoes
2.6 转基因番茄植株相关基因表达的实时荧光定量 PCR 分析
对 PCR 鉴定结果为阳性的 2 株 miR828 过表达转基因植株（miR828-1 和 miR828-2）及野生型
植株进行 miR828 及其靶基因 Sly-myb-like1 表达水平的荧光定量 PCR 分析。结果显示，两个转基因
植株中 miR828 基因的表达量分别为对照的 52 和 14 倍（图 9，A），而 Sly-myb-like1 基因的表达量
分别为对照的 7%和 28%（图 9，B）。


图 9 MiR828 过表达转基因番茄 miR828-1 和 miR828-2 的 miR828 和 Sly-mby-like1 基因的荧光定量 PCR
Fig. 9 The expressing levels of miR828 and Sly-myb-like1 in leaves of miR828 transgenic tomatoes by real-time PCR

2.7 转基因番茄植株的表型鉴定
观察转基因番茄植株与野生型植株的生长情况发现，miR828 过表达转基因番茄植株较野生型颜
色发绿（图 10）。花青素含量测定结果（图 11）显示，所测定的 6 个 miR828 过表达的转基因番茄
植株的花青素含量均明显低于野生型。


3 讨论
miRNA 在转录后水平调控其靶基因的表达水平，对植物生长发育、组织分化和生理代谢等起重
要的调控作用。目前，有关 miRNA 介导植物花青素生物合成方面的研究报道不多。本实验室在前
期应用STTM技术（Yan et al.，2012）沉默拟南芥内源的miR165/166的研究中发现，内源性miR165/166
的减低表达导致参与花青素生物合成途径的一些基因大量上调表达，植株体内花青素含量显著增加。
Gou 等（2011）的研究发现表明，miR156 通过靶向 SPL 转录因子负调控拟南芥花青素的生物合成。
这些研究表明 miRNA 是介导植物花青素生物合成的一类潜在的调节因子。
12 期 贾小云等：拟南芥 At-pri-miR828 基因的克隆及其对番茄的遗传转化 2427

miR828 是通过深度测序发现的新 miRNA，有关 miR828 生物学功能方面的研究刚刚起步。在拟
南芥中，已通过 5′RACE 方法鉴定了 miR828 直接的靶基因是 MYB113 和 TAS4。有趣的是，miR828
剪切 TAS4 后会产生许多小干扰 RNAs（ta-siRNAs），其中 TAS4-siR81（–）的靶基因是 PAP1/MYB75，
PAP2/MYB90 和 MYB113（Rajagopalan et al.，2006；Luo et al.，2012）。磷缺乏、氮缺乏和外源糖添
加均能够增加 MYB 转录因子中 PAP1/MYB75 和 PAP2/MYB90 的表达，进而激活花青素合成酶结构
基因的表达，使拟南芥植株体内花青素合成积累增多。另一方面，MYB 转录因子中 PAP1/MYB75
的上调表达也能够激活 miR828 表达，接着 miR828 通过指导剪切 TAS4 转录本产生更多的 ta-siRNA，
从而加强了对 PAP1/MYB75、PAP2/MYB90 和 MYB113 靶基因的抑制，被抑制的 PAP1/ MYB75 反过
来又缓解了对 miR828 的激活作用，从而形成了自动负反馈调节（Hsieh et al.，2009）。
根据 miR828 对拟南芥 MYB 转录因子的这种反馈调控模式和应用生物信息学工具预测 miR828
的靶基因为番茄 Sly-myb-like1 转录因子，推断 miR828 可能通过靶向调控 MYB 类转录因子的表达进
而调控番茄花青素的生物合成途径。本研究从模式植物拟南芥中分离到 pri-miR828 基因，并构建了
miR828 过表达载体和进行了番茄的遗传转化。首次获得了异源 miR828 在番茄植株过表达从而导致
其靶基因 Sly-myb-like1 转录因子减低表达和花青素含量降低的实验证据，表明 miR828 可能通过类
似的机制参与拟南芥和番茄植株体内花青素合成途径的调控。谢烨等（2013）通过筛选模式植物拟
南芥糖诱导花青素合成异常的突变体，鉴定到一个新的 mir828 缺失突变体，并通过构建 miR828 过
表达株系证明 miR828 能够负调控蔗糖诱导下花青素的合成。
需要指出的是，miR828 的另一个预测的靶基因是乙烯不敏感基因 EIN2。EIN2 在乙烯的信号转
导过程中起重要调节作用，且研究已发现 miR828 在果实成熟过程中表达量下降（Cara & Giovannoni，
2008；Moxon et al.，2008）。此外，推测 miR828 另一个重要功能是调控果实成熟，即 miR828 表达
量的增加可能会导致乙烯信号转导途径受阻，延迟果实采后呼吸跃变发生，使果实耐储性提高，这
需要进一步试验验证。
相对于转录因子直接参与番茄果实生长发育和花青素合成代谢调控，microRNA 抑制靶基因表
达为我们提供了一种解析果实发育和花青素合成等生命活动调控机理的新线索和工具。本研究中获
得了拟南芥 miR828 影响番茄花青素积累的试验证据，但由于转基因植株群体有限，还未进行过表
达 At-pri-miR828 转基因番茄植株表型在相关条件下的稳定性和其他表型变化的全面观察和验证。本
文作者正对所获得的转基因番茄进行相关基因表达和生理生化等表型的详尽分析，同时培育 miR828
减低表达的转基因番茄，以期全面阐明 miR828 的生物学功能，为建立基于 microRNA 遗传修饰改
良番茄等果蔬品质等农艺表型提供更多有效途径。

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