全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（8）：1663–1672 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–01–17；修回日期：2014–07–18
基金项目：国家自然科学基金项目（31370698，31070622）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2013A004）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：limy@swu.edu.cn）
蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因 CpLEA 的克隆及表
达分析
马 婧，孙文婷，王 晶，眭顺照，李名扬*
（西南大学园艺园林学院，重庆市花卉工程技术研究中心，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715）
摘 要：从蜡梅 （Chimonanthus praecox）花 cDNA 文库中获得了 1 个胚胎晚期丰富蛋白（LEA）基
因的 cDNA 全长序列，命名为 CpLEA（GenBank 登录号：JF412788），该基因 cDNA 含有一个 273 bp 编
码 91 个氨基酸的开放阅读框，从蜡梅基因组 DNA 中扩增该基因发现，该基因含有两个大小分别为 35 bp
和 707 bp 的内含子。生物信息学分析显示，CpLEA 的编码蛋白含有 4 个胚胎晚期丰富蛋白第 3 族 LEA 蛋
白特有的 11 个氨基酸的基元重复序列，进化树分析表明该编码蛋白与榛子的 LEA 蛋白亲缘关系最近。通
过原核表达获得了与预期大小一致的融合蛋白。实时荧光定量 PCR 分析表明，该基因在蜡梅成熟种子中
表达量最高，在根中几乎不表达；在盛开期花的各个部位中又以雌蕊中的表达量最高；在花发育早期表
达量较高，随后下降并保持相对稳定，在衰败期突增并达到最高；检测该基因在脱落酸（ABA 50
μmol · L-1）、低温（4 ℃）、高温（42 ℃）、干旱（30% PEG6000）和高盐（NaCl 1 mol · L-1）5 种外源
非生物胁迫因子作用下的表达特性。结果表明，该基因能够被 ABA、低温、高温、PEG 和 NaCl 诱导表
达，并在随后的时间内呈现出不同的表达模式。表明 CpLEA 可能在蜡梅花发育和多种非生物胁迫响应中
发挥作用。
关键词：蜡梅；胚胎晚期丰富蛋白；原核表达；基因表达分析
中图分类号：S 685.17 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）08-1663-10

Cloning and Expression Analysis of a Late Embryogenesis Abundant
Protein Gene CpLEA from Chimonanthus praecox
MA Jing，SUN Wen-ting，WANG Jing，SUI Shun-zhao，and LI Ming-yang*
（Chongqing Engineering Research Center for Floriculture，Key Laboratory of Horticulture Science for Southern
Mountainous Regions，Ministry of Education，College of Horticulture and Landscape，Southwest University，Chongqing
400715，China）
Abstract：CpLEA，a new late embryogenesis abundant protein（LEA）gene was identified by
randomly cloning and sequencing from Chimonanthus praecox flowers cDNA library. CpLEA has an open
reading frame（ORF）of 273 bp encoding a putative 91aa-polypeptide，with two introns of 35 bp and 707
bp respectively. The bioinformatics analysis showed that there were no signal peptide and trans-membrane
domain existing in CpLEA protein. Phylogenetic analysis indicated that CpLEA protein can be clustered
together with the other known plant group 3 LEA proteins according to its sequence characterizations. Then，

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the prokaryotic expression vector，which contained the ORF of CpLEA gene，was constructed and the
targeted fusion protein at the molecular weight 30 kD coding by CpLEA gene was induced by IPTG.
qRT-PCR demonstrated that expression of CpLEA was higher in mature seed compared to that in other
tissues and was almost cannot be observed in roots. During the flowering stage，the expression of CpLEA
was abundant in the early stage of the flower development and then decreased until the blooming stage and
increased significantly at the scence senescence stage. The expression of CpLEA was up-regulated by
ABA，cold，salt，drought and hot stresses. It can be to some extent inferred that the CpLEA gene obtained
in this study plays an important role in early stage of flower development and abiotic stresses responses.
Key words：Chimonanthus praecox；late embryogenesis abundant protein（LEA）；prokaryotic
expression；gene expression analysis

晚期胚胎丰富蛋白（late embryogenesis abundant protein，LEA）是指胚胎发生后期种子中大量
积累的一系列蛋白质。自 1981 年，首次在胚胎发育后期的棉花子叶中分离到一组含量丰富且转录产
物为晚期胚胎发育丰富蛋白的 mRNA，并命名为 LEA mRNA（Dure et al.，1981），之后又相继从小
麦（Ried & Walker-Simmons，1993）、大豆（Hsing et al.，1995）、玉米（Campbell et al.，1998）等
几十种高等植物中获得了一系列 LEA 蛋白（李剑 等，2010）。目前发现 LEA 蛋白不仅存在于高等
植物中，在动物和微生物中也有分布（Tunnacliffe et al.，2005；鲁松 等，2013）。随着对 LEA 蛋白
研究的深入，植物材料的增多和家族成员的不断扩充，目前得到较多认可的分类方法是 Ingram 和
Bartels（1996）根据氨基酸序列的同源性和一些特殊的基元序列，将 LEA 蛋白分为 6 族，即 D19 LEA
（1 族）、D11 LEA（2 族）、D7 LEA（3 族）、D113 LEA（4 族）、D29LEA（5 族）和 D95 LEA（6
族）。目前对高等植物 LEA 蛋白的研究主要集中在其参与植物逆境胁迫响应上，其中第 3 族 LEA 蛋
白以其同源序列区域包括 11 个氨基酸基元序列的串联重复排列，并可以形成亲水的 α–螺旋结构而
区别于其他 LEA 蛋白（Baker et al.，1988）。其具有的大量亲水性氨基酸，可以在植物脱水时重新
定向细胞内的水分子，束缚盐离子，避免干旱胁迫时细胞内高浓度离子的积累所引起的损伤，从而
参与植物抗旱和抗高盐胁迫响应过程（Dure，1993；Ingram & Bartels，1996）。但目前关于第 3 族
LEA 蛋白的详细功能和生理机能还有待进一步研究。
蜡梅（Chimonanthus praecox）作为具有独特经济和观赏价值的名贵花木，是典型的“三抗”（抗
寒、抗病、抗虫）植物，其冬季开花过程集开花与抗逆于一体，并可以在低温、少雨条件下完成种
子的早期发育（吴昌陆和胡南珍，1995），可能存在其特殊的分子机理。本研究从前期构建的蜡梅花
cDNA 文库（Sui et al.，2012）中，利用 EST 技术克隆了 1 个蜡梅的第 3 族 LEA 蛋白基因，对基因
序列进行分析，成功构建原核表达载体并在体外诱导表达获得了可溶性蛋白。进一步利用实时荧光
定量 PCR 技术检测了其在蜡梅不同器官、花发育的不同时期及多种非生物胁迫下的表达情况，目的
是获得有关该基因潜在功能的初步信息，对进一步深入研究蜡梅 LEA 蛋白基因功能以及最终利用其
进行蜡梅品种的定向改良具有一定意义。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用材料罄口蜡梅（Chimonanthus praecox var. grandiflora）种子于 2012 年 12 月至 2013
年 1 月采自西南大学校园内。蜡梅花 cDNA 文库构建及保存由重庆市花卉工程技术研究中心眭顺照
8 期 马 婧等：蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因 CpLEA 的克隆及表达分析 1665

等（2007）完成。胁迫处理所用的蜡梅四叶期的幼苗采用种子繁殖获得，将种子催芽后放置人工气
候箱中培养，培养温度为昼 25 ℃/夜 20 ℃；湿度为 85%；光周期为昼 16 h/夜 8 h；光照强度为 20 000
lx。克隆菌株大肠杆菌 Top10、原核表达菌株 BL21 及表达载体 PET32a 由重庆市花卉工程技术研究
中心保存；ExTaq 酶、克隆载体 pMD19-T、反转录试剂盒 PrimeScriptTM RT Reagent Kit 均购于大连
宝生物有限责任公司；RNA 提取试剂盒为天根公司生产的 RNAprep Pure Plant Kit 试剂盒；SsoFastTM
EvaGreen Supermix 试剂盒购于 Bio-Rad 公司；DNA Marker、胶回收试剂盒均购自 BioFlux 公司；PCR
扩增所用的 Taq DNA 聚合酶为全式金公司的 ThansTaq DNA Polymerase High Fidelity；引物合成及
DNA 测序由北京六合华大基因有限公司完成。
1.2 目标克隆子的获得及序列分析
随机挑选文库克隆，提取质粒DNA以5′ pTripl Ex-Sequence primer为测序引物，采用ABI3700DNA
自动序列测定仪进行正向序列测定得到 EST 序列，然后运用 DNAStar7.0 软件包的 SeqMan 进行 EST
聚类，运行 BLASTX 与 nr 库进行比对，获得目标克隆子，再以 SP5 和 T7 为测序引物进行两次正、
反向序列测定，得到蜡梅晚期胚胎丰富蛋白基因 cDNA 序列，并将其命名为 CpLEA。同时从蜡梅
cDNA 和基因组 DNA 中跨 ORF 框进行目的基因的扩增，验证是否存在内含子。利用 DNAStar 7.0
软件包对该序列进行开放阅读框预测，利用 NCBI 站点上的 BLASTX 对该序列同源性比较分析；
MEGA 进行进化树分析；SignalP 预测蛋白质序列中信号肽的剪切位点；ProtParam 进行编码蛋白的
基本性质分析；TMpred 预测蛋白质的跨膜区段和在膜上的取向；PSORT 进行蛋白亚细胞定位；
SOPMA 预测蛋白质的二级结构。
1.3 蜡梅 DNA、RNA 的提取与 cDNA 第一链的合成
采用 CTAB 法提取蜡梅叶片 DNA，获得的 DNA 于–20 ℃保存。使用 RNAprep pure 植物总 RNA
提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取蜡梅材料的总 RNA，然后以 1 μL 总 RNA 为模板，按
PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time（大连宝生物有限责任公司）试剂盒说明书合成 cDNA
第一链。
1.4 蜡梅 CpLEA 原核表达载体的构建
通过对目的基因序列和原核表达载体 pET-32a 的多克隆位点进行分析后，设计合成一对 PCR 扩
增引物。正向引物：5′-GGATCCATGTCGAACATTTCGCACAAGGCAG-3′（下划线为 BamHⅠ酶切
位点）；反向引物：5′-AAGCTTGTTTTTCATTGGGTCCCTTCACTTTG-3′（下划线 HindⅢ酶切位点）。
以来源于文库的含 LEA 基因的阳性质粒为模板，PCR 扩增该基因的开放阅读框。PCR 扩增体系为：
模板 1 μL，10 mmol · L-1 dNTPs 1.5 μL，10× PCR buffer 2.5 μL，10 μmol · L-1 正、反向引物各 1 μL，
5 U · μL-1 Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，ddH2O 17.8 μL。PCR 扩增条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃
变性 30 s、56 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min，26 个循环；最后 72 ℃延伸 7 min。反应结束后，经
1%琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收 PCR 产物，与 pMD19-T 载体连接转化大肠杆菌 Top10，对 PCR 检测
阳性的克隆进行测序后，选择序列正确的菌液，提取质粒，命名为 CpLEA-T。用 BamHⅠ和 HindⅢ
双酶切 CpLEA-T 质粒和表达载体 pET-32a(+)，分别回收目的片段和线性载体并连接，将连接产物转
化大肠杆菌 Top10，挑选克隆子进行 PCR 检测、酶切验证及测序验证，获得阳性重组克隆即原核表
达载体，并命名为 pET-32a(+)/CpLEA。
1.5 CpLEA 基因在大肠杆菌中的诱导表达
将鉴定后的 pET-32a(+)/CpLEA 原核表达载体转化大肠杆菌 BL21（DE3），挑取单菌落接种于含
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图 1 蜡梅 CpLEA 基因的 PCR 扩增
Fig. 1 Amplification of CpLEA from Chimonanthus praecox
氨苄青霉素（Amp，50 mg · L-1）的 LB 培养基内，37 ℃振荡过夜培养，摇床转速为 160 r · min-1。
次日以 1︰50 比例接种于含 Amp（50 mg · L-1）的 LB 培养基，继续培养至 OD600 约为 0.4 ~ 0.6 时，
吸出 1 mL 菌液作对照，其余加入 IPTG（终浓度为 1 mol · L-1），在 37 ℃分别诱导 2、4 和 6 h 后，
收集菌液。同时设置 3 个对照：（1）无 IPTG 诱导，大肠杆菌 BL21（DE3）的表达；（2）无 IPTG
诱导，空载 pET32a(+)转化大肠杆菌 BL21（DE3）的表达；（3）IPTG 诱导 6 h，载体 pET32a(+)转
化大肠杆菌 BL21（DE3）的表达。将以上所收集菌液煮沸，用于 SDS-PAGE 凝胶电泳检测。每个
样品的上样量为 10 μL，电泳结束后，考马斯亮蓝染色，最后进行成像分析。
1.6 CpLEA 的实时定量 RT-PCR 检测
取蜡梅成熟种子和同一植株上根、茎、叶；选取处于花期中的无病虫害蜡梅，分别采集处于萌
动期、蕾期、露瓣期、初开期、盛开期和衰败期（Sui et al.，2012）的花蕾或花朵及盛开期全花的
外瓣、中瓣、内瓣、雄蕊和雌蕊；选取长势一致的蜡梅四叶期幼苗分别进行高温（42 ℃）、低温（4
℃）、高盐（1 mol · L-1，NaCl）、干旱（30% PEG6000）和 ABA（50 μmol · L-1）胁迫处理，设置 3
次生物重复，在处理 0、0.25、1、6 和 12 h 时取 3 株幼苗相同部位的嫩叶。采用 SYBRGreen 荧光
染料法，以蜡梅 Actin-b 和 Tublin 作为内参基因（表 1），用 CFX96（Bio-Rad）实时荧光定量 PCR
仪对 CpLEA 在蜡梅不同组织、不同花发育时期以及高盐（NaCl）、干旱（PEG6000）、ABA、高温
（42 ℃）和低温（4 ℃）5 种非生物胁迫下的表达量进行实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR）
分析，根据 SsoFastTM EvaGreen Supermix 试剂盒（美国百乐）说明配制反应体系，每个样品设 3 次
技术重复。体系如下：5 μL SsoFast EvaGreen Supermix，上下游引物（10 μmol · L-1）各 0.5 μL，模
板 0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，总体积 10 μL。反应程序：98 ℃预变性 30 s，95 ℃变性 5 s，59 ℃退火，
延伸 5 s（每次循环后采集荧光），40 个循环；95 ℃变性 10 s，65 ~ 95 ℃做熔解曲线分析，每个循
环增加 0.5 ℃，每个温度停留 5 s。试验数据通过 Bio-Rad ManagerTM（Version 1.1）软件进行分析，
用 2-ΔΔCT 法获得 CpLEA 的相对表达量（Livak & Schmittgen，2001）。

表 1 实时荧光定量引物序列
Table 1 Primer sequences used in real-time quantitative PCR
基因名称 Gene 上游引物（5′–3′）Upstream primer 下游引物（5′–3′）Downstream primer
Actin-b AGGCTAAGATTCAAGACAAGG TTGGTCGCAGCTGATTGCTGTG
Tublin GTGCATCTCTATCCACATCG CAAGCTTCCTTATGCGATCC
CpLEA CAGGAGAAGACGAGTCAGATGGT CCGAGTCCCTTGTAGATTGG
2 结果与分析
2.1 CpLEA 基因的获得及序列分析
随机测序后 EST 分析显示文库相应的克
隆子CH0314的 cDNA片段与编码LEA蛋白基
因的同源性较高，对相应克隆进行测序，获得
了蜡梅 LEA 基因全长序列。进一步以跨 ORF
框的引物进行 PCR 扩增，从 CH0314 质粒 DNA
和蜡梅花 cDNA 中扩增出约 270 bp 的特异产
物，从蜡梅基因组 DNA 中扩增出约 820 bp 的
特异产物（图 1）。
8 期 马 婧等：蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因 CpLEA 的克隆及表达分析 1667

测序分析表明获得的 CH0314 是源于蜡梅晚期胚胎丰富蛋白基因全长 cDNA，该基因全长 573
bp，5′端非编码区（untranslated region，UTR）长 71 bp，3′端 UTR 长 229 bp，且在 3′端 UTR 有典
型的加尾信号和明显的 polyA 结构，含有一个 273 bp 的开放阅读框，编码一个长度为 91 aa 的蛋白
质，将该基因命名为 CpLEA（GenBank accession：JF412788）。进一步比对发现该基因存在两个内含
子，长度分别为 96 bp 和 414 bp，其两端具有内含子典型的 GT-AG 5′和 3′剪切位点（图 2）。



图 2 CpLEA 的 DNA、cDNA 序列及其编码的氨基酸序列
双下划线为起始密码子，单下划线为 CpLEA 蛋白所具有的 11 个氨基酸的基元序列，星号代表终止密码子，
灰色背景为内含子，加尾信号用波浪线表示。
Fig. 2 Nucleotide sequence of genomic DNA，full-length cDNA and the deduced amino acid sequence of CpLEA
The initiation codon ATG and termination codon TGA are double underlined. The consesus 11-mer amino acid repeat characteristic of group 3 LEA
protein are single underlined. The introns are gray background. The polyadenylation signals are wave-underlined.

2.2 CpLEA 编码蛋白序列分析及同源比对
CpLEA 编码蛋白的理论分子量为 9.37 kD，预测等电点为 8.74，该蛋白包含 12 个碱性氨基酸残
基（K、R），10 个酸性氨基酸残基（D、E），22 个疏水氨基酸残基（A、I、L、F、W、V），34 个
极性氨基酸残基（N、C、Q、S、T、Y），符合 LEA 蛋白所具有的亲水性极性氨基酸所占比例较高
这一共同特点，同时该基因编码蛋白还具有 4 个第 3 族 LEA 蛋白所具有的 11 个氨基酸基元序列的
典型特征（图 2）。信号肽预测及跨膜结构分析，该蛋白无明显的信号肽和跨膜结构。亚细胞定位该
蛋白主要分布在细胞质中，可能在其中发挥功能，这一预测结果与已知的其他 LEA 第 3 族蛋白相同。
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利用 SOPMA 程序对 CpLEA 蛋白的二级结构进行预测，结果显示该蛋白的二级结构由 α–螺旋和无
规则卷曲构成，其中 α–螺旋（alapha helix）包括 83 个氨基酸，占总数的 92.22，是主导结构，故
蜡梅 CpLEA 属于全 α 蛋白，符合 Chou 等（1995）研究的 LEA3 蛋白特征结构特点；C 端保守性差，
形成无规则卷曲（random coil），包括 7 个氨基酸，占总数的 7.78%。第 3 族 LEA 蛋白的 α–螺旋和
不规则卷曲可能在高等植物细胞脱水时起到束缚盐离子和水分子的作用。
对已有的植物 LEA 蛋白家族构建邻接树（图 3）进行系统分类，发现蜡梅 CpLEA 蛋白与榛子
（Corylus avellana，CAC39160.1）的第 3 族 LEA 蛋白亲缘关系最近，并与其他已知的植物第 3 族
LEA 蛋白聚在一枝，进一步表明获得 CpLEA 蛋白属于第 3 族 LEA 蛋白亚家族。


图 3 蜡梅 CpLEA 与其他同源蛋白的系统进化分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of CpLEA in Chimonanthus praecox and other homologous proteins

2.3 CpLEA 原核表达载体的构建及诱导表达
将含有CpLEAORF框全长的克隆载体 CpLEA-T 和 pET32a(+)空载体分别用BamHⅠ和 HindⅢ双
酶切，电泳回收约 270 bp 的目的片段和线性原核表达载体，两者用 T4 DNA 聚合连接酶连接构建表
达载体 pET-32a(+)/CpLEA，转化大肠杆菌 DH5α，挑取单克隆，提取质粒，经 PCR 和 BamHⅠ+
HindⅢ双酶切验证，均能得到约 270 bp 的目的条带（图 4），表明成功地构建了原核表达载体
pET-32a(+)/ CpLEA。
将已构建好的 pET-32a(+)/CpLEA 转入大肠杆菌 BL21（DE3），经 IPTG 诱导后，将重组裂解液
进行 SDS-PAGE 电泳，结果显示 CpLEA 融合蛋白在诱导 2 h 后，在总蛋白、上清液以及沉淀中均
可以明显观测到大小为 30 kD 左右的外源蛋白条带，在 6 h 时表达蛋白量达到最大。蜡梅 CpLEA 基
因编码蛋白质的理论分子量为 9.37 kD，而原核表达载体中融合标签的分子量约为 23 kD，由此推算
的融合蛋白分子量约为 32 kD，这与图 5 中显示的结果一致，同时分析含质粒 pET32a(+)的空白对照
菌及未诱导的重组蛋白，在相同位置处没有蛋白表达，说明目的基因在大肠杆菌中得到了高效表达。

8 期 马 婧等：蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因 CpLEA 的克隆及表达分析 1669


图 4 原核表达载体 pET32a(+)/CpLEA 的 PCR（A）及酶切验证（B）
M：DL2000 marker；A1：重组质粒 PCR 检测；A2：阳性对照文库质粒；A3：阴性对照水；B1：重组质粒 pET32a(+)/CpLEA。
Fig. 4 Electrophoresis results of PCR（A）and digestion with restriction enzyme（B）
M：DNA marker；A1：PCR product of recombinant plasmids；A2：Positive control，Plasmid from the cDNA library；
A3：Negative control，ddH2O；B1：Products of recombinant plasmids digested by BamHⅠand HindⅢ.


图 5 CpLEA 融合蛋白诱导表达的 SDS-PAGE 电泳检测
M：低分子量蛋白 marker；1：未诱导 BL21 菌株；2：未诱导 pET32a(+)空载体；3：pET32a(+)空载体诱导。
Fig. 5 SDS-PAGE analysis of expressed product of recombinant pET32a(+)/CpLEA
M：Protein marker（low）；1：BL21 without induction；2：pET32a(+) vector without induction；3：pET32a(+) vector after induction.

2.4 CpLEA 基因的表达分析
CpLEA 的实时荧光定量分析表明，蜡梅 CpLEA 在各个组织中表达水平差异较大，在根中几乎
不表达，在成熟种子中表达量最高，成熟叶片中次之。在盛开期花朵的各个部位中，雄蕊和雌蕊中
的表达量明显高于花瓣，其中又以中瓣表达量最低（图 6）。
进一步检测该基因在蜡梅花朵开放不同阶段的表达量，结果显示在花芽刚刚形成的萌动期和蕾
期表达量较高，在花朵开放期处于较低水平，而在花朵衰败期又显著升高，达到了整个花期的最大
表达量（图 7）。
进一步检测 CpLEA 对 5 种非生物胁迫的响应，结果（图 8）显示：ABA 胁迫处理 0.25 h 后，
CpLEA 被迅速诱导表达，随后表达量逐渐下降，在 12 h 时有小幅上升；在高盐胁迫下，CpLEA 同
样在最初的 0.25 h 被迅速诱导，随后出现波动性变化，在处理 6 h 后表达量达到最高；干旱 PEG6000
处理 0.25 h 后，CpLEA 表达量升高，在 1 h 时有所下降，但随后逐渐升高，在处理 12 h 后达到最大；
在低温处理后，CpLEA 表达量在处理 0.25 h 后开始持续升高，在 12 h 达到对照的 31.05 倍；与此相
比，CpLEA 能够对高温产生迅速响应，在处理的 0.25 h 后迅速升高，达到最大，随后下降。
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图 7 CpLEA 在不同花发育时期的表达分析
1. 萌动期；2. 花蕾期；3. 露瓣期；4. 初开期；
5. 盛开期；6. 衰败期。
Fig. 7 Expression analysis of CpLEA during flower stage
1. Sprout period；2. Flower-bud period；3. Display-petal period；
4. Initiating bloom period；5. Bloom period；
6. Wither period.
图 6 CpLEA 在不同组织中的表达分析
1. 种子；2. 根；3. 茎；4. 子叶；5. 幼叶；6. 成熟叶；7. 外瓣；
8. 中瓣；9. 内瓣；10. 雄蕊；11. 雌蕊。
Fig. 6 Expression analysis of CpLEA in various tissues
1. Seed；2. Root；3. Stem；4. Cotyledon；5. Young leaf；6. Matrure
leaf；7. External petal；8. Middle petal；9. Inner petal；
10. Stamen petal；11. Pistil petal.
图 8 不同非生物胁迫胁迫下 CpLEA 的表达分析
Fig. 8 Expression analysis of CpLEA in different stresses
3 讨论
第 3 族 LEA 蛋白（LEA3）是胚胎晚期丰富蛋白中分布较为广泛的一组，它的基本特征是含有
11 个氨基酸串联重复的基元序列，可以形成 α–螺旋结构，在干旱胁迫的环境中保护生物大分子，
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减轻水分胁迫对植物造成的伤害，与植物抗逆性密切相关（汤晓倩 等，2010）。研究发现，不同物
种的该组 LEA 蛋白大小差异很大，主要体现在 11 个氨基酸基元序列的重复次数有较大差异，例如：
棉花 D7 蛋白重复次数较少只有 5 次（Dure et al.，1981）；而大豆 pGmPM8 含有的串联基元序列则
超过 30 个（Hsing et al.，1995），前人研究推测，这种在蛋白结构以及保守基元序列数量上的差异
可能是造成植物抗旱能力不同的原因（钱刚 等，2007）。本研究中对获得的 1 个蜡梅 CpLEA 基因的
编码蛋白进行生物信息学分析，发现该基因包含一个 273 bp 的 ORF 框，同时含有两个内含子。Dalal
等（2013）从水稻和高粱中获得的 3 个 LEA3A 基因也具有类似的结构特征。该基因的编码蛋白属
于第 3 族 LEA 蛋白，具有该家族蛋白所具有的基本特征，如该蛋白含有较多的亲水性氨基酸，具有
较强的亲水性，虽然只含有 4 个 11 个氨基酸组成的重复基元序列，但可能通过形成 α–螺旋的主导
结构，在植物细胞脱水时提供疏水区的亲水表面，从而避免干旱胁迫时高浓度的离子积累损伤细胞，
同时也保护细胞不受高渗透压的损害。在大肠杆菌中原核表达 CpLEA 基因，在 IPTG 诱导 2 h 后即
在上清中表达可溶性蛋白，该融合蛋白的大小与预期值一致，这为后期研究蜡梅 CpLEA 蛋白的体
外活性及转化菌株的抗逆性研究提供了试验材料。
蜡梅 CpLEA 基因在组织器官的表达没有明显的特异性，除在根中未检测到该基因的表达外，在
其他组织器官中均有表达，其中在成熟的种子中表达量最高，这与 LEA 蛋白在植物种子成熟阶段大
量积累的特定表达模式相一致。此外，在营养器官成熟叶片中也具有较高的表达量，表明该基因可
能在叶片形态建成和抗逆性形成方面发挥了一定的功能。前人的研究也表明 LEA3 基因无组织表达
特异性，除了在种子的子叶、胚轴中表达外，也在茎、根和叶中表达（Bray，1993；赵咏梅 等，2006），
未见有关该基因在生殖器官花朵中表达模式的报道。本研究的结果表明蜡梅 CpLEA 基因在雄蕊和雌
蕊中表达量明显高于花瓣，在蜡梅花发育不同阶段其表达呈现出“两头高，中间低”的特点，即花
芽分化的早期和花朵衰败期表达量最高，表明该基因可能参与蜡梅花早期发育和花器官衰老的过程，
并在雄蕊雌蕊的形成中扮演一定的角色。
大量研究表明第 3 族 LEA 蛋白不仅可增强植物抵御干旱胁迫的能力，而且低温、盐胁迫也可使
第 3 族 LEA 基因表达及 LEA 蛋白积累。俞嘉宁等（2004）分析了 3 个小麦第 3 族 LEA 基因的表达
情况，发现干旱、ABA、NaCl、冷处理均可诱导该基因表达；Dalal 等（2013）研究表明高粱中的 3
个 LEA3 基因，均可被 ABA 和干旱胁迫诱导表达，但对低温均无响应；而 Ndong 等（2002）在小
麦和黑麦中克隆得到的 LEA3-L2 基因却能够在低温处理下大量表达，并且在抗寒品种的表达量高于
普通品种，这些结果表明该族不同成员在参与植物非生物胁迫响应过程中发挥不同的功能。对蜡梅
幼苗进行了多种胁迫处理，结果表明 CpLEA 能对多种胁迫产生快速响应。前人研究表明 LEA 基因
的诱导分为 ABA 依赖型，ABA 诱导型和非 ABA 应答型 3 种，前两种类型都需要内源或外源施以
ABA 才能表达，而第 3 种类型基因在冷或干旱条件下的表达不需要 ABA，但当有外源 ABA 处理时
也会产生响应，如 rd29 基因（张林生和赵文明，2003）。本研究中 CpLEA 基因不仅能被外源 ABA
诱导表达，而且能够被干旱、高盐、低温胁迫诱导表达，可能属于非 ABA 应答型基因，参与了多
种非生物胁迫响应。此外，自然生长状态下，蜡梅花发育早期刚刚进入气温骤变，低温少雨的初冬，
低温的诱导是蜡梅开花冬训、花芽打破休眠的主要因素，这也解释了在花发育早期，该基因的表达
量高于其他时期这一现象产生的原因。

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