全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（2）：273–280 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–09–02；修回日期：2011–12–02
基金项目：国家‘十二五’科技支撑计划项目（2011BAD12B03）；辽宁省重大科技攻关项目（2010215003）；国家现代农业产业体系建
设专项（Nycytx-35-gw23）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：tianlaili2008@126.com）
钙素对 SA 诱导番茄幼苗抗灰霉病的调控作用
李琳琳，李天来*，余朝阁，张抗抗
（沈阳农业大学园艺学院，设施园艺省部共建教育部重点实验室，辽宁省设施园艺重点实验室，沈阳 110866）
摘 要：为探索钙对水杨酸（SA）诱导番茄（Solanum lycopersicum）幼苗抗灰霉病的作用，采用‘L402’
番茄品种，通过分别喷施 8 mmol · L-1 CaCl2 和 5 mmol · L-1 EGTA 后再喷施 2 mmol · L-1 SA，3 d 后接种灰
霉病菌孢子的方法，研究了不同处理对番茄幼苗灰霉病病情指数、活性氧积累、主要防御酶活性及其基
因表达的影响。结果表明：接种灰霉病菌孢子 5 d 后，SA 处理的番茄幼苗病情指数比对照降低 37.27%，
Ca + SA 处理较 SA 处理进一步降低 18%；接种 1 d 和 2 d 后，叶片中产生速率和 H2O2 含量分别出现应
激高峰，且处理间存在差异，与对照相比 Ca + SA 处理分别提高 33.05%和 29.31%，EGTA + SA 处理分别
降低 32.62%和 46.34%；叶片中抗病相关酶活性和基因表达在接种病菌后也出现应激高峰，其中 Ca + SA
处理显著提高了 PAL、几丁质酶、β–1,3–葡聚糖酶活性，EGTA 处理及 EGTA + SA 处理显著降低了 PAL、
几丁质酶、β–1,3–葡聚糖酶活性。上述结果表明，Ca2+在 SA 诱导番茄抗灰霉病中具有正调控作用，而
且这种作用与 PAL、几丁质酶、β–1,3–葡聚糖酶活性及其基因表达密切相关。
关键词：番茄；灰霉病；钙；水杨酸；诱导抗病性；调控
中图分类号：S 641.2；S 436.412.1+3 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）02-0273-08
The Effect of Calcium on Regulation of SA-induced Resistance to Botrytis
cinerea in Tomato
LI Lin-lin，LI Tian-lai*，YU Chao-ge，and ZHANG Kang-kang
（College of Horticulture，Shenyang Agricultural University，Key Laboratory of Protected Horticulture Liaoning
Provincial，Key Laboratory of Protected Horticulture，Ministry of Education，Shenyang 110866，China）
Abstract：In order to explore the effect of calcium on the SA-induced resistance to Botrytis cinerea in
tomato（Solanum lycopersicum）. Tomato Botrytis cinerea susceptible strain‘L402’was pretreated with
foliar spraying 8 mmol · L-1 CaCl2 and 5 mmol · L-1 EGTA，respectively. Then followed by application of
exogenous 2 mmol · L-1 SA，3 d before B. cinerea infection. The disease index，ROS accumulation，
variations of the activities of main resistance enzymes and their gene expression were analyzed. The results
show that the disease index is significantly reduced by 37.27% compared to control in SA treatment 5 d
after B. cinerea infection；While in Ca + SA treatment，the disease index reduced by 18% compared to SA
treatment. The production rate and H2O2 content reached the highest level at 1 d and 2 d，respectively，
there is difference among treatments：production rate of and H2O2 content in tomatoes treated by Ca +
SA are 33.05% and 29.31% higher than control（H2O），however，under EGTA + SA treatment significantly
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reduced by 32.62% and 46.34%，respectively. The peak of disease defense-related enzymes activity and
gene expression also exist，difference obtained among treatments：PAL，chintase and β-1,3-glucancse
treated by Ca + SA are significantly higher than control，whereas EGTA and EGTA + SA significantly
suppress PAL，chitinase，β-1,3-glucanase activity. These results indicate that Ca2+ plays a positive
regulatory role in the SA-induced resistance to Botrytis cinerea in tomato，which is closely related to the
PAL，chitinase，β-1,3-glucanase activity and gene expression.
Key words：tomato；Botrytis cinerea；calcium；salicylic acid；induce resistance；regulation
植物在与病虫害长期的协同进化过程中形成了至少两套抵御病虫害的体系，分别为直接防御体
系（PAPMS）和间接防御体系（NB-LRR）（Jones & Dangl，2006）。这些防御体系又可被水杨酸（SA）、
茉莉酸（JA）、乙烯（ETH）、紫外光等所激活（Klessig & Malamy，1994；María et al.，2005；van Loon
et al.，2006；Griebel et al.，2008），即产生诱导抗性（van Loon et al.，1999）。
SA被认为是激活植株防御系统的标志性物质（Hayat et al.，2007）。SA预处理可以增强植物多
种防卫反应，包括活性氧自由基爆发、细胞壁增厚、病程相关蛋白等小分子抗菌蛋白产生等，从而
提高植物的抗病性。如何将SA的生物学特性扩大化，以达到在生物胁迫领域中的应用，是科学研究
工作者关注的重要问题之一（Vlot et al.，2009）。另一方面，一些研究已表明植物与病原物相互作用
过程中细胞内钙离子的短暂升高是产生系统或局部抗性的早期事件（Nürnberger et al.，2004）；而且
在烟草细胞悬浮培养中钙螯合剂EGTA则可明显抑制吸收SA的细胞再向培养基中排泄SA，说明SA
排泄模式是Ca2+依赖型的（Chen，2001），加大欧芹细胞悬浮培养中SA浓度则增加了细胞液中Ca2+
的浓度（Kawano et al.，1998）。众多研究已证实Ca2+是SA信号转导的一部分（Yang et al.，2003；
Kim et al.，2009；Boudsocq et al.，2010），而钙螯合剂EGTA则阻碍了SA行使其功能（刘新 等，2003；
刘悦萍 等，2005）。钙和SA在抗病性中可能有重要关系，但钙在SA诱导抗病途经中的具体作用模
式还研究甚少，特别是外部增施钙及钙螯合剂EGTA对SA诱导植物抗病性的影响目前还知之甚少。
本试验中研究了钙、EGTA和SA在灰霉病病原菌侵染条件下对番茄抗灰霉病及超氧自由基、抗
病相关酶及其基因表达的影响，探讨了Ca2+对SA诱导番茄幼苗抗灰霉病的作用，为诱导番茄抗灰霉
病技术在生产中的应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试番茄（Solanum lycopersicum）品种为‘L402’。试验在沈阳农业大学工厂化高效农业工程
技术中心科研基地内进行。2010 年 3 月 5 日在日光温室内进行穴盘基质育苗。待植株长至 3 片真叶
展开时，定植于温度处理室中的 12 cm × 13 cm（直径 × 高）塑料钵内，每个塑料钵内定植 1 株，
定植土的配置比例为：园田土︰草炭︰腐熟猪粪 = 3︰2︰3。温度处理室由自动控温系统 G IC-Ⅲ型温
室环境智能化控制器（沈阳农业大学工厂化农业中心研制）按白天 25 ℃、夜间 15 ℃调控温度；采
用自然光照；控制器控制排风扇实时调节湿度，相对湿度为 60% ~ 70%。其它按照常规管理。
1.2 处理
当番茄幼苗长至 5 片真叶展开时进行处理。根据预试验结果确定本试验共设 6 个处理及其处理
浓度，即以喷施蒸馏水为对照（H2O），以分别喷施 8 mmol · L-1 CaCl2（简称 Ca）、2 mmol · L-1 SA
2 期 李琳琳等：钙素对 SA 诱导番茄幼苗抗灰霉病的调控作用 275
（简称 SA）、5 mmol · L-1 EGTA（简称 EGTA）和分别喷施 8 mmol · L-1 CaCl2、5 mmol · L-1 EGTA
后再各喷施 2 mmol · L-1 的 SA（分别简称 Ca + SA 和 EGTA + SA）为处理，药品均为国药分析纯。
各处理均在叶面喷施处理 3 d 后接种灰霉菌，每处理 25 株。供试番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）
由辽宁省农业科学院蔬菜研究所提供，菌株活化后进行致病性测试，确认良性反应后按常规方法进
行病菌培养，并采用孢子悬液接种法，镜检调整孢子悬液浓度为 106 个 · mL-1，孢子悬液均匀喷施
叶片背面，直到滴水为止。接种前 24 h 保持湿度 90%以上，接种后 48 h 内保持湿度达 100%，温度
为 25 ℃/15 ℃。
1.3 抗灰霉病的调查及相关物质分析
各处理均在接种灰霉菌后 5 d 调查发病情况，计算病情指数。病害分级参照方中达（1998）的
方法。各处理分别于病菌接种当天（记作 0 d）及接种后 1、2、3、4、5 d 挑选整齐一致植株，取第
3、4 片叶在液氮中速冻，用于抗灰霉病相关物质分析，单株取样，3 次重复。
超氧阴离子（）产生速率、过氧化氢（H2O2）含量的测定参照 Patterson 等（1984）的方法略
有改进。
苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活性测定：取 0.5 g 叶片加 5 mL 0.1 mol · L-1 的硼酸—硼砂缓冲液
（pH 8.8），充分研磨，于 4 ℃ 12 000 g 离心 30 min，上清液为酶粗提液，以 37 ℃保温前后每小时
酶促反应产物反式肉桂酸生成量来表示 PAL 酶活。
β–1,3–葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）、几丁质酶（chitinase）活性测定根据 Mauch 等（1987）
和 Boller 等（1983）的方法略有改进。取 0.5 g 叶片加 5 mL 0.1 mol · L-1 的乙酸—乙酸钠缓冲液研磨、
离心提取粗酶液。在波长 585 nm 处比色测定 N–乙酰葡萄糖胺量，以每秒分解胶状几丁质产生 1 ×
10-9 mol N–乙酰葡萄糖胺量为一个酶活力单位（U），单位为 U · mg-1 protein。β–1,3–葡聚糖酶活
性利用 DNS 试剂测定以生成还原糖的量来表示，单位为 U · mg-1 protein。蛋白质含量测定采用
Bradford（1976）的方法，用考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白含量，以牛血清蛋白为标准蛋白。
1.4 抗灰霉病相关蛋白基因表达分析
根据 SGN 和 NCBI 上已公布的番茄病程相关蛋白 1（PR1）、β–1,3–葡聚糖酶基因（GLU）、
几丁质酶基因（CHI）和内参基因（Actin）基因片段的序列，使用 primer 5.0 软件进行特异引物设
计，使用TianGen RNA提取试剂盒提取番茄叶片 RNA，使用TaKaRa PrimeScript Reverse Transcriptase
反转录合成 cDNA 第一链。根据 Jain 等（2006）的方法采用实时荧光定量（qRT-PCR）进行表达量
分析。
采用 Original 7.5 进行数据处理，DPS 软件进行统计分析，差异显著性比较使用 Duncan’s 新复
极差法。
表 1 实时荧光定量 PCR 引物
Table 1 The primer of quantitative real time PCR
基因
Gene
登录号
Accession No.
引物（5′–3′）
Primer
大小/bp
Size
PR1 SGN-U579545 F 5′-GGAAACTTCACTGGCAGACGTC-3′
R 5′-GTGTCTCTGAAACTTGTCGACC-3′
253
GLU SGN-U581016 F 5′-ACAGAATTGTTGACGGGTGA-3′
R 5′-CCATTCCAGCTCTTCAGACA-3′
305
CHI SGN-U579551 F 5′-TGGTATGGCGTAAGTCGGTA-3′
R 5′-CTTGGAATCAAAGTCCGGTT-3′
268
Actin Q96483 F 5′-TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC-3′
R 5′-AGTTAAATCACGACCAGCAAGAT-3′
212
276 园 艺 学 报 39 卷
表 2 不同处理下番茄幼苗接种灰霉菌的病情指数和抗性类别
Table 2 The disease index and resistance category under
different treatments inoculated with Botrytis cinerea
注：不同字母表示经 Duncan’s 多重比较分析差异显著，P ≤ 0.05。
Note：Different letters show significant difference at P ≤ 0.05 by
Duncan’s multiple range tests.
2 结果与分析
2.1 钙素对 SA 诱导番茄幼苗抗灰霉病的影响
如表 2 所示，与对照相比，SA 可诱导番茄
降低灰霉病病情指数达 37.27%；虽然单一增施
Ca2+处理的番茄幼苗抗灰霉病与对照无显著差
异，但 Ca2+进一步增强 SA 诱导的抗病程度，即
与 SA 处理相比，Ca + SA 处理进一步降低了植株
病情指数达 18%；缺钙处理不仅提高了番茄的灰
霉病病情指数，而且显著抑制了 SA 诱导的抗病
作用，导致 EGTA + SA 处理的番茄灰霉病病情指
数与对照无显著差异。这说明 SA 激活植物抗病
防御系统，可能要求钙素的积累。
2.2 钙素对 SA 诱导番茄幼苗抗灰霉病相关物质积累的影响
2.2.1 对超氧阴离子（）和过氧化氢（H2O2）积累的影响
从图 1 中可以看出，番茄幼苗接种灰霉病菌 1 d 后剧增，不同处理植株变化趋势基本一致，
呈现急剧升高而后缓慢下降的趋势。与对照相比，Ca 处理抑制了产生速率，在接种后 1 d 时为对
照的 85%，之后与对照无显著差异；EGTA、EGTA + SA 处理在接种后 1 d 比对照降低了 49.46%和
32.62%；而 Ca + SA 和 SA 处理后高于对照，二者之间没有显著差别。
对照植株叶片中 H2O2 含量在接种灰霉病菌 1 d 后迅速升高，2 d 达到最高水平，Ca 处理与对照
没有显著差异，但 EGTA 和 EGTA + SA 处理后显著低于对照，在接种 2 d 时 EGTA + SA 处理比对
照降低了 46.34%。Ca + SA 和 SA 处理与对照趋势基本一致，但均高于对照，接种 2 d 时二者比对照
分别增加了 29.31%和 17.14%，其中 Ca 进一步提高了 SA 诱导的 H2O2含量达 12.11%（图 1）。
图 1 番茄幼苗不同处理后接种灰霉菌超氧阴离子产生速率（）和过氧化氢（H2O2）含量的变化
Fig. 1 Changes of production rate of and H2O2 content under different treatments inoculated with Botrytis cinerea
2.2.2 对抗灰霉病相关酶活性的影响
从图 2 中可以看出，Ca 处理的幼苗的 PAL 活性与对照基本一致，于接种后 1 d 达到高峰，而
EGTA 和 EGTA + SA 处理 PAL 活性受抑制分别比对照低 52.44%和 38.28%，二者延迟到 2 d 后才出
现高峰；Ca + SA 和 SA 处理极显著高于对照 47.03%和 39.61%，其中 Ca + SA 处理最高。
各处理下几丁质酶活性和 β–1,3–葡聚糖酶活性（图 2）在接种后 2 d 均迅速升高；其中 Ca + SA
处理
Treatment
病情指数
Disease index
抗性类别
Resistance category
H2O（对照 Control） 74.85 b 感病 Susceptible
Ca 70.33 b 感病 Susceptible
EGTA 82.90 a 高感 High susceptible
SA 46.95 c 中抗 Moderate resistance
Ca + SA 38.53 d 抗病 Resistance
EGTA + SA 70.31 b 感病 Susceptible
2 期 李琳琳等：钙素对 SA 诱导番茄幼苗抗灰霉病的调控作用 277
处理除在接种 2 d 时几丁质酶活性低于 SA 处理外，两种酶活性均高于其他处理，在接种后 2 d 时分
别比对照高 45.60%和 19%；EGTA 和 EGTA + SA 处理的相应酶活性均显著降低，接种后 2 d 仅为对
照的 70%。其中 EGTA 处理后施用 SA 可缓解几丁质酶活性下降，而 EGTA 处理后的 3 种酶的活性
最低，说明 Ca 和 SA 处理均具有提高几丁质酶和 β–1,3–葡聚糖酶活性的作用，在 Ca 基础上增施
SA 进一步提高了二者的活性。
图 2 番茄幼苗不同处理接种灰霉菌后 PAL、几丁质酶和 β–1,3–葡聚糖酶活性的变化
Fig. 2 Changes of the activity of PAL，chintase，β-1,3-glucancse under different treatments inoculated
with Botrytis cinerea
2.3 对抗灰霉病相关蛋白基因表达的影响
从图 3 的 qRT-PCR 分析中可以看出，几丁质酶基因（CHI）和 β–1,3–葡聚糖酶基因（GLU）
图 3 番茄幼苗不同处理接种灰霉病菌后 PR1、几丁质酶和 β–1,3–葡聚糖酶基因表达的变化
Fig. 3 Changes of PR1，chintase，β-1,3-glucancse relative mRNA levels under different treatments inoculated with Botrytis cinerea
278 园 艺 学 报 39 卷
的表达与病程相关蛋白基因（PR1）表达趋势类似，Ca + SA 与 SA 处理表现为在接种后 1 d 和 2 d
的表达量最高，显著高于对照，而 EGTA 处理则低于其他处理。3 种基因的表达水平存在一定差
异，其中 Ca + SA 处理 PR1 表达水平除在接种后 2 d 低于 SA 处理外，均高于其他处理，为对照的
3 ~ 6 倍，PR1 较其他两个基因表达量最高。其次为 GLU，其中除接种后 3 d SA 与 Ca + SA 两个处
理的 GLU 表达水平与其他处理无显著差异外，均显著高于其他处理，且为对照的 1.2 ~ 2.3 倍。表
达量最低的是 CHI 仅为对照的 1 ~ 2.2 倍，CHI 的表达模式与 PR1 基本一致。EGTA 和 EGTA + SA
处理各基因表达量为对照的 70%左右。CHI 和 GLU 基因转录水平与几丁质酶和 β–1,3–葡聚糖酶
活性变化趋势基本一致。因此，不同处理促进 CHI 和 GLU 基因表达与番茄幼苗抗病性的提高有密
切关系。
3 讨论
已有研究表明 Ca2+及 SA 均能诱导果蔬产生抗病反应（Gaffney et al.，1993；Wisniewski et al.，
1995；Peng et al.，1999；杜妍妍 等，2008）。本试验表明，Ca2+及 Ca2+螯合剂 EGTA 对 SA 诱导番
茄幼苗抗灰霉病具有不同作用（表 2），钙螯合剂 EGTA 和 EGTA + SA 处理显著提高了番茄灰霉病
的病情指数。单独施用 Ca2+虽也可一定程度降低幼苗的病情指数，但未达到显著水平。表明 Ca2+自
身诱导抗病的作用不强，Ca + SA 处理较 SA 处理进一步显著降低了病情指数，说明 SA 诱导的抗病
反应需要 Ca2+的参与。许多研究表明，钙在 SA 调控作用中发挥重要的作用，杜妍妍等（2008）发
现，SA 处理后再增施 Ca2+，可进一步促进番茄植株生长。刘悦萍等（2005）研究认为钙促进了 SA
诱导葡萄耐热性。在烟草悬浮细胞中 EGTA 可明显抑制 SA 的排泄，说明 SA 的排泄模式需要 Ca2+
调控（Chen et al.，2001）；在气孔关闭的研究中发现 Ca2+促进 SA 诱导气孔关闭，而使用钙螯合剂
BAPTA 后 SA 则不能诱导气孔关闭；钙通道阻滞剂硝苯吡啶（NIF）减弱了 SA 诱导的气孔关闭，
证明 Ca2+积极调控 SA 诱导的气孔关闭（刘新 等，2003）。Du 等（2009）人研究发现在拟南芥中
Ca2+/CaM 结合转录因子 SR1 调控 SA 介导的抗病反应。
活性氧是动植物细胞应答各种逆境产生的重要的信号分子（Dypbukt et al.，1994；Lamb & Dixon
1997）。H2O2 含量增加可增强细胞壁，促进植物抗毒素产生（Dempscy & Klessig，1995），也可直接
杀死病原菌产生过敏性坏死（HR），诱导抗病相关酶及病程相关蛋白基因 PR1 的表达，产生抗病反
应（Chen et al.，1995；Kwak et al.，2003）。本试验中发现 Ca + SA 处理较 SA 处理显著提高了产
生速率和 H2O2 含量，而 EGTA 和 EGTA + SA 处理显著抑制了二者，说明 SA 诱导的活性氧自由基
爆发依赖于 Ca2+的参与。
钙促进了 SA 诱导的活性氧自由基爆发，同时也影响了病程相关蛋白酶活性及基因表达。单独
施用 Ca2+酶活性及基因表达与对照相比没有极显著的差异（图 2，图 3），Ca2+也没有提高产生速
率和 H2O2 含量；Ca2+却显著提高了 SA 诱导的了产生速率和 H2O2 含量，酶活性及基因转录水平。
相关研究表明，H2O2 持续的诱导 PR1 基因表达，但在 NahG 突变体中（不积累 SA）这种诱导作用
被消除，说明 H2O2 提高拟南芥抗病性并位于 SA 下游起作用（van Camp et al.，1998）；采用 SA 处
理番茄叶片可以促进 H2O2 的积累（Peng et al.，2004），这与 Rao 等（1997）和 Agarwal 等（2005）
在不同作物中研究结果一致。近年来，在拟南芥中研究发现 H2O2 的产生需要持续的 Ca2+流入（Lamb
& Dixon，1997；Yang & Poovaiah，2002）。Pei 等 2000 年在研究拟南芥中发现，Ca2+螯合剂 EGTA
延迟了内源 H2O2 的产生（Pei et al.，2000）。本试验中也发现 Ca2+处理没有显著提高产生速率和
H2O2 含量；但 Ca2+却显著提高了 SA 诱导的产生速率和 H2O2 含量。由此推测，活性氧自由基爆
2 期 李琳琳等：钙素对 SA 诱导番茄幼苗抗灰霉病的调控作用 279
发可能是作为第二信号分子使细胞内氧化还原态发生改变，而后促进病程相关蛋白的酶活性及其基
因的转录水平，诱导植物产生抗病反应。正如本试验结果显示 Ca + SA 处理 β–1,3–葡聚糖酶和几
丁质酶活性和对应基因 CHI 和 GLU 表达水平较其他处理有显著提高。这些表明 SA 诱导的活性氧自
由基爆发是受 Ca2+调控的，而活性氧自由基爆发又促进抗病相关酶及基因表达。
综上所述，单独施用 SA 降低了番茄幼苗灰霉病的病情指数、提高了抗病相关信号物质积累和
相关酶活性及其基因表达水平；配合施钙进一步降低了 SA 诱导番茄幼苗的病情指数并提高了相关
指标；而钙抑制剂 EGTA 和 EGTA + SA 处理则产生相反作用，这可能是由于 Ca2+调控了 SA 诱导的
防卫机制，促进了活性氧自由基爆发，从而增强了抗病相关酶活性和基因表达，最终表现出 Ca2+促
进了 SA 诱导降低番茄灰霉病病情指数的结果。但有关 Ca2+作用在 SA 信号转导途径中的具体位置、
调控模式等方面还需进一步深入研究。
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