全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（8）：1583–1590 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–05–19；修回日期：2014–07–22
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-25-A-02）；武汉市应用基础研究项目（2014020101010070，
2013021702010584）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zbye@mail.hzau.edu.cn）
番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty-1 的双重 SNP 标记
的开发
葛乃蓬，崔 龙，李汉霞，叶志彪*
（华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070）
摘 要：本试验旨在开发一种新的设计共显性 SNP 标记的方法，以提高 SNP 标记检验的效率，并将
其成功应用于番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty-1 的 SNP 标记开发中，提高了种质资源鉴定和育种分离世代材
料筛选的效率。通过对抗病基因 Ty-1 和等位感病基因 ty-1 的 cDNA 序列进行比对，挑选了两个稳定扩增
的多元非同义突变位点，分别用来设计 Ty-1 和 ty-1 的 SNP 标记 NL3 和 NL2，将两个标记进行混合得到
双重 SNP 标记 NL2-3。通过用 NL2-3 检验已知的抗病和感病番茄材料，验证了其多态性和稳定性。并用
NL2-3 对抗感病材料的 F3 代杂交分离群体和普通自交系进行了 Ty-1 的筛选，并经过田间观察进一步验证
了该标记的可靠性。此方法开发得到的双重 SNP 标记只需要进行一次 PCR 反应和一次凝胶电泳就可以区
分纯合抗、杂合抗、纯合感 3 种基因型，提高了育种选择的效率。
关键词：番茄；抗番茄黄化曲叶病基因；双重 SNP 标记
中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）08-1583-08

Double SNP Marker of Ty-1 Alleles in a Co-dominant Manner in Tomato
GE Nai-peng，CUI Long，LI Han-xia，and YE Zhi-biao*
（Key Laboratory of Horticultural Plant Biology，Ministry of Education，Huazhong Agricultural University，Wuhan
430070，China）
Abstract：In this research，a novel method to develop co-dominant SNP markers which was called
double SNP markers was developed. This new approach was used to obtain a double SNP marker named
NL2-3 of Ty-1 gene resistant to TYLCV（Tomato yellow leaf curl virus）in tomato. The process of
developing the NL2-3 double SNP marker included two main steps：Design specific primer pairs of
resistant and susceptible genes individually based on two ideal SNP sites and mix the two specific primer
pairs in one PCR reaction system with a proper ratio. With SNP marker NL2-3，we identified 5 resistant
and 7 susceptible inbred lines and 3 homozygous Ty-1/Ty-1 resistant individuals，11 heterozygous Ty-1/ty-1
ones and 2 homozygous ty-1/ty-1 susceptible lines from F3 segregation population. This result was
consistent with the field inoculation assay. We concluded that as the first double SNP marker of Ty-1 gene，
NL2-3 can be directly applied to marker-assisted selection and would speed up the screening of

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resistant breeding and cultivar evaluation.
Key words：tomato；Ty-1；double-SNP marker

近几年，由番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）引起的番茄黄化曲叶病
已成为全世界番茄生产上危害最严重的病害之一（Jones，2009）。培育抗病新品种是防治此病的根
本途径（Abdelbacki et al.，2010）。已经从野生番茄中定位到了 5 个抗性基因：Ty-1、Ty-2、Ty-3、
Ty-4 和 Ty-5（Zamir et al.，1994；Hanson et al.，2000，2006；Ji et al.，2008，2009a，2009b；Anbinder
et al.，2009；Hutton et al.，2012；Verlaan et al.，2013），目前番茄抗病育种主要是用 Ty-1 及 Ty-3 作
为主抗病基因源。Ty-1 和 Ty-3 为等位基因，且基因序列已被克隆（Verlaan et al.，2013），这为基因
标记辅助育种奠定了基础。
单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指群体基因组 DNA 序列中单核苷
酸的变化，包括单核苷酸的颠换、置换、插入和缺失，单核苷酸的多态性可以是二元、三元和四元
的（Wang et al.，1998）。根据已知基因序列，利用 SNP 位点可以开发出有效的基因标记，与其它分
子标记相比，SNP 基因标记不会出现标记和目的基因的分离，遗传稳定性高，便于检测。目前开发
SNP 基因标记过程中应用最广泛的分型技术是等位基因特异 PCR 技术（Allele Specific PCR，
AS-PCR），主要是指巢式 PCR 和扩增耐突变系统（Amplification Refractory Mutation System，
ARMS-PCR）。
等位基因特异 PCR 技术（AS-PCR）的基本原理是根据一个 SNP 位点设计特异引物，特异引物
链的3′末端与SNP位点一种碱基类型相同或互补，另一条引物链按照正常引物设计的方法设计即可。
特异引物只在一种基因型中有扩增的产物，在另一种基因型中没有。因此通过两次 PCR 反应和一次
凝胶电泳显示扩增产物的有无，确定 SNP 基因型（Drenkard et al.，2000）。另外，为了提高引物的
特异性，很多研究者提出在 3′端的第 2 或第 3 位引入错配碱基，该错配碱基与 3′末端的错配碱基共
同作用，大大降低了引物与其 3′末端不互补模板之间的错误延伸，从而提高了 AS-PCR 的准确性
（Newton et al.，1989）。
巢式 PCR 是在设计特异引物的基础上增加 1 条引物链，与普通引物链形成对照，用 3 个引物链
形成的两对引物进行巢式 PCR，提高了引物特异性，减少了假阳性（Soleimani et al.，2003）。
Ye 等（2001）研究的 ARMS-PCR 对巢式 PCR 做了进一步的改进，设计 4 条引物，针对 SNP
位点设计两条延伸方向相反的特异引物，引物的设计遵循 AS-PCR 错配碱基引入的设计方法，另外
两条是外侧的普通链。如此，4 条引物组成 3 对引物对，检测有 3 条带的是杂合型，有两条带的是
纯合型，根据条带的大小可以判定是哪一种纯合型。只需要进行一次 PCR 反应和一次凝胶电泳就可
以区分 3 种基因型。
本研究在 Ye 等（2001）的 SNP 分型技术的基础上做了进一步改进，即选取两个 SNP 位点，分
别设计一对引物，其中一对引物的特异引物链的 3′末端与感病 SNP 位点匹配，另一对引物的特异引
物链的 3′末端与抗病 SNP 位点匹配，引物的设计遵循 AS-PCR 错配碱基引入的方法。为了避免两对
引物之间的干扰，选取的两个 SNP 位点在全基因组上相隔一定的物理距离（NL2 和 NL3 相隔 10 271
bp）。如此，4 条引物组成 3 对引物，由于两个 SNP 位点足够远，非特异的两条引物链组成的引物
对在有限的扩增时间内不能扩增出有效片段。此标记只需 1 次 PCR 反应和 1 次凝胶电泳显示就可
区分 3 种基因型，凝胶电泳检测有两条带的是杂合型，有一条带的是纯合型，根据带的大小可以
判定是哪一种纯合型，和普通 AS-PCR 需要两次 PCR 反应相比，减少了试验步骤，提高了检验效
率。
8 期 葛乃蓬等：番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty-1 的双重 SNP 标记的开发 1585

1 材料与方法
1.1 植物材料
于 2013 年 4 月选用本实验室已知的通过 CAPS 标记（Michelson et al.，1994；Chen et al.，2012）
检验和田间性状观察得到的高世代纯合抗番茄黄化曲叶病毒病材料（H26、H31、H36、H86），杂合
抗病材料（FH20、FH21、FH23、FH24）和感病材料（AC、HG2、HG4、HG61）用于 SNP 分子标
记的开发。
于 2013 年 10 月进行种质资源的筛选与鉴定：对本实验室提供的感病材料 HG61 × 纯合抗病材
料 H86 的 F3 代分离群体和普通自交系材料进行随机 SNP 分型筛选鉴定。
1.2 基因组 DNA（gDNA）的提取与引物设计
取各供试材料单株幼叶，参考 CTAB 法（Roger & Bendich，1988）提取基因组 DNA，用 NanoDrop
2000 测定 OD 值，并将其稀释至工作浓度 300 ~ 500 ng · μL -1。
通过专利（专利公开号为 WO2012125025 A1）找到 Ty-1 及其感病等位基因 ty-1 的 cDNA 序列，
并根据文献（Verlaan et al.，2013）得到其 gDNA 序列及其在全基因组上的位置。用 Primer5.0 软件
设计特异扩增的 PCR 引物，引物由华大基因科技服务有限公司合成。
1.3 PCR 扩增及产物检测
单组引物 PCR 反应体系 20 μL：10× PCR Buffer 2.0 μL，dNTP（10 mmol · μL-1）0.4 μL，正反
引物（100 μmol · L-1）各 0.4 μL，gDNA 模板（300 ~ 500 ng · μL-1）1.0 μL，Taq 酶（5 U · μL-1）0.2 μL，
ddH2O 补足 20 μL。
双重引物 PCR 反应体系 20 μL：10× PCR Buffer 2.0 μL，dNTP（10 mmol · μL-1）0.4 μL，NL2
正反引物（100 μmol · L-1）各 0.4 μL，NL3 正反引物（100 μmol · L-1）各 0.2 μL，gDNA 模板（300 ~
500 ng · μL-1）1.0 μL，Taq 酶（5 U · μL-1）0.2 μL，ddH2O 补足 20 μL。
Buffer、dNTP 和 Taq 酶订购自 Transgene 公司。
PCR 反应程序：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃复性 105 s，进行
35 个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存 10 min。
凝胶电泳检测：PCR 产物用加有 EB（溴化乙锭）的 1%琼脂糖在 100 ~ 120 V 电压条件下电泳
30 ~ 40 min，最终结果在凝胶成像系统上显示。
1.4 苗期抗病性鉴定
在密闭的玻璃温室内种植供试番茄材料，在 3 叶期利用人工释放带番茄烟草花叶病毒的烟粉虱
（浙江大学提供）接种番茄材料，不喷施任何杀虫剂，任其自然发病。接种后定期观察发病情况，
30 d 后，待感病对照材料 AC 完全发病时统计供试各番茄材料的发病情况。
番茄烟草花叶病毒病病害严重度评价标准（Friedmann et al.，1998）：0，植株无任何感病症状；
1，顶端叶尖和叶缘出现轻微的黄化；2，植株上部分叶片的末端出现轻微的黄化和卷曲；3，植株的
叶片大面积变黄，卷曲甚至有杯突出现，同时叶片面积缩小，但植株仍可继续生长；4，植株严重萎
缩，叶片变黄，呈现杯突和卷曲，植株停止生长。
与抗病对照 H26 和 FH20 症状一致的植株记为“抗病”，与感病对照 AC 症状一致的植株记为
“感病”。
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2 结果与分析
2.1 SNP 位点的选取及引物的设计
通过 MultAlin 在线序列对比软件对比 Ty-1 和 ty-1 的 cDNA 序列，发现 20 个非同义 cSNP 位点，
其中 Ty-1 和 ty-1 在 313 和 314 位上的碱基分别为 GT 和 CG，在 1 159 ~ 1 161 上的碱基分别为 GTG
和 ACA（图 1），分别将此二元 SNP 位点和三元 SNP 位点命名为 NL2 和 NL3。


图 1 番茄 Ty-1/ty-1 基因 SNP 位点 NL2 和 NL3
Fig. 1 Ty-1/ty-1 SNP sites NL2 and NL3 of tomato

根据 NL2 和 NL3 设计特异引物（图 2，表 1）。因所选 SNP 位点为多元位点，所以特异引物的
3′末端具有很高的特异性，故没有在 3′末端引入错配碱基。NL2 的特异引物（NL2-F）3′端前两位碱
基与感病基因 ty-1 的互补，NL3 的特异引物（NL3-R）3′端的前 3 位碱基与抗病基因 Ty-1 的互补。
非特异引物 NL2-R 和 NL3-F 则为 ty-1 和 Ty-1 的通用引物。


图 2 NL2 和 NL3 引物对在 ty-1 基因组上的位置
Fig. 2 NL2 and NL3 primer pairs indicated in ty-1 gDNA of tomato


表 1 基于 NL2 和 NL3 两个 SNP 位点的引物设计
Table 1 The specific primers based on SNP sites NL2 and NL3
引物名称
Name of primer
引物序列
Primer sequence
产物长度/bp
Length of PCR product
NL3-F
NL3-R
5′ TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTC 3′
5′ AATGGTGACAGAATCAAGATCCAC 3′
984
NL2-F
NL2-R
5′ AAACGCTCTTCTTCCCCTCG 3′
5′ AGTTAGATTCAGGCTCCTCGCA 3′
1 434

2.2 SNP 标记特异性与稳定性检验
通过对高世代番茄抗病自交系、感病自交系、抗病杂合材料进行特异引物 PCR 扩增，检验引物
NL2、NL3 及双重 PCR 引物对 NL2-3 的特异性与稳定性。
8 期 葛乃蓬等：番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty-1 的双重 SNP 标记的开发 1587

PCR 检验结果如图 3。在 NL2 引物对中扩增出特异条带 1 434 bp 的材料（已知感病材料和杂合
抗病材料），其 NL2 位点含有 CG 碱基序列，即感病等位基因 ty-1。在 NL3 引物对中扩增出特异条
带 984 bp 的材料（已知纯合抗病材料和杂合抗病材料），其 NL3 位点含有 GTG 碱基序列，即抗病
等位基因 Ty-1。在 NL2-3 双重引物 PCR 扩增体系中，能扩增出 1 434 bp 一条特异条带的材料其基
因型为 ty-1/ty-1，能扩增出 984 bp 一条特异条带的材料其基因型为 Ty-1/Ty-1，能扩增出 1 434 bp/984 bp
两条特异条带的材料其基因型为 Ty-1/ty-1。结果表明，特异引物 NL2 和 NL3 具有很好的特异性和
稳定性，双重引物 NL2-3 扩增结果是单引物扩增结果的叠加，且能通过 1 次 PCR 反应和 1 次凝胶
电泳，便能区分供试材料的 3 种基因型。引物 NL2-3 可以用作番茄黄化曲叶病抗病基因 Ty-1 的双重
SNP 标记以辅助田间分子育种和种质资源的筛选。

图 3 引物 NL3、NL2 和 NL2-3 PCR 扩增效果的特异性与稳定性
Fig. 3 Specificity and sensitivity of primers NL3，NL2 and NL2-3

2.3 用于普通自交系和杂交分离世代群体的鉴定
用双重引物 NL2-3 对 12 个番茄育种自交系和 HG61 × H86 的 F3 代分离群里中随机挑选的 16 个
单株进行鉴定，选择含有抗病基因 Ty-1 的单株。如图 4 所示，H86 为已知的抗病纯合对照，HG61
为感病对照，FH20 为抗病杂合对照。自交系材料 4、5、6、7 和 11 号株系为纯合抗病自交系，株系
1、2、3、8、9、10 和 12 号株系为感病自交系。F3 分离材料 13、18、24 号单株为纯合抗病基因型
Ty-1/Ty-1；14、15、17、19、21、22、23、25、26、27 和 28 号单株为杂合抗病基因型 Ty-1/ty-1；16
和 20 号单株为感病基因型 ty-1/ty-1。分子鉴定结果（图 4）与苗期田间自然抗病观察结果（表 2）
相一致。
图 4 双重引物 NL2-3 检测番茄自交系（1 ~ 12）及 F3 分离群体（13 ~ 28）Ty-1 的 SNP 分型
Fig. 4 Assaying SNP genotypes of tomato inbred lines（1–12）and F3 segregation population（13–28）with primer NL2-3

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表 2 番茄自交系及 F3 分离群体抗黄化曲叶病毒病调查结果
Table 2 The tomato inbred lines and F3 segregation population selection of Ty-1 and ty-1
群体
Population
编码
Number
品种或品系
Strain
田间调查
Field survey
分子鉴定
Molecular identification
– H86 抗病 Resistance +/+
– HG61 感病 Sensibility -/-
– FH20 抗病 Resistance +/-
自交系 1 HG22 感病 Sensibility -/-
Inbred lines 2 HG23 感病 Sensibility -/-
3 HG8 感病 Sensibility -/-
4 H35 抗病 Resistance +/+
5 H209 抗病 Resistance +/+
6 H5F 抗病 Resistance +/+
7 H70 抗病 Resistance +/+
8 HG17 感病 Sensibility -/-
9 HG19 感病 Sensibility -/-
10 HG25 感病 Sensibility -/-
11 H10 抗病 Resistance +/+
12 HG64 感病 Sensibility -/-
F3 分离群体 13 GH86-1 抗病 Resistance +/+
F3 segregation 14 GH204-1 抗病 Resistance +/-
15 GH204-2 抗病 Resistance +/-
16 GHG2 感病 Sensibility -/-
17 GH1-10 抗病 Resistance +/-
18 GH26-1 抗病 Resistance +/+
19 GH1-14 抗病 Resistance +/-
20 BHG8 感病 Sensibility -/-
21 BH1-15 抗病 Resistance +/-
22 BH1-16 抗病 Resistance +/-
23 BH1-6 抗病 Resistance +/-
24 BH1-8 抗病 Resistance +/+
25 BH1-17 抗病 Resistance +/-
26 BH1-18 抗病 Resistance +/-
27 BH1-19 抗病 Resistance +/-
28 BH1-7 抗病 Resistance +/-
3 讨论
3.1 双重 SNP 标记开发方法的应用
双重 SNP 标记作为一种新的 SNP 标记开发的方法，不仅可以应用到番茄抗病基因 Ty-1 的 SNP
标记开发过程中，还可以广泛应用到其他抗病基因（如番茄枯萎病抗病基因 I-2，叶霉病抗病基因
Cf-9，烟草花叶病抗病基因 Tm-2a 等以及与其他性状相关基因）的 SNP 标记开发中。
另外，由于此方法需要选取两个具有高度特异性和稳定性的 SNP 位点，如果通过序列比对和筛
选只能得到一个理想的 SNP 位点，那只能考虑使用 ARMS-PCR，巢式 PCR 和普通的 AS-PCR 的开
发方法，如和番茄果皮亮度相关的 SlGDSL2 基因的 SNP 标记的开发（Johann et al.，2013）。
如果选取的两个理想的 SNP 位点在全基因组序列上的物理距离比较近，则可以考虑两个特异引
物共用一个普通的反向或正向引物，即 3 条引物组成两对引物。
8 期 葛乃蓬等：番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty-1 的双重 SNP 标记的开发 1589

3.2 多重 PCR 的影响因素
本试验开发 SNP 标记的方法是在 ARMS-PCR 和多重 PCR 的基础上进行了改进和综合，多重
PCR 是指在一个 PCR 反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个目的片段。本试验中选取了两个
SNP 位点，分别针对抗病突变位点和感病突变位点设计特异引物和普通引物，然后将两对引物在同
一 PCR 体系中反应，即组成双重 PCR 体系。
一个理想的多重 PCR 体系并非单一 PCR 的简单混合，需要针对各引物的量，PCR 循环体系，
PCR 缓冲液成分，dNTP 的用量等进行不断分析和试验。本试验中通过不断调整 NL2 和 NL3 两个引
物对的用量比例及双重 PCR 反应体系的退火温度，发现 NL2︰NL3 的用量为 2︰1，退火温度为 57 ℃
时扩增效果最理想。
另外，两个目的基因的扩增片段长度需要有显著差异，以便进行区分和检测，在本研究中，抗
感病基因的扩增片段长度分别为 984 bp 和 1 434 bp，在凝胶电泳检测时很容易区分。
3.3 番茄抗黄化曲叶病毒病鉴定
目前，番茄抗黄化曲叶病毒病鉴定常用的方法有：烟粉虱接种鉴定（Azizi et al.，2008），农杆
菌侵染克隆鉴定（Picó et al.，2001）；嫁接接种鉴定（Pilowsky & Cohen，1990）及基因枪轰击法鉴
定（Lapidot et al.，2007）。本试验为了使检验环境更接近于自然发病情况，采用了烟粉虱温室接种
鉴定的方法。另外，此方法还适用于大量筛选抗病育种材料。

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