全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（1）：13–22 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–08–03；修回日期：2011–12–05
基金项目：国家‘863’计划项目（2007AA10Z182）；陕西省重点科技专项（2006kz05-G4）
* 同等贡献作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wangyuejin@263.net）
早酥梨抗黑星病相关基因 PbzsREMORIN 的克
隆及功能分析
付镇芳*，姚春潮*，张朝红，王跃进**
（西北农林科技大学园艺学院，农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，西北农林科技大学旱区作
物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100）
摘 要：以高抗黑星病的早酥梨为试材，利用从梨抗黑星病抑制消减文库中筛选出病原菌诱导特异
表达基因片段，通过RACE技术克隆获得其全序列，命名为PbzsREMORIN（GenBank登录号为HQ901373）。
该基因全长 897 bp，开放阅读框（ORF）597 bp，编码 198 个氨基酸；生物信息学分析表明该基因具有 remorin
家族保守结构域；实时荧光定量 RT-PCR 结果表明，该基因受梨黑星病病原菌的诱导；用基因枪法将基因
与 GFP 的融合蛋白转化到洋葱鳞茎表皮细胞中，瞬时表达显示 remorin 蛋白定位于细胞膜、细胞质和细
胞核中；将目的基因转入烟草品种 NC89，共获得 27 个转基因烟草株系；离体叶片接种烟草青枯病病原
菌结果表明，过量表达该基因增强了 NC89 对烟草青枯病病原菌的抗性。该基因可能在植物与病原菌互作
过程中起重要作用。
关键词：梨；黑星病；remorin；基因表达；转基因烟草
中图分类号：S 661.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）01-0013-10

Cloning and Functional Analysis of PbzsREMORIN Gene Related to
Venturia nashicola Resistance in‘Zaosuli’Pear
FU Zhen-fang*，YAO Chun-chao*，ZHANG Chao-hong，and WANG Yue-jin**
（College of Horticulture，Northwest A & F University；Key Laboratory of Horticultural Plant Biology and Germplasm
Innovation in Northwest China，Ministry of Agriculture of China；State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid
Areas，Northwest A & F University，Yangling，Shaanxi 712100，China）
Abstract： A pathogen-inducible expression gene fragment， from a previously constructed
Suppression Subtractive Hybridization（SSH）cDNA library of‘Zaosuli’pear，was selected to obtain the
full length of cDNA by RACE technique. The obtained cDNA，designated PbzsREMORIN，was 897 bp in
length with a 597 bp open reading frame（ORF）and encoded 198 amino acid residues. Bioinformatics
analysis indicated that PbzsREMORIN possesses a conserved domain of remorin family genes. The result
from real-time RT-PCR assay revealed that the target gene was induced by Venturia nashicola. Moreover，
the PbzsREMORIN gene was fused with GFP and transferred into onion epidermal cells via particle
bombardment. Transient expression assay demonstrated that the PbzsREMORIN protein was located in the

14 园 艺 学 报 39 卷
cell membrane，cytoplasm and nucleus. The PbzsREMORIN gene was transferred into Nicotiana tabacum
‘NC89’and totally obtained 27 transgenic lines. Analysis of in-vitro transgenic tobacco leaves with
Ralstonia solanacearum suggested that overexpression of PbzsREMORIN gene in tobacco increased
resistance to R. solanacearum，which indicated that the gene may play a critical role in plant-pathogen
interaction.
Key words：pear；scab；remorin；gene expression；transgenic tobacco

梨（Pyrus spp.）是世界性的重要果树。目前世界上栽培梨树的国家有 76 个，中国梨栽培面积
和产量均居世界首位（赵彩平 等，2005）。在中国北方产区，梨黑星病（Venturia nashicola）、锈病
（Gymnosporangium asiaticum）危害严重（李晓 等，2010；张树军 等，2010）。
remorin 是细胞膜微结构域脂筏中的重要蛋白，最初在马铃薯质膜提纯物中发现，定名为 pp34，
该蛋白与蛋白磷酸化密切相关（Jacinto et al.，1993）。在结构上该蛋白有个保守的 coiled-coild 模体
（Wolf et al.，1997），具有疏水结构域，预测有多种生物功能。第一个被预测结构的 remorin 蛋白来
源于马铃薯叶片的 cDNA 文库，没有检测到信号肽和跨膜结构域（Reymond et al.，1996）；N 端前
50 个氨基酸有 11 个为脯氨酸，这种富含脯氨酸的结构很类似于许多信号蛋白的 SH3 结构域。随着
研究的深入，一些数据表明 remorin 单体蛋白可以形成二聚体、四聚体及更多的聚合状态，多聚化
后可以形成纤维（Bariola et al.，2004），可能在膜骨架及细胞骨架中发挥重要作用。这些结构特性
说明，remorin 有可能在植物抗病过程中发挥作用。
本研究中以早酥梨抗黑星病差减杂交文库中筛选出 894 bp（GenBank 登录号：GR957883）差异
表达基因片段为基础，克隆出该抗病相关基因全长 cDNA，分析其序列特征，基因的进化关系以及
表达特性，通过转化模式植物烟草 NC89 和接种烟草青枯菌进行抗病性研究，明确其在植物抗病过
程中的作用，为进一步进行梨抗病育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2007 年 9 月—2010 年 10 月在西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室进
行。梨黑星病病原菌（V. nashicola）于陕西省彬县果园病果上分离获得。植物材料为 2 年生早酥梨
嫁接苗（砧木为杜梨），栽培于西北农林科技大学新天地梨苗木实验地。
梨黑星病病原菌接种：将梨黑星病病原菌孢子悬浮液均匀喷施在叶龄 30 d 的叶片上，套袋保湿
48 h，于接种后 12 h、1 d、2 d、3 d、5 d 和 7 d 采集叶片，保存于–80 ℃待用。
1.2 采用 RACE 技术克隆抗病相关基因
早酥梨叶片总 RNA 的提取及纯化采用改进的 SDS/酚法（张今今 等，2003）。参考 M-MLV 反
转录酶（TaKaRa，Japan）说明书，以 RNA 为模板反转录合成 cDNA。根据抑制消减杂交文库筛选
得到的片段设计特异引物（GSP），GSP1：5′-ATGTCAAGGGTGGCGATGATACCAAAGC-3′，GSP2：
5′-CTGGAACCTTGTCAACTACGGTGAGAGC-3′。采用 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit
（Clontech，USA）进行 cDNA 第 1 链的合成。以 GSP1、UPM 和 GSP2、UPM 为引物，进行 5′RACE
和 3′RACE 扩增，通过对 PCR 产物回收、连接、转化及克隆、测序，分别得到 PbzsREMORIN 基因
5′端序列和 3′端 cDNA 序列。
1 期 付镇芳等：早酥梨抗黑星病相关基因 PbzsREMORIN 的克隆及功能分析 15

利用 DNAstar 软件将 5′ 端序列和 3′ 端序列拼接得到 PbzsREMORIN 基因全长。
1.3 PbzsREMORIN 基因相关信息学分析
利用 NCBI 中 ORF finder 软件（http：// www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html）进行可读框架
分析；利用 NCBI 的 BLASTP（http：// blast. ncbi. nlm. nih. gov/blastp）进行同源性比对，并进行保
守结构域分析；利用 DNAMAN 软件进行氨基酸同源性分析；利用 ClustalX 2.0 软件比对和 MEGA 4.0
软件分析绘图，构建 PbzsREMORIN 基因的系统进化树。
利用 Protparam（http：// au. expasy. org/tools/protparam. html）预测该蛋白的分子质量、等电点
等理化性质。
利用 InterProScan（http：//www. ebi. ac. uk/InterProScan）进行蛋白质功能结构域分析，联网到
丹麦科技大学生物学序列分析中心（http：// www. cbs. dtu. dk/services/SignalP）对蛋白质序列进行信
号肽分析。
1.4 PbzsREMORIN 基因的表达特性
根据 PbzsREMORIN 基因 cDNA 全长序列设计定量 PCR 引物。上游引物 PR1：5′-GCCCAGAAAG
GCGAAGAACT-3′；下游引物 PR2：5′-AACAAACCGACCCGAACCC-3′。用 EF1 基因（Elongation
Factor 1 alpha，GenBank 登录号 AY338249）作为内参。上游引物序列：5′-GGCTGCTGAGATGAA
CAAGAGG-3′；下游引物序列：5′- AGTGGTAGAGTCAATGATGAGAATGG-3′。
以接种梨黑星病后 0、0.5、1、2、3、5 和 7 d 的叶片材料的 cDNA 为模板，按照 SYBR Green
Real-time PCR Master Mix（TaKaRa，Japan）说明书进行操作，在 IQ 5 real-time PCR Cycler（Bio-Rad
Laboratories，USA）上进行 PCR 反应。
反应程序为：94 ℃ 3 min；40 个循环（94 ℃ 5 s；61 ℃ 30 s）。反应结束后分析荧光值变化
曲线和融解曲线。样本和内参分别设定 3 个重复，以 0 h 不接菌材料作为对照。
1.5 早酥梨 PbzsREMORIN 基因亚细胞定位
用特异引物 PR3：5′-TCTAGAATGGGAGCAACGATGGAAGA-3′（划线部分为 XbaⅠ酶切位点）；
PR4：5′-GGTACCAAAACAACCGAGGAACTT-3′（划线部分为 KpnⅠ酶切位点）扩增 PbzsREMORIN
开放阅读框。PCR 产物经 XbaⅠ和 KpnⅠ双酶切后，连接到 pBI221-GFP 载体，与 GFP 基因的 5′端
融合。然后转入 E. coli TOP10，酶切筛选阳性克隆，并进行测序验证。
TIANprep Mini 质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司）提取质粒。按照 Mare 等（2004）的
方法采用基因枪法将阳性重组质粒导入洋葱鳞茎表皮细胞。暗培养 24 h 后在荧光显微镜下观察，激
发波长为 480 nm。
1.6 早酥梨 PbzsREMORIN 基因转化烟草
用 PbzsREMORIN 基因特异引物 R1：5′-GGATCCATGGGAGCAACGATGGAAGA-3′（划线部分
为 BamHⅠ酶切位点）；R2：5′-GAGCTCTCAAAAACAACCGAGGAACTT-3′（划线部分为 SacⅠ酶
切位点）扩增 PbzsREMORIN 开放阅读框。PCR 产物经 BamHⅠ和 SacⅠ双酶切后，连接到表达载体
pWR306 中。构建过量表达载体 pWR306-PbzsREMORIN，通过农杆菌 GV3101 介导的叶盘转化法转
化烟草品种 NC89（徐伟荣，2005）。抗性苗潮霉素筛选浓度为 25 mg · mL-1，待植株生根后移入温
室培养。
采用改良 CTAB 法提取总 DNA，以载体 pWR306-PbzsREMORIN 的质粒为阳性对照，未转基因
植株为阴性对照，用特异引物 R1 和 R2 扩增目的片段。PCR 条件是：94 ℃ 5 min，30 个循环：94 ℃
16 园 艺 学 报 39 卷
图 1 早酥梨 PbzsREMORIN RACE 扩增
M：DL 2000 marker；1：5′RACE 扩增结果；
2：3′RACE 扩增结果。
Fig. 1 Products of PbzsREMORIN RACE amplification
from‘Zaosuli’pear
M：DL 2000 marker；1：Product of 5′RACE；
2：Product of 3′RACE.
30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；72 ℃ 10 min。
初步鉴定转基因烟草，并在此基础上随机挑出 13 株进行 PCR-Southern 杂交分析。具体步骤按
照 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ（Roche，Switzerland）说明书进行。
1.7 转基因烟草的抗病力鉴定
待烟草在温室生长到 13 ~ 15 叶时，参照 Zhang 等（2009）的方法对离体叶片接种烟草青枯病
病原菌，采用标准平皿法对单位面积叶片中的青枯病病原菌计数，鉴定转基因烟草的抗病力，每个
株系重复 3 次。
2 结果与分析
2.1 早酥梨 PbzsREMORIN 基因的克隆及其序列特征
课题组前期利用抑制消减杂交技术，以抗
病品种早酥梨的叶片构建早酥梨与梨黑星病病
原菌互作的消减文库，在文库中挑取 1 条 894
bp 大小的差异条带，在 NCBI 上进行 BLAST
分析表明，发现该片段与 remorin 基因有很高
的同源性。
以早酥梨叶片 cDNA 为模板，设计特异引
物，进行 5RECE、3RECE 扩增，通过拼接后
获得早酥梨 PbzsREMORIN 基因，其全长为 897
bp（图 1），其中开放阅读框 597 bp，编码 198
个氨基酸。
该基因推导蛋白理论分子量为 21.64775
kD，等电点为 7.101，无信号肽，无跨膜结构
域。
PbzsREMORIN 推导氨基酸序列分析表明，
该基因具有 remorin 家族保守结构域，并与蓖
麻（Ricinus communis）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、番茄（Solanum lycopersicum）
和水稻（Oryza sativa）remorin 亚基同源性分别为 77%、73%、74%、74%和 74%（图 2）。
推测该基因属于 remorin 基因家族，故将该基因命名为 PbzsREMORIN，并在 GenBank 中登录（登
录号：HQ901373）。
早酥梨 remorin 蛋白与其它 85 个物种中 remorin 蛋白构建的系统进化树（图 3）表明，86 个蛋
白明显分成 5 簇（Cluster）。
PbzsREMORIN 属于 ClusterⅠ，参考 Raffaele 等（2007）对 remorin 蛋白的分类，此簇被称为经
典的 remorin 蛋白，N 端有一个富集的脯氨酸，C 端有一个保守的 coiled-coild 模体。在进化关系上，
PbzsREMORIN 与拟南芥 AtREM1.3、AtREM1.4 关系最近。ClusterⅡ为短小的 remorin 蛋白，Cluster
Ⅲ不仅富含脯氨酸而且还有一个丝氨酸富集区，Cluster Ⅳ的 remorin 蛋白变化比较大，功能比较难
预测，ClusterⅤ为长链 remorin。

1 期 付镇芳等：早酥梨抗黑星病相关基因 PbzsREMORIN 的克隆及功能分析 17


图 2 早酥梨 PbzsREMORIN 氨基酸同源性分析
Os：水稻；Pb：早酥梨；Rc：蓖麻；Sl：番茄；Zm：玉米；At：拟南芥。
黑色表示相同的氨基酸残基，灰色表示同源的氨基酸残基。
Fig. 2 Homology analysis of PbzsREMORIN protein from‘Zaosuli’pear
Os：Oryza sativa japonica Group（AAX95710.1）；Pb：Pyrus bretschneideri‘Zaosuli’（HQ901373）；
Rc：Ricinus communis（XP_002511833.1）；Sl：Solanum lycopersicum（AAD28506.1）；
Zm：Zea mays（NP_001159012.1）；At：Arabidopsis thaliana（NP_182106.1）.
Black boxes for the identical residues，and gray
boxes for the similar residue.
图 3 早酥梨 PbzsREMORIN 的系统进化树
Fig. 3 Phylogenic tree of the PbzsREMORIN from‘Zaosuli’pear
18 园 艺 学 报 39 卷
2.2 梨叶片接种黑星病病原菌后 PbzsREMORIN 基因表达分析
实时荧光定量 RT-PCR 结果（图 4）显示，接种黑星病病原菌后感病品种砀山酥梨和抗病品种
早酥梨的叶片 PbzsREMORIN 基因被诱导表达，砀山酥梨叶片中先降低后上升，在第 2 天到达最低
点，而早酥梨叶片接种后第 3 天达到最大值，约为对照的 2.7 倍，两个品种 PbzsREMORIN 基因的
表达基本呈相反趋势。由此可见，在接种黑星病病原菌后 remorin 在抗病过程中发挥着作用。


图 4 梨叶片接种黑星病病原菌后 PbzsREMORIN 基因的表达
A：砀山酥梨；B：早酥梨。
Fig. 4 Expression of PbzsREMORIN in leaves of pear inoculated with Venturia nashicola
A：Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’；
B：Pyrus bretschneideri‘Zaosuli’.

2.3 早酥梨 PbzsREMORIN 基因亚细胞定位
通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的信号，结果显示，转 pBI221-GFP 载体的洋葱细胞内绿色
荧光分布在整个细胞膜、细胞核和细胞质中（图 5，A、B），转 pBI221-PbzsREMORIN-GFP 载体的
洋葱细胞内绿色荧光都分布在细胞膜、细胞核和细胞质中（图 5，C、D），说明 PbzsREMORIN 蛋
白可能分布在细胞膜、细胞核和细胞质中。
2.4 早酥梨 PbzsREMORIN 基因转化烟草
共获得 34 株抗潮霉素的转 PbzsREMORIN 基因烟草植株。利用 PCR 技术检测阳性植株，初
步判断获得 27 株转化植株（图 6）。
从经 PCR 检测出的转化植株中随机取 13 株进行 PCR-Southern 杂交分析，13 株烟草杂交均呈阳
性（图 7），证明抗性植株的 PCR 阳性结果可靠，也进一步证明目的基因 PbzsREMORIN 已整合到烟
草基因组中。
2.5 转 PbzsREMORIN 基因烟草接种青枯病病原菌
在接种青枯病病原菌后 5 d，从叶片病斑和单位面积菌落数上看，与未转基因植株相比，转基因
烟草株系明显具有较强的抗青枯病能力，其中株系 3、15、18、25、26、27 的抗病力最强，比未转
基因植株中的菌落数明显减少（图 8，图 9）。方差分析表明，所有转基因烟草植株与未转基因植株
相比均有极显著差异（P < 0.01）。

1 期 付镇芳等：早酥梨抗黑星病相关基因 PbzsREMORIN 的克隆及功能分析 19


图 5 PbzsREMORIN-GFP 在洋葱表皮细胞中的定位
A、B：GFP 蛋白（A：明场下；B：480 nm 激发光下）；C、D：PbzsREMORIN-GFP 蛋白
（C：明场下；D：480 nm 激发光下）。
Fig. 5 Subcellular localization gene PbzsREMORIN-GFP fusion protein in onion epidermal cells
A，B：GFP protein（A：Onion cells with the visible light；B：Onion cells with the 480 nm exciting light）；C，D：PbzsREMORIN-GFP
protein（C：Onion cells with the visible light；D：Onion cells with the 480 nm exciting light）.

图 6 转基因烟草的 PCR 验证
M：Marker DL2000；C1：阴性对照；C2：阳性对照；1 ~ 34：转基因烟草。
Fig. 6 Identification of transgenic tobacco plants
M：Marker DL2000；C1：Negative control；C2：Positive control；1–34：Transgenic plants.

图 7 转基因烟草 PCR-Southern 杂交分析
P：阳性对照；C：阴性对照；5、9、10、17、19、21、25、26、27、30、31、33、34：呈阳性的株系。
Fig. 7 PCR-Southern blot of transgenic tobacco plants
P：Positive control；C：Negative control；5，9，10，17，19，21，25，26，27，30，31，33，34：Positive plants.

图 8 转基因烟草株系叶片接种青枯病病原菌后的表现
Fig. 8 Responses of transgenic tobacco to the bacterial pathogen Ralstonia solanacearum
20 园 艺 学 报 39 卷

图 9 转基因烟草株系接种青枯病病原菌后叶片单位面积上的菌落数
Fig. 9 Bacterial populations in leaves of transgenic tobacco to the bacterial pathogen Ralstonia solanacearum
3 讨论
Remorin 蛋白是脂筏的主要成分，具有膜结构，无跨膜结构域，remorin 参与寡聚半乳糖醛酸信
号途径，该家族的某些成员具有半乳糖醛酸结合的活性（Chen & An，2006）。研究指出，remorin
在非生物逆境（Reymond et al.，2000；Bray，2002；Kreps et al.，2002；Reddy et al.，2002；Lin et al.，
2003；Wu et al.，2006；Malakshah et al.，2007）和生物逆境中都发挥着作用。目前，关于 remorin
参与抗病性的研究主要集中在病毒病、与豆科共生的根瘤菌中。Raffaele 等（2009）研究了该基因
与马铃薯 X 病毒病的互作，发现 remorin 蛋白能与移动蛋白（TGBp1）结合阻止了病毒蛋白的移动，
提高植株的抗病性。Stefanie 和 Gerhard（2003）提取豆类和根瘤菌分开的界面——类菌体周膜
（Peribacteroid Membrane，PBM），并进行蛋白质组学分析，发现 remorin 存在 PBM，并构成 PBM
复合物Ⅰ。Lefebvre 等（2010）研究表明寡聚 remorin 蛋白依附在宿主细胞膜周围，是共生受体感
应病菌侵染分子信号核心必不可少的部分，remorin 蛋白可能作为植物特异支架蛋白发挥作用。王大
海（2008）的研究推测该基因有可能是细胞骨架末端受体，使细胞骨架末端锚定在细胞质膜上。这
些研究都表明 remorin 蛋白在植物抗病过程中发挥着积极的作用，具有研究的价值。
郜刚（2008）通过伤根灌菌法接种青枯病病原菌到马铃薯叶片上，通过抑制差减杂交技术构建
病原诱导后差异表达 EST 文库，认为 remorin 是马铃薯青枯病诱导防卫关键基因，且提到过量表达
该基因可以增强植株的抗病性。而本研究中 PbzsREMORIN 也是通过差减杂交的方法获得，在接种
梨黑星病病原菌后，该基因在抗病品种早酥梨中被诱导呈现上调表达的趋势，感病品种砀山酥梨中
先降低后上升，说明 remorin 基因参与了病原菌与植物的互作。将 PbzsREMORIN 转入烟草中，在接
种烟草青枯菌后，转基因烟草无论是从发病症状还是单位面积菌落数分析，该基因的转入可以提高
植株的抗病性，这与郜刚（2008）的研究都是一致的。以上结果表明，PbzsREMORIN 在抗病防御
反应过程中起重要作用。
鉴于试验所有的转基因烟草为 T0 代，为获得更加可靠和准确的数据，已收集了种子，期待在
T2 代时，对转基因烟草 PbzsREMORIN 基因的表达进行分析。
1 期 付镇芳等：早酥梨抗黑星病相关基因 PbzsREMORIN 的克隆及功能分析 21

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22 园 艺 学 报 39 卷
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