全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（12）：2431–2438 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–08–13；修回日期：2012–10–15
基金项目：国家自然科学基金项目（31070622）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2013A004）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：limy@swu.edu.cn；sszcq@126.com）
蜡梅快速碱化因子基因 CpRALF 的克隆及表达
分析
王 斌，杨汶源，孙晶晶，马 婧，李名扬*，眭顺照*
（西南大学园艺园林学院，重庆市花卉工程技术研究中心，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400716）
摘 要：通过随机克隆测序的方法从蜡梅花 cDNA 文库中获得快速碱化因子基因，命名为 CpRALF
（GenBank 登录号为：JQ217379）。扩增获得的 DNA 序列与 cDNA 序列一致，表明该基因不具有内含子，
包含一个 384 bp 的最大开放阅读框，编码一个长 127 个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含
有快速碱化因子特有的 YIXY、YXRGC 和 4 个保守的半胱氨酸以及双精氨酸结构。实时荧光定量 PCR 分
析表明该基因在蜡梅茎、根和盛开的全花中表达量较高；在花发育过程中，蕾期和衰败期表达丰度高。
在对蜡梅幼苗进行高温、低温、高盐、重金属 4 种非生物胁迫处理后，通过实时荧光定量 PCR 对 CpRALF
在幼叶中的表达量进行分析，结果表明高温、高盐和重金属能够促进该基因表达，而低温则抑制该基因
的表达，且 CpRALF 对高盐与重金属胁迫的响应比对高温和低温胁迫的响应更为显著和迅速，表明该基
因可能在蜡梅花发育以及非生物胁迫反应响应方面发挥作用。
关键词：蜡梅；快速碱化因子；基因克隆；表达分析
中图分类号：S 685.17 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2012）12-2431-08

Cloning and Expression Analysis of a Rapid Alkalinization Factor Gene
CpRALF from Chimonanthus praecox
WANG Bin，YANG Wen-yuan，SUN Jing-jng，MA Jing，LI Ming-yang*，and SUI Shun-zhao*
（College of Horticulture and Landscape，Southwest University，Chongqing Engineering Research Center for Floriculture，
Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions，Ministry of Education，Chongqing 400716，
China）
Abstract：A new plant gene was identified by randomly cloning and sequencing from cDNA library
constructed from Chimonanthus praecox flowers. The gene has an open reading frame（ORF）of 384 bp
encoding a putative 127aa-polypeptide，and its mature form contains a conservative YIXY domain，a
YXRGC domain and four cysteine residues characteristic to the RALF gene. This gene was thereafter
named as CpRALF（GenBank accession No. JQ217379）. Real-time fluorescence quantitative PCR
demonstrated that steady-state expression of CpRALF was higher in root and blooming flower compared to
that in stem and leaf. And there is a lower expression level in cotyledon and tender leaves. During the
lifespan，the expression of CpRALF was more abundant in bud stage and wither period than in other
periods. The expression of CpRALF was inducible under various abiotic stresses including high temperature，

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salinity and heavy metals，while low temperature could inhibit the expression of CpRALF. The
transcriptional responses of CpRALF subject to salinity and heavy metal treatments were more sensitive
and severe than other treatments. In conclusion，we propose that the CpRALF gene may play a significant
role in Chimonanthus praecox flower development and abiotic stress responses.
Key words：Chimonanthus praecox；rapid alkalinization factor（RALF）；gene clone；expression
analysis

快速碱化因子（rapid alkalinization facor，RALF）属于多肽激素中的一类，动物多肽激素因发
现较早而有较深入的研究，高等植物中的多肽激素研究仅有 20 年的历史。目前已经发现的多肽激素
有：系统素（systemin）、植物磺化激动素（phytosulfokine，PSK）、早期结瘤蛋白 40（earlr nodulation
40，ENOD40）、S 位富含半胱氨酸蛋白（S-locus cysteine-rich protein，PSCR）、CLAVATA3（CLV3）、
快速碱化因子（RALF）（Pearce et al.，1991，2001a，2001b；Fletcher et al.，1999；Yang et al.，2000；
Franssen & Bisseling，2001；Röhrig et al.，2002；Ryan & Pearce，2003；李琛 等，2006）。快速碱
化因子是 Pearce 等（2001）在提取纯化烟草的系统素时偶然发现的，由于该蛋白能引起烟草悬浮细
胞的培养基快速碱化，因此命名为快速碱化因子。通过对多种植物的 EST 进行研究，在 20 多种植
物的不同组织中都发现了其同源基因，表明该基因广泛存在于植物界。
有研究表明 RALF 有引起悬浮细胞培养基碱化、激活细胞内促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）、
参与植物生长发育调控等作用（李焰焰 等，2006）。MAPK 在植物中响应非生物胁迫，调控细胞骨
架的变化，产生防御反应及调节植物生长发育等，由于外施 RALF 能激活细胞 MAPK，暗示 RALF
可能具有多种生理功能（Yu & Tang，2004）。Germain 等（2005）发现，在土豆中不同的同源 RALF
在不同组织中表达量有差异，其中 ScRALF1 在子房中专一表达并且在果实发育后期强烈表达；王家
保等（2009）在对荔枝快速碱化因子基因（LcRALF）的研究表明，该基因在荔枝果皮中特异表达，
并且可能在荔枝采摘后果皮的衰老过程起到一定调节作用；刘志勇等（2010）对大白菜核雄性不育
“两用系”中 BrRALF 的研究以及 Paul 等（2010）对番茄 SlPRALF 的研究均表明该基因与植物的育
性相关。
已有的报道表明 RALF 在调控植物生长发育的方向及节奏起到一定作用，然而 RALF 是否参与
植物的胁迫反应尚未见报道。Scheer 等（2005）对番茄 RALF 的研究表明，质膜的外侧存在能与 RALF
结合受体位点，并且该受体可能与 RALF 的胞内途径相连。然而其究竟如何与受体相互作用以及
RALF 在其他物种的受体研究均未见报道。
蜡梅（Chimonanthus praecox）是蜡梅科（Calycanthaceae）蜡梅属（Chimonanthus）落叶丛生灌
木，冬季开花并且耐寒，耐旱，耐剪切。快速碱化因子基因是否参与其生长发育调控以及逆境防御
机制值得深入研究。本试验中通过克隆获得蜡梅 CpRALF 基因，并使用实时荧光定量 PCR 方法对其
转录水平进行表达分析，以期能够揭示该基因的生理功能。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用材料罄口蜡梅（Chimonanthus praecox var. grandiflora）于 2011 年 12 月至 2012 年 1 月
采自西南大学校园内。蜡梅花 cDNA 文库构建及保存由重庆市花卉工程技术研究中心眭顺照等
（2007）完成。蜡梅四叶期的幼苗采用种子繁殖获得，将种子催芽后放置人工气候箱中培养，培养
12 期 王 斌等：蜡梅快速碱化因子基因 CpRALF 的克隆及表达分析 2433

温度为昼 25 ℃/夜 20 ℃；湿度为 85%；光周期为昼 16 h/夜 8 h；光照强度为 20 000 lx。
大肠杆菌 DH5α 由重庆市花卉工程技术研究中心保存。ExTaq 酶、克隆载体 pMD19-T、反转录
试剂盒 PrimeScriptTM RT Reagent Kit 均购于大连宝生物有限责任公司。RNA 提取试剂盒为天根公司
生产的 RNAprep Pure Plant Kit 试剂盒。SsoFastTE Eva Green Supermix 试剂盒购于 Bio-Rad 公司。
DNA Marker、胶回收试剂盒均购自 BioFlux 公司。引物合成及 DNA 测序由北京六合华大基因有限
公司完成。
1.2 目标克隆子的获得及序列分析
随机挑选文库克隆，提取质粒 DNA 以 5′ pTripl Ex-Sequence primer 为测序引物，采用
ABI3700DNA 自动序列测定仪进行正向序列测定得到 EST 序列，然后运用 DNAStar 软件包的
SeqMan 进行 EST 聚类，运行 BLASTX 与 nr 库进行比对，获得目标克隆子，再以 SP5 和 T7 为测序
引物进行两次正反向序列测定，得到蜡梅快速碱化因子基因 cDNA 序列。并将其命名为 CpRALF。
生物信息分析主要采用 DNAMAN 4.0 和 DNAStar 7.0 软件包进行。
1.3 蜡梅 DNA、RNA 的提取与 cDNA 第一链的合成
采用 CTAB 法提取蜡梅叶片总 DNA，获得的总 DNA 于零下 20 ℃保存。取同一植株上根、
茎、嫩叶以及子叶；选取处于花期中的无病虫害蜡梅，分别采集成熟叶、萌动期、蕾期、露瓣期、
初开期、盛开期和衰败期（吴昌陆和胡南珍，1995）花芽及盛开期花的外瓣、中瓣、内瓣、雄蕊
和雌蕊；选取长势一致的蜡梅四叶期幼苗分别进行高温（42 ℃）、低温（4 ℃）、高盐（1 mol · L-1
NaCl）和重金属（1 mol · L-1 CuSO4）胁迫处理，在处理 0、0.25、1、6 和 12 h 时取 3 株幼苗相同
部位的嫩叶。
使用 RNAprep pure 植物总 RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取上述材料的总 RNA，
然后以 1 μL 总 RNA 为模板，按 PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time（大连宝生物有限责任
公司）试剂盒说明书合成 cDNA 第一链。
1.4 蜡梅 CpRALF 表达分析
采用 SYBRGreen 荧光染料法，用 CFX96（Bio-Rad）实时荧光定量 PCR 仪对 CpRALF 在不同
组织、不同发育时期以及高盐、重金属、高温和低温 4 种非生物胁迫下的表达量进行实时荧光定
量 PCR（real-time quantitative PCR）分析，所用蜡梅内参基因为 Tublin 和 Actin-b（表 1），根据
SsoFastTE Eva Green Supermix 试剂盒（百乐科技有限公司）说明配制反应体系，每个样品设 3 个
重复反应。

表 1 实时荧光定量引物序列
Table 1 Primer sequences used in real-time quantitative PCR
基因名称 Gene 上游引物（5′–3′）Upstream primer 下游引物（5′–3′）Downstream primer
Actin-b AGGCTAAGATTCAAGACAAGG TTGGTCGCAGCTGATTGCTGTG
Tublin GTGCATCTCTATCCACATCG CAAGCTTCCTTATGCGATCC
CpRALF CCTTGGCATTGCTCTTGTTTGTC CTCTTTACCCTCACCTCCACTTCAT

体系中包括 5 μL SsoFast EvaGreen Supermix，上下游引物（10 μmol · L-1）各 0.5 μL，模板 0.5 μL，
ddH2O 3.5 μL，总体 10 μL。反应程序：98 ℃预变性 30 s，95 ℃变性 5 s，57 ℃退火，延伸 5 s（每
次循环后采集荧光），40 个循环；95 ℃变性 10 s，65 ~ 95 ℃做熔解曲线分析，每个循环增加 0.5 ℃，
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每个温度停留 5 s。试验数据通过 Bio-Rad ManagerTM（Version 1.1）软件进行分析，用 2–ΔΔCT法获得
CpRALF 的相对表达量（Livak & Schmittgen，2001）。
2 结果与分析
2.1 CpRALF 克隆子的获得及其序列分析
随机测序后 EST 分析显示文库相应的克隆子 CH0471 上的 cDNA 片段可能属于蜡梅快速碱化因
子基因。以跨 ORF 框的引物进行 PCR，从 CH0471 质粒 DNA、蜡梅基因组 DNA、蜡梅花 cDNA 中
扩增出大小一致的特异产物（图 1），克隆到 pMD19-T vector 中进行测序分析，结果也完全一致，
表明获得的 CH0471 是源于蜡梅快速碱化因子基因编码框全长 cDNA，且无内含子的存在，命名为
CpRALF，GenBank 登录号为：JQ217379。
该序列含有一个 384 bp 的最大 ORF，编码 127 个氨基酸残基的蛋白质。分别以 cDNA 和 DNA
为模板设计特异引物进行 PCR，结果获得大小一致的特异产物（图 1），测序结果也一致，表明该基
因没有内含子。












2.2 CpRALF 编码蛋白序列分析及同源分析比较
CpRALF 编码的蛋白的理论分子量为 14.4 kD，预测等电点为 8.171。其中包含 17 个碱性氨基酸
残基（K、R）、14 个酸性氨基酸残基（D、E）、36 个疏水性氨基酸残基（A、I、L、F、W、V）、
42 个极性氨基酸残基（N、C、Q、S、T、Y）。
信号肽在线分析（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）表明该蛋白质 N 端存在信号肽结
构，可信值为 0.971，最可能的前体蛋白切割位点在第 24 位丝氨酸与第 25 位苏氨酸残基之间。蛋
白质亚细胞定位（http：//psort. nibb. ac. jp/form. html）分析表明该蛋白为分泌蛋白。
氨基酸序列同源检测，CpRALF 与大豆（Glycine max）的同源性为 69%，与拟南芥（Arabidopsis
thaliana）ralf-like 33 的同源性为 67%，并且与杨树（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa Japonica
Group）、苜蓿（Medicago truncatula）、葡萄（Vitis vinifera）、烟草（Nicotiana tabacum）等都有较高
的同源性。
同源比对发现 CpRALF 前体蛋白在 N 端不保守，然而在 C 端的保守性高，存在 RALF 特有的
YIXY、YXRGC 和 4 个保守的半胱氨酸残基结构、双精氨酸结构（图 2）。

图 1 CpRALF 的克隆
M：DL2000 marker；1：基因组 DNA；2：cDNA；3：质粒 DNA。
Fig. 1 Amplification of CpRALF
M：DL2000 marker；1：Genomer DNA；2：cDNA；3：Plasmid DNA.
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图 3 CpRALF 在不同组织中的表达分析
G：根；J：茎；ZY：子叶；YY：幼叶；
CY：成熟叶；H：盛开期花芽。
Fig. 3 Expression analysis of CpRALF in various tissues
G：Roots；J：Stems；ZY：Cotyledons；YY：Tender leaves；
CY：Climax leaves；H：Fully open flowers.
图 4 CpRALF 在 3 轮花器官的表达分析
WB：外瓣；ZB：中瓣；NB：内瓣；
CR：雌蕊；XR：雄蕊。
Fig. 4 Expression analysis of CpRALF in various tissues
WB：Outer perianths；ZB：Medial perianths；
NB：Inner perianths；CR：Pistils；XR：Stamens.

图 2 CpRALF 与同源基因编码区氨基酸序列比对
Lc：荔枝（ABS72341）；Nt：烟草（AF407278-1）；v：葡萄（CAN69272）；At：拟南芥（NP-567476）；Os：水稻（NP-001043012）；
Pt：杨树（XP-002298677）；Gm：大豆（XP-003521695）；Mt：苜蓿（XP-003626248）；Cp：梅（JQ217379）。
—：双精氨酸结构；*：YIXY、YXRGC 基序；#：半胱氨酸残基。
Fig. 2 Alignment of the deduced amino acid sequences of ORF of CpRALF and homologous genes
Lc：Litchi chinensis（ABS72341）；Nt：Nicotiana tabacum（AF407278-1）；v：Vitis vinifera（CAN69272）
；At：Arabidopsis thaliana（NP-567476）；Os：Oryza sativa Japonica Group（NP-001043012）；
Pt：Populus trichocarpa（XP-002298677）；Gm：Glycine max（XP-003521695）；
Mt：Medicago truncatula（XP-003626248）；Cp：Chimonanthus praecox（JQ217379）.
—：Double-arginine structure；*：YIXY，YXRGC motif；
#：Cysteine residues.

2.3 CpRALF 的表达分析
CpRALF 的实时荧光定量分析表明，在蜡梅不同组织中 CpRALF 均表达，但表达水平差异较大
（图 3）。在茎和花中的表达量最高，根和成熟叶片中次之，子叶和幼叶中最低。
对 CpRALF 在蜡梅花器官中进行表达分析（图 4），结果显示 CpRALF 在中轮花瓣最高，内轮花
瓣、雌蕊次之，外轮花瓣和雄蕊中的表达量最低。
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图 5 CpRALF 在不同花发育时期的表达量
MD：萌动期；LQ：蕾期；LB：露瓣期：CK：初开期；
SK：盛开期；SB：落花期。
Fig. 5 Expression analysis of CpRALF during flower
MD：Sprout period；LQ：Flower-bud period；
LB：Display-petal period；CK：Initiating bloomperiod；
SK：Bloom period；SB：Wither period.
CpRALF 在蜡梅开花过程中不同时期的表
达分析表明，蕾期和衰败期的表达量最高，萌
动期基本不表达，露瓣、初开、盛开的表达量
逐渐上升（图 5）。
胁迫处理表明，4 种非生物胁迫对 CpRALF
表达都有影响，且该基因的表达变化各不相同。
高盐和重金属处理 15 min 后，CpRALF 的表达
量明显升高，而且在后期的处理中该基因表达
量稍稍下降；高温处理 15 min 后有少量的增
加，6 h 之后降低，最后在 12 h 后达到最高量；
低温处理 15 min 后 CpRALF 表达呈现上升趋
势，6 h 后有下降趋势，在 12 h 后达到最低量
并且低于对照的表达量（图 6）。


图 6 不同胁迫下 CpRALF 表达的分析
Fig. 6 Expression analysis of CpRALF in different stresses

以上结果表明：高盐、重金属、高温胁迫会诱导 CpRALF 表达，而低温胁迫则会抑制 CpRALF
在幼叶中的表达，并且 CpRALF 对高盐和重金属胁迫的响应比高温和低温胁迫的响应更为迅速和剧
烈。
3 讨论
RALF 是一个大的基因家族，有功能的 RALF 蛋白都是由前体蛋白加工产生的（Pearce et al.，
2001b），RALF 蛋白都含有特殊结构。本试验中首次从蜡梅中克隆到 RALF 基因 CpRALF，与其它
快速碱化因子蛋白相比，CpRALF 编码的蛋白含有该类蛋白的特殊结构，预示该蛋白可能在蜡梅的
生长发育或胁迫中起到一定的作用。在同源蛋白的 YXRGC 结构中，X 位存在 N 和 S 两种氨基酸残
12 期 王 斌等：蜡梅快速碱化因子基因 CpRALF 的克隆及表达分析 2437

基，该位点氨基酸的差异对 RALF 蛋白的功能有何影响尚未可知。有报道认为，RALF 蛋白 N 端上
游存在一个双精氨酸位点，该位点可能为 RALF 前体蛋白加工过程中的蛋白水解酶特异识别位点，
另一个双精氨酸位点位于 RALF 蛋白的内部，可能是一个额外加工位点或降解位点（Pearce et al.，
2001a）。在蜡梅中位于 RALF 蛋白内部的双精氨酸结构不存在，推测 CpRALF 蛋白与其他蛋白存在
着不同的加工过程。
Olsen 等（2002）在对拟南芥的多个编码 RALF 蛋白的基因进行 RT-PCR 分析，表明每个 RALF
基因在不同的器官都表达，而且存在表达差异，暗示 RALF 可能广泛作用于植物的多种生理过程。
McCubbin 等（2006）从樱草属植物的花中克隆到的一个 RALF，研究表明它与花的发育过程有关。
本研究中发现 CpRALF 在蜡梅大部分组织中均表达，并且在茎、根以及花中的表达量很高，推测
CpRALF 在蜡梅中起到多种生理作用。在蜡梅开花过程中 CpRALF 在萌动期基本不表达，蕾期和衰
败期表达量最高，其他时期表达量低，表明 CpRALF 在蜡梅花的发育过程起到了重要作用。在盛花
期花器官中雌蕊表达丰度高，推测该基因可能在蜡梅中对雌蕊的发育有一定影响，而刘志勇等（2010）
以及 Paul 等（2010）的研究结果表明 RALF 在大白菜和番茄的雄蕊发育起到重要作用，推测这种差
异的可能原因是由于 RALF 家族不同成员在不同植物组织中的生理作用不同。
非生物胁迫处理表明，CpRALF 可能参与了蜡梅的胁迫反应，并且对盐离子胁迫反应响应更迅
速、激烈。Schaller 等（1999）认为，快速碱化因子使培养基 pH 上升的原因可能是 RALF 蛋白抑制
了细胞膜上的 H+-ATPase 的活性，从而导致烟草悬浮细胞培养基的碱化。蜡梅经过盐离子胁迫处理
最先变化的可能就是其植物体内的 pH 变化，蜡梅可能通过 RALF 蛋白激活其他生物途径来调节其
内环境的稳定以此来响应对盐离子的胁迫。而且盐离子对植物的伤害反应快于温度对植物的伤害，
这可能也是蜡梅对盐离子胁迫的响应快于对温度胁迫响应的原因。但是在 4 种胁迫处理中，低温处
理与其它 3 种胁迫处理产生了相反的作用，抑制了 CpRALF 的表达，可能是低温导致植物的新陈代
谢减慢，导致该基因的表达量下降。
本试验中从蜡梅中获得了 RALF 基因，并对其进行了一些功能分析，在对其组织、发育时期以
及胁迫的响应研究说明该基因参与了植物的生长发育及胁迫反应，然而对其作用机理并未进行深入
的研究，其在蜡梅中的作用受体也未知。今后将从 RALF 作用的受体、与受体的作用机理及其如何
调控植物生长发育等方面进行更深入的研究，以期能揭示 RALF 在植物中的生理作用。

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