全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（10）：1983–1992 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–06–26；修回日期：2014–08–11
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31272124）；湖南省自然科学基金项目（12JJ6017）
* E-mail：namijiangnan@126.com
利用基因芯片鉴定梨品种自交不亲和基因型
江 南 1,2,*，谭晓风 2，张 琳 2，邓 靖 1
（1 湖南工业大学包装与材料工程学院，湖南株洲 412007；2 中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室，
经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，长沙 410004）
摘 要：根据东方梨中已鉴定的 46 个 S 基因序列和 S 基因的结构特点，设计了 86 条寡核苷酸探针
并制备成 S 基因寡核苷酸检测芯片，采用 Cy3 荧光修饰引物标记被检测品种的 PCR 产物并与芯片杂交，
以检测不同品种的 S 基因型。结果表明：利用芯片与华梨 2 号、秀玉和德胜香等已知 S 基因型的品种杂
交，杂交信号显示与各品种已知基因型相符合。利用芯片鉴定了丽江黄酸梨等 27 个未知 S 基因型的梨品
种，获得了各品种的 S 基因型，随机选取部分品种进行 DNA 测序和序列分析，结果与芯片杂交结果完全
一致，证明利用 S 基因寡核苷酸芯片鉴定梨品种 S 基因型结果准确可靠。
关键词：梨；自交不亲和；S 基因型；寡核苷酸；芯片
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）10-1983-10

Identifying Pear Cultivars S-genotypes Using Gene Chips
JIANG Nan1,2,*，TAN Xiao-feng2，ZHANG Lin2，and DENG Jing1
（1School of Packing and Material Engineering，Hunan University of Technology，Zhuzhou，Hunan 412007，China；2Key
Laboratory of Cultivation and Protection for Non-wood Forest of Ministry of Education，the Key Laboratory of Non-wood
Forest Product of Forestry Ministry，Central-south University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China）
Abstract：Based on the structure characteristic of self-incompatibility gene and the gene group
sequences of 46 S genes in Oriental pear cultivars，86 probes for S-RNase detections were designed and
oligonucleotide genechip was established. In order to detect the S-genotype of pear cultivars，the PCR
products of S-RNase were amplified by Cy3-labeled primers and hybridized with the microarray. The
cultivars with known S-genotype such as Huali 2 were hybridized with the genechip and 27 cultivars with
unknown S-genotype were S-genotyped using the genechip. The DNA sequenced results of Huali 2，Xiuyu
and Deshengxiang pears and randomly selected unknown S-genotype cultivars were consistent with the
microarray analyses. In conclusion，the oligonucleotide genechip provided an accurate and reliable method
for detecting S-genotype of pear cultivars.
Key words：pear；self-incompatibility；S-genotype；oligonucleotide；genechip

近 20 年，在梨 S 自交不亲和基因的研究中，利用 PCR-RFLP 技术、S 基因 DNA 序列分析、cDNA
克隆、杂交授粉试验、花粉管生长检测及蛋白质电泳分析等方法已分离鉴定了 53 个梨 S 等位基因
（GenBank 已登录），鉴定了部分梨品种的 S 基因型。日本学者建立了鉴别梨 S 基因的 PCR-RFLP

1984 园 艺 学 报 41 卷
方法（Ishimizu et al.，1999；Takasaki et al.，2004），并从日本梨中获得了 S1 ~ S9 等位基因的 cDNA
序列和基因组序列（Ishimizu et al.，1996；Castillo et al.，2002；Takasaki et al.，2004）。韩国学者利用
PCR-RFLP 方法和 DNA 测序从韩国砂梨中发现了 S10（Kim et al.，2006）。中国学者从 2003 年开始采
用 PCR-RFLP、DNA 测序、杂交检测等方法开展了中国梨自交不亲和性的研究，发现了包括 S1 ~ S10
基因在内的 42 个 S 基因，并确定了 200 多个品种的 S 基因型；同时采用 3′RACE 技术从中国梨中克
隆了 S12、S13、S15、S17 ~ S22、S25 ~ S30、S32、S34、S35、S38 ~ S40、S42、S46 等 S 基因全长 cDNA 序列
（谭晓风 等，2005a，2005b，2005c；乌云塔娜 等，2005，2006；Zhang et al.，2007，2009，2014；
衡伟 等，2008；邓建军 等，2010；王立新 等，2010）。GenBank 中 S 基因相关数据分析显示 S47 ~
S53 仅发现于西洋梨中。目前确定 S 基因型的方法以 PCR-RFLP 技术和 S 基因 DNA 序列分析法应用
较为广泛，这两种方法能较快速、准确地确定 S 等位基因数量比较少（如日本梨，10 个以下）或品
种资源数比较少的梨品种 S 基因型。然而中国梨品种资源丰富，有近 2 000 多个梨品种，其中超过
三分之一为砂梨品种，尤其在地方品种或野生型个体中蕴含着种类丰富的 S 基因资源，现有的
PCR-RFLP、S 基因 DNA 序列分析、人工控制授粉等技术方法难以在短时间内准确鉴定数目众多的
梨品种的 S 基因型。基因芯片技术是一种较为成熟的具有快速准确和集成化特点的检测技术。作者
前期研究（江南和谭晓风，2007，2012；Tan et al.，2007；江南 等，2008）中已根据梨自交不亲和
基因的结构特点设计了部分 S 基因的检测探针，制成寡核苷酸芯片，并对芯片分子杂交条件进行优
化，获得了较好的反应条件并用制备的芯片检测了已知 S 基因型的梨品种，证明了其是一种切实可
行的检测方法。本研究在此基础上进一步针对已分离鉴定的 S 基因设计特异寡核苷酸探针，利用 S
基因寡核苷酸芯片快速准确检测中国不同生态型种质资源梨品种的 S 基因型，挖掘新的 S 基因资源，
为梨授粉品种优化配置及杂交育种亲本的选择提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料和主要试剂
27 个未知 S 基因型的梨供试品种和 3 个已知 S 基因型的品种华梨 2 号（S3S4）、秀玉（S4S5）、
德胜香（S3S29）（检测芯片质量）的新鲜嫩梢（带嫩叶 5 ~ 6 片）于 2013 年 4 月采自湖北省农业科
学院果树茶叶研究所国家果树种质武汉砂梨圃，冰盒保鲜，带回实验室后–80 ℃保存备用。
芯片制备及杂交试剂参考文献（江南 等，2008），ExTaq DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司，
Trans1-T1，pEASY-T1 购自 TransGen Biotech 公司，DNA 提取试剂盒及 PCR 产物纯化试剂盒均购自
BIOER 公司，各种内切酶购自 TaKaRa 公司，其他试剂为进口或国产分析纯。
引物和探针均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，DNA 测序由上海铂尚生物技术有限
公司完成。
1.2 梨品种基因组 DNA 的提取及 S-RNase 特异片段 PCR 扩增
用 DNA 提取试剂盒从梨嫩叶中提取梨品种基因组 DNA，Beckman DU-640 核酸蛋白分析仪测
定 DNA 浓度，取 OD260/OD280 值在 1.6 ~ 2.0 之间的 DNA 于–20 ℃储存备用。S-RNase 特异片段扩
增采用的正向引物 PF：5′-TTTACGCAGCAATATCAG-3′（Ishimizu et al.，1999）和反向引物 PR：5′-AC
RTTYGGCCAAATARTT-3′（张琳，2008），引物合成时均要求在 5′端进行荧光物质 Cy3 修饰，根据
Zhang 等（2009）的反应体系及程序进行 PCR 扩增。取 5 µL PCR 产物 1.5%的琼脂糖电泳检测，对
含有 S-RNase 基因目的片段的理想 PCR 产物用 PCR 产物纯化试剂盒进行回收纯化，并对回收片段
进行二次扩增，用 1.5%的琼脂糖电泳检测条带的有无。
10 期 江 南等：利用基因芯片鉴定梨品种自交不亲和基因型 1985

1.3 S 基因寡核苷酸探针设计及合成
S-RNase 的高变区（Hyper variable region，HV 区）是 S-RNase 具有长度和序列多态性的部位，
不同的 S 等位基因之间差异较大，根据 GenBank S 基因和相关文献，获得已知存在于东方梨品种中
的 S1 ~ S46 的 HV 区特异系列，其中 S14、S23、S24、S33 序列不确定，暂不用于芯片。参考江南和谭晓
风（2012）的方法在 S-RNase 的 HV 区设计各 S-RNase 长度为 32 bp 的寡核苷酸探针共 86 条，其中
包含各 S-RNase MM 探针（错配 1 ~ 2 个碱基的探针）各 1 条，阳性和阴性对照探针各 1 条，探针
由北京六合华大基因公司合成，各探针合成时均进行 5′氨基修饰。
1.4 S 基因寡核苷酸芯片制备及杂交
用 pH 9.0 碳酸盐缓冲液溶解合成的寡核苷酸探针并稀释成终浓度为 100 μmol · L-1，用点样仪
（DNA-Plotter）按阵列设计点样，依照文献（江南 等，2008）的步骤制备并处理 S 基因寡核苷酸
芯片。芯片阵列设计如图 1，其中 Sn 为某 S 基因的寡核苷酸探针（如 S1），Sn-1 为 Sn 的 MM 探针，
同等浓度无关探针（选自与 S 基因同源性很低的人类高血压相关基因 HRG 的一段 32 bp 的序列）作
为阴性对照，5′氨基修饰的 PF1 序列作为阳性对照，pH 9.0 碳酸盐缓冲液作为空白对照。

S1 S1 S2 S2 S3 S3 S4 S4 S5 S5 S6 S6 S7 S7
S1 S1 S2 S2 S3 S3 S4 S4 S5 S5 S6 S6 S7 S7
S1-1 S1-1 S2-1 S2-1 S3-1 S3-1 S4-1 S4-1 S5-1 S5-1 S6-1 S6-1 S7-1 S7-1
S8 S8 S9 S9 S10 S10 S11 S11 S12 S12 S13 S13 S15 S15
S8 S8 S9 S9 S10 S10 S11 S11 S12 S12 S13 S13 S15 S15
S8-1 S8-1 S9-1 S9-1 S10-1 S10-1 S11-1 S11-1 S12-1 S12-1 S13-1 S13-1 S15-1 S15-1
S16 S16 S17 S17 S18 S18 S19 S19 S20 S20 S21 S21 S22 S22
S16 S16 S17 S17 S18 S18 S19 S19 S20 S20 S21 S21 S22 S22
S16-1 S16-1 S17-1 S17-1 S18-1 S18-1 S19-1 S19-1 S20-1 S20-1 S21-1 S21-1 S22-1 S22-1
S25 S25 S26 S26 S27 S27 S28 S28 S29 S29 S30 S30 S31 S31
S25 S25 S26 S26 S27 S27 S28 S28 S29 S29 S30 S30 S31 S31
S25-1 S25-1 S26-1 S26-1 S27-1 S27-1 S28-1 S28-1 S29-1 S29-1 S30-1 S30-1 S31-1 S31-1
S32 S32 S34 S34 S35 S35 S36 S36 S37 S37 S38 S38 S39 S39
S32 S32 S34 S34 S35 S35 S36 S36 S37 S37 S38 S38 S39 S39
S32-1 S32-1 S34-1 S34-1 S35-1 S35-1 S36-1 S36-1 S37-1 S37-1 S38-1 S38-1 S39-1 S39-1
S40 S40 S41 S41 S42 S42 S43 S43 S44 S44 S45 S45 S46 S46
S40 S40 S41 S41 S42 S42 S43 S43 S44 S44 S45 S45 S46 S46
S40-1 S40-1 S41-1 S41-1 S42-1 S42-1 S43-1 S43-1 S44-1 S44-1 S45-1 S45-1 S46-1 S46-1
5′PF1 5′PF1 5′PF1 HRG HRG HRG CK CK CK
5′PF1 5′PF1 5′PF1 HRG HRG HRG CK CK CK

图 1 S 基因检测芯片阵列设计
Fig. 1 Design of microarray detecting probes of S-genotype

将梨品种第 2 次扩增纯化后的 Cy3 标记的 PCR 产物稀释成终浓度为 100 ng · μL-1，与杂交液和
灭菌超纯水（SPW）等比例混合，95 ℃水浴变性 5 min 后迅速冰上冷却，取 20 μL 混合液加入芯片
阵列，于杂交箱中 47 ℃避光杂交 4 h（江南 等，2008）后，AXON-4100A 芯片扫描仪进行信号检
测，GenePix 分析软件分析扫描结果，信号强度扣除背景值后以各探针重复点的平均值计算，各品
种芯片杂交重复 1 次。
1.5 S 基因 DNA 测序对 S 基因寡核苷酸检测芯片杂交结果验证
对各品种进行芯片检测同时随机抽取部分品种并对品种第 2 次扩增的 PCR 产物进行 TA 克隆，
DNA 测序，测序结果在 NCBI 中通过 Blast 与数据库中已知序列进行 DNA 序列和推导的氨基酸序
1986 园 艺 学 报 41 卷
列比对，应用 Vector NTI，DNAMAN 等软件对测序结果进行多序列分析，进而确定梨品种所包含
的 S 基因和 S 基因型。
1.6 未知 S 基因的鉴定
对芯片鉴定梨品种 S 基因型过程中发现的未知 S 基因，先对相应品种第 2 次扩增的 PCR 产物进
行酶切，若酶切未能鉴定，再对相应品种第 2 次扩增的 PCR 产物进行 TA 克隆，DNA 测序，测序
结果按 1.5 中步骤处理，最终确定各品种的 S 基因型。
2 结果与分析
2.1 梨品种 S 基因型鉴定
S 基因型的对照品种和供试的 27 个梨品种（表 1）PCR 扩增均有较好的特异扩增条带（图 2），

表 1 梨种质名称、类型和 PCR 片段长度
Table 1 Name，type and length of fragment of pear cultivars
序号
Code
种质名称
Cultivar name
种质类型
Cultivar type
亲本或来源
Pedigree or source
片段/bp
Fragment
1 丽江黄酸梨 Lijiang Huangsuanli 地方品种 Local cultivar 云南丽江 Lijiang，Yunnan 345/529
2 兴山 19 号（老式香水梨）
Xingshan 19（Laoshi Xiangshuili）
地方品种 Local cultivar 湖北兴山 Xingshan，Hubei 347/361
3 兴山 26 号（月半梨 2）
Xingshan 26（Yuebanli 2）
地方品种 Local cultivar 湖北兴山 Xingshan，Hubei 367/349
4 本地黄梨 Bendi Huangli 地方品种 Local cultivar 四川汉源 Hanyuan，Sichuan 350/529
5 九襄慈梨 Jiuxiang Cili 地方品种 Local cultivar 四川汉源 Hanyuan，Sichuan 989/529
6 白面梨 Baimianli 地方品种 Local cultivar 陕西镇巴 Zhenba，Shaanxi 989/445
7 原味小香梨 Yuanwei Xiaoxiangli 地方品种 Local cultivar 四川汉源 Hanyuan，Sichuan 367/350
8 新一 Xinyi 国外引进 Imported 山东省果树所
Shandong Fruit Research Institute
376/368
9 梨园杨称梨 Liyuan Yangchengli 地方品种 Local cultivar 四川汉源 Hanyuan，Sichuan 350/345
10 金星 Jinxing 品系 Strain 河北 Hebei 341/340
11 兴山 20 号（兴山糖梨子）
Xingshan 20（Xingshan Tanglizi）
地方品种 Local cultivar 湖北兴山 Xingshan，Hubei 362/437
12 鹤峰雪花梨 Hefeng Xuehuali 地方品种 Local cultivar 湖北鹤峰 Hefeng，Hubei 367/434
13 安农 1 号 Annong 1 选育品种 Breeding cultivar 湖北武汉 Wuhan，Hubei 347/341
14 玉绿 Yulü 品系 Strain 莱阳茌梨（白梨）× 太白（砂梨）
Laiyang Chili（P. bretschneideri）×
Taibai（P. pyrifolia）
341/336 or 336/341
15 丽江马占梨（3）
Lijiang Mazhanli（3）
地方品种 Local cultivar 云南丽江 Lijiang，Yunnan 367/529
16 汉源招包梨 Hanyuan Zhaobaoli 地方品种 Local cultivar 四川汉源、金川
Hanyuan and Jinchuan，Sichuan
367/345
17 梨园自来梨 2 Liyuan Zilaili 2 地方品种 Local cultivar 四川汉源 Hanyuan，Sichuan 350/989
CK1 华梨 2 号（对照 1，S3S4）
Huali 2（Control 1，S3S4）
地方品种 Local cultivar 湖北武汉 Wuhan，Hubei 376/368
CK2 秀玉（对照 2，S4S5）
Xiuyu（Control 2，S4S5）
国外引进 Imported 日本 Japan 368/375
CK3 德胜香（对照 3，S3S29）
Deshengxiang（Control 3，S3S29）
地方品种 Local cultivar 四川 Sichuan 376/347
18 新秀 Xinxiu 国外引进 Imported 山东烟台 Yantai，Shandong 368/375
19 罗田秤砣梨 Luotian Chengtuoli 地方品种 Local cultivar 湖北罗田 Luotian，Hubei 376/375
20 罗田冬梨 Luotian Dongli 地方品种 Local cultivar 湖北罗田 Luotian，Hubei 434/966
21 梨园麻子梨 Liyuan Mazili 地方品种 Local cultivar 四川汉源 Hanyuan，Sichuan 367/362
22 大酸梨 Dasuanli 地方品种 Local cultivar 四川汉源 Hanyuan，Sichuan 350/347
23 弥渡玉梨 Midu Yuli 地方品种 Local cultivar 云南弥渡 Midu，Yunnan 536/445 or 445/536
24 早酥蜜 Zaosumi 品系 Strain 河北 Hebei 367/376
25 丽江黄皮梨 Lijiang Huangpili 地方品种 Local cultivar 云南丽江 Lijiang，Yunnan 336/529
26 大理胭脂梨 Dali Yanzhili 地方品种 Local cultivar 云南大理 Dali，Yunnan 345/345
27 白大金梨 Baidajinli 地方品种 Local cultivar 四川汉源 Hanyuan，Sichuan 367/350
10 期 江 南等：利用基因芯片鉴定梨品种自交不亲和基因型 1987

其中 1 号丽江黄酸梨、4 号本地黄梨、5 号九襄慈梨、6 号白面梨、13 号安农 1 号、15 号丽江马占
梨（3）、17 号梨园自来梨 2、20 号罗田冬梨、23 号弥渡玉梨、25 号丽江黄皮梨等 10 个品种有两个
PF ~ PR 特异片段条带，其中 13 号安农 1 号两条带很靠近，作为一条带回收。另外 17 个品种 PF ~ PR
片段呈现单带，目的片段大小为 340 ~ 1 000 bp（表 1）。

图 2 梨品种 S 基因 PCR 产物于 1.5%琼脂糖凝胶电泳图
1 ~ 27 及 CK1 ~ CK3 分别对应表 1 中的 30 个品种。
Fig. 2 PCR products of S gene on pear cultivars in 1.5% agarose gel electrophoresis
The accession codes 1–27 and CK1–CK3 are the same as those shown in Table 1.

用已知 S 基因型的对照品种华梨 2 号、秀玉、德胜香纯化后的 Cy3 标记的 PCR 产物分别与芯
片阵列避光杂交，一个品种对应一个阵列，杂交结果如图 3，根据阵列中各探针的位置和杂交信号，
可判断华梨 2 号、秀玉和德胜香所含有的 S-RNase 基因和 S 基因型分别是华梨 2 号 S3S4、秀玉 S4S5、
德胜香 S3S29，与各品种已知的 S 基因型相符，重复杂交试验，结果一致，可用芯片进一步检测未知
S 基因型的梨品种。
图 3 已知 S 基因型梨品种与芯片杂交信号扫描结果
Fig. 3 The scanning results of known S-genotypes pear cultivars hybridized with the microarray

将丽江黄酸梨等 27 个未知 S 基因型的梨品种第二次扩增纯化后的 Cy3 标记的 PCR 产物分别与
芯片阵列避光杂交，一个品种对应一个阵列，重复杂交 1 次，杂交结果如图 4。根据芯片杂交信号
扫描结果，可以判断其中 26 个品种所包含的 S-RNase 基因有：S1、S3、S4、S5、S7、S8、S12、S13、
S15、S17、S19、S21、S22、S29、S42，兴山 19 号、兴山 26 号、罗田冬梨、梨园麻子梨和大理胭脂梨阵
列中均只有一个 S-RNase 基因探针的杂交信号，分别为：S29、S1、S8、S1 和 S22，兴山 20 阵列中无
探针杂交信号，假设这 6 个品种含有另一个 S-RNase 基因为 SX。从杂交结果可鉴定 21 个品种的 S
基因型如表 2。
1988 园 艺 学 报 41 卷
图 4 未知 S 基因型梨品种与芯片杂交信号扫描结果
1 ~ 27 分别对应表 1 中的 27 个品种。
Fig. 4 The scanning results of unknown S-genotypes pear cultivars hybridized with the microarray
The accession codes 1 to 27 are the same as those shown in Table 1.

表 2 梨种质的 S 基因型
Table 2 S-genotypes of pear cultivars
序号
Code
S 基因型
S-genotype
序号
Code
S 基因型
S-genotype
序号
Code
S 基因型
S-genotype
1 S22S42 11 SxSx 21 S1Sx
2 S29Sx 12 S1S8 22 S13S29
3 S1Sx 13 S7S17/S7S34 23 S12S19/S19S36
4 S13S42 14 S17S21/S21S34 24 S1S3
5 S15S42 15 S1S42 25 S21S42
6 S15S19 16 S1S22 26 S22Sx
7 S1S13 17 S13S15 27 S1S13
8 S3S4 18 S4S5 CK1 S3S4
9 S13S22 19 S3S5 CK2 S4S5
10 S17SX /S34Sx 20 S8Sx CK3 S3S29
10 期 江 南等：利用基因芯片鉴定梨品种自交不亲和基因型 1989

2.2 DNA 测序验证芯片鉴定梨品种 S 基因型结果
基因检测芯片检测未知品种 S 基因型同时，随机选取兴山 20 号、丽江黄酸梨、弥渡玉梨、汉
源招包梨、早酥蜜、玉绿和安农 1 号等 7 个品种进行 DNA 测序，对芯片鉴定品种 S 基因型结果进
行验证。丽江黄酸梨、弥渡玉梨、安农 1 号等 PCR 特异扩增为双带，兴山 20 号、汉源招包梨、早
酥蜜和玉绿等 PCR 特异扩增为单带，第二次扩增的 PCR 特异片段经 TA 克隆和测序，得到相应
S-RNase 基因特异片段核苷酸序列。
序列分析及与 GenBank 中已知 S-RNase 基因比对结果表明：丽江黄酸梨、弥渡玉梨的两条 PCR
特异扩增条带分别与梨属中的 S22 和 S42、S12（S36）和 S19 的相似性为 100%，因此可确定丽江黄酸
梨、弥渡玉梨 S 基因型分别为 S22S42、S12S19 或 S36S19；兴山 20 号 PCR 特异扩增产物含有长度分别
为 362 bp 和 437 bp 的序列，序列分析 437 bp 片段 HV 区与西洋梨 S51.01 等位基因（GenBank 登录号
KC473796.1）内含子相差 8 个碱基，氨基酸序列同源性 100%，可确定 437 bp 序列为中国梨一新 S
基因序列，按 GenBank 中中国梨 S 基因命名序号，初步命名为 S47，362 bp 片段与 S27 相似性最大
（92%），HV 区与西洋梨 S-RNase-S34.01（GenBank 登录号 KC473637.1）HV 区完全相同，保守区
“IIWPNV”序列有两个碱基差别，可确定为一新 S 基因，初步命名为 S48，由此可鉴定兴山 20 号 S
基因型为 S47S48。汉源招包梨、早酥蜜、玉绿和安农 1 号等 S-RNase 基因 PCR 特异扩增序列分别与
中国梨的 S1 和 S22、S1 和 S3、S17 和 S21、S7 和 S17 完全相似（100%）。随机对部分供试品种 S-RNase
基因进行 DNA 克隆、测序，检测结果与芯片杂交结果完全一致。
2.3 未知 S 基因鉴定结果
从图 4 芯片杂交信号分析可知，兴山 19 号、兴山 26 号、罗田冬梨、梨园麻子梨和大理胭脂梨
的 S 基因型分别为：S29Sx、S1Sx、S8Sx、S1Sx 和 S22Sx，其中除罗田冬梨 PF ~ PR 片段为双带（1 000 bp
左右/434 bp），其他均为单带。直接回收罗田冬梨第二次扩增的 1 000 bp 左右 PF ~ PR 特异片段，TA
克隆、测序后获得 966 bp 的特异片段核苷酸序列，经序列分析和同源性比对发现 966 bp 序列与 S37
的相似性最大（98%），确定为中国梨一新的 S 基因，初步命名为 S49。
用内切酶 BfmⅠ（SfcⅠ）、PauⅠ（BssHⅡ）、AccⅡ分别对品种兴山 26 号和梨园麻子梨、大理
胭脂梨、兴山 19 号第 2 次扩增特异片段回收产物进行酶切，结果如图 5。各品种酶切产物电泳条带
表明大理胭脂梨特异片段回收产物全部被 BssHⅡ酶切成两个目的片段，说明大理胭脂梨只含有 S22，
为 S22S22 纯合体，兴山 26 号、梨园麻子梨和兴山 19 号还均含有 1 条未知的 S 基因。

图 5 梨品种 S 基因酶切产物
M：Marker；21：梨园麻子梨；3：兴山 26 号；26：大理胭脂梨；2：兴山 19 号。
Fig. 5 Digestion products of S gene on pear cultivars
M：Marker；21：Liyuan Mazili；3：Xingshan 26；26：Dali Yanzhili；2：Xingshan 19.
1990 园 艺 学 报 41 卷
将兴山 26 号、梨园麻子梨和兴山 19 号第 2 次扩增特异片段回收产物 TA 克隆、测序。序列分
析及 GenBank 同源性比对，发现 3 个品种 S 基因 PF ~ PR 特异扩增产物中均含有两条长度不同的特
异扩增片段，兴山 26 号含长度为 349 bp 和 367 bp 的两个片段，梨园麻子梨的为 362 bp 和 367 bp，
兴山 19 号的为 347 bp 和 361 bp。序列分析表明兴山 26 号与梨园麻子梨的 367 bp 片段序列一致，
均与砂梨 S1 的相似性为 100%，349 bp 序列 HV 区与中国梨 S32 同源性最大，为 97%，有 9 个碱基差
别，362 bp 序列与苹果属 S26 相似性 96%，与新疆梨 S35 相似性 95%，可确定兴山 26 号 349 bp 序列
及梨园麻子梨 362 bp 序列分别为一新的 S 基因序列，初步命名为 S50 和 S51；兴山 19 号的 347 bp 序
列与白梨的 S29 相似性为 100%，361 bp 序列 HV 区与 Pyrus pyraster（西洋梨）S34.04 等位基因
（KC473640.1）相似性最大（95%），HV 区有 7 个 aa 不同，与枇杷（Eriobotrya japonica）S9 相似
性最大（95%），HV 区有 12 个 aa 不同，与梨园麻子梨（362 bp）HV 区有 17 个 aa 不同，可确定
兴山 19 号中的 361 bp 序列为一个新的 S 基因序列，初步命名为 S52。
3 讨论
本研究制备了 S-RNase 基因检测芯片，芯片阵列由 GenBank 中登录和文献报道的已知序列完善
的东方梨中 42 个 S-RNase 基因的特异探针和 MM 探针组成。中国是东方梨系统的主要起源地，用
此芯片阵列可直接快速地鉴定梨品种的 S 基因，发掘新的 S-RNase 基因资源。用已知 S 基因型品种
与芯片杂交，各阵列杂交检测信号显示与对应品种 S 基因型相符，品种与 S-RNase 探针杂交信号与
阳性对照杂交信号接近，MM 探针杂交信号较弱，表明探针特异性好，前期研究探索的杂交条件适
合本研究中芯片杂交；同时芯片信号扫描结果还显示芯片背景清晰，阵列中探针样点均匀，阵列点
样效果好，制备的芯片可用于梨 S-RNase 基因的检测。
不管是东方梨还是西洋梨的 S 基因有着相同的保守区域（Conserved region）和高变区域
（Hypervariable region，HV），包括 S 基因氨基酸序列的基本结构也是一致的（衡伟 等，2008）。
HV 区是识别花粉的功能部位（Royo et al.，1994），在 HV 区中有几个甚至一个氨基酸被取代，就有
可能会改变自交不亲和反应的方向。一个氨基酸的差异就可能导致新 S 基因型的产生，所以 HV 区
是 S 基因富有多态性的识别部位，在 S 基因的 HV 区设计组成芯片阵列的探针，能确保探针的特异
性。为确保检测过程中对芯片杂交信号的准确判断，用 MM 探针识别杂交假阳性信号，5′氨基酸修
饰的 PF1 序列作为阳性对照，以检验 Cy3 对各品种 PCR 扩增 S 基因特异片段标记的标记效率。各
品种 PCR 扩增特异片段都包含有梨 S-RNase 基因的典型特征，即保守区 1、保守区 2 和高变区，以
及没有被鉴定为保守区但却非常保守的一段“ⅡWPNV”氨基酸序列，PF1 序列位于保守区 1 中，
所以各品种纯化后适宜浓度（100 ng · μL-1）PCR 产物与阳性对照杂交的信号强度应接近一致。以人
类高血压基因 HRG-1（hypertension related gene 1）的一段编码序列（32 bp）作为阴性对照，不含
DNA 序列的碳酸后缓冲液作为空白对照，HRG 序列与梨 S 基因 PCR 特异片段几乎没有同源性，可
以用来估计非特异性杂交的程度，阵列中其它任何杂交点的信号强度如果不显著高于阴性对照和空
白对照，则可视为该杂交点没有结合荧光 PCR 特异片段。以上对照可以在芯片检测过程中很好地监
控芯片杂交质量，以消除芯片检测过程中的试验偏差。
利用制备的 S-RNase 基因检测芯片鉴定了 27 个梨地方品种或育成品种的 S 基因型，其中兴山
19 号、兴山 26 号、罗田冬梨、梨园麻子梨、大理胭脂梨阵列中均只有一个 S-RNase 基因探针的杂
交信号，兴山 20 号无杂交信号，其他 21 个砂梨品种或野生个体均包含两个不同的 S 基因。罗田冬
梨 PF/PR 扩增均有两条明显的 S 基因特异条带，长度为 966 bp/434 bp 左右，可断定未知的 S 基因是
新的 S 基因或为没集中于芯片阵列中的西洋梨 S 等位基因。兴山 19 号、兴山 20 号、兴山 26 号、大
10 期 江 南等：利用基因芯片鉴定梨品种自交不亲和基因型 1991

理胭脂梨、梨园麻子梨 PF/PR 扩增均为单带，这些品种的 S 基因型存在以下情况，其一为纯合体，
含有两个相同的 S 基因；其二包含尚未发现的新的 S 基因；其三含有的另一个 S 基因为西洋梨中的
S 等位基因。对品种中芯片杂交未能鉴定的 S 基因，辅助以 PF/PR 扩增的特异片段进行酶切或测序
的方法最终将各品种 S 基因型成功鉴定。
弥渡玉梨 PF/PR 扩增 S 基因特异条带为双带，图 4 中 23 号杂交信号显示其包含 S12、S36、S19
等 S 等位基因，衡伟等（2008）序列分析表明 S12 与 S36 为同一基因，弥渡玉梨杂交结果证明了此结
论是准确的，所以弥渡玉梨的 S 基因型是 S12S19 或 S19S36，安农 1 号、玉绿 PF/PR 扩增 S 基因特异条
带为单带，图 4 中 13 号（安农 1 号）和 14 号（玉绿）分别在 S7、S17 和 S34，S17、S21和 S34有较好
的杂交信号，张琳（2008）序列分析显示 S17 和 S34 为同一基因，安农 1 号和玉绿的杂交信号与其分
析结论一致，安农 1 号和玉绿的 S 基因型分别为 S7S17 或 S7S34，S17S21或 S21S34，同理，图 4 中 10 号
杂交信号显示金星含有 S17 和 S34，据此可断定金星可能还含有了另一个 S 等位基因 Sx 或为 S17（S34）
纯合体（因本品种第 2 次扩增特异片段回收产物被污染，暂未进一步鉴定）。
通过制备 S-RNase 基因检测芯片成功地鉴定了部分梨品种 S 基因型，显示了利用芯片鉴定梨品
种 S 基因和 S 基因型的快速、准确的检测优势。但从结果分析可以看出，基因芯片只能检测出在梨
品种中已发现的 S 基因，不能鉴定出未发现的 S 基因型，对未发现的 S 基因只能根据杂交信号推测
其在梨品种中存在的可能性，说明利用基因芯片鉴定梨品种 S 基因存在一定的局限性。对梨品种中
存在的新的 S 基因，还需辅以酶切，DNA 测序等技术方进行鉴定，如大理胭脂梨（S22S22）、梨园麻
子梨等（S1S51）等品种中新 S 基因的鉴定；同时基因芯片是用 DNA 序列进行杂交的，如果内含子
的序列不同，杂交信号也会不同，针对此种情况，接下来的研究可补充制作梨 S 基因的 cDNA 芯片，
和梨 S 基因寡核苷酸检测芯片对梨品种进行并行检测，比较分析杂交结果，可以保证利用基因芯片
鉴定梨品种 S 基因型的准确性和可靠性。
后续研究中需对检测过程中不断发现的新的 S 基因设计探针，加入到 S 基因寡核苷酸检测芯片
阵列中，同时制作 S 基因的 cDNA 芯片，可使梨品种 S 基因芯片检测系统日趋完善，更大效率地发
挥芯片快速、准确的检测优势，本研究可望建立一个较完善、高效、快速、准确的梨 S 基因型检测
平台。

References
Castillo C，Takasaki T，Saito T，Norioka S，Nakanishi T. 2002. Cloning of the S8-RNase（S8-allele）of Japanese pear（Pyrus pyrifolia Nakai）.
Plant Biotechnology，19 (1)：1–6.
Deng Jian-jun，Tan Xiao-feng，Bao Mei-rong，Wuyun Ta-na，Zhang Lin，Cao Yu-fen. 2010. S-genotypes of 11 Chinese pear cultivars. Journal of
Central South University of Forestry & Technology，30 (3)：63–66. (in Chinese)
邓建军，谭晓风，包梅荣，乌云塔娜，张 琳，曹玉芬. 2010. 11 个中国梨品种 S 基因型的鉴定. 中南林业科技大学学报，30 (3)：
63–66.
Heng Wei，Zhang Shao-ling，Fang Cheng-quan，Wu Hua-qing，Wu Jun. 2008. Identification of 20 S-genotypes and cloning novel S-RNases in Pyrus.
Acta Horticulturae Sinica，35 (3)：313–318. (in Chinese)
衡 伟，张绍铃，方成泉，吴华清，吴 俊. 2008. 梨 20 个品种 S 基因型的鉴定及新 S-RNases 基因的克隆. 园艺学报，35 (3)：313–318.
Ishimizu T，Inoue K，Shimonaka M，Saito T，Terai O，Norilka S. 1999. PCR-based method for identifying the S-genotypes of Japanese pear cultivars.
Theor Appl Genel，98 (6–7)：961–967.
Ishimizu T，Sato Y，Saito T，Yoshimura Y，Norioka S，Nakanishi T，Sakiyama F. 1996. Identification and partial amino acid sequenes of seven
S-RNase associated with self-incompatibility of Japanese pear，Pyrus pyrifolia Nakai. Journal of Biochemistry，120 (2)：326–334.
Jiang Nan，Tan Xiao-feng. 2007. Identification technology for pear cultivar S-genotype based on genechip. Journal of Central South University of
Forestry & Technology：Natural Science，27 (1)：104–108. (in Chinese)
1992 园 艺 学 报 41 卷
江 南，谭晓风. 2007. 基于基因芯片的梨品种 S 基因型鉴定的技术方法. 中南林业科技大学学报：自然科学版，27 (1)：104–108.
Jiang Nan，Tan Xiao-feng，Chen Hong，Wang Xiu-li，Zhang Lin，Zeng Yan-ling. 2008. Preparation of prototype S-RNase microarray and molecule
hybridization condition. Acta Horticulturae Sinica，35 (4)：481–486. (in Chinese)
江 南，谭晓风，陈 洪，王秀利，张 琳，曾艳玲. 2008. 梨 S 基因芯片的试制及分子杂交条件的优化. 园艺学报，35 (4)：481–486.
Jiang Nan，Tan Xiao-feng. 2012. Design of oligo nucleotide probes on detection genechip of pear S-RNase. Nonwood Forest Research，30 (3)：
1–5. (in Chinese)
江 南，谭晓风. 2012. 梨 S 基因检测芯片的 OLIGO 探针设计. 经济林研究，30 (3)：1–5.
Kim H T，Hirata Y，Kim H J，Nou I S. 2006. The presence of a new S-RNase allele（S10）in Asian pear[Pyrus pyrifoia（Burm；Nakai）]. Genetic
Resources and Crop Evolution，53 (7)：1375–1383.
Royo J，Kunz C，Kowyama Y，Anderson M，Clarke A E，Newbigin E. 1994. Loss of a histidine residue at the active site of S-locus ribonuclease
is associated with self-compatibility in Lycopersicon peruvianum. Proceedings of the National Academy of Sciences，91 (14)：6511–6514.
Takasaki T，Okada K，Castillo C，Moriya Y，Saito T，Sawamura Y，Nakanishi T. 2004. Sequence of the S9-RNase cDNA and PCR-RFLP system
for discriminating S1 to S9-allele in Japanese pear. Euphytica，135 (2)：157–167.
Tan Xiao-feng，Wuyun Ta-na，Nakanishi T，Li Xiu-gen，Cao Yu-fen，Yang Gu-liang. 2005a. Isolation and identification of S19-RNase gene of the
Pyrus bretschneideri（Chinese pear）. Journal of Central South Forestry University，25 (1)：1–4. (in Chinese)
谭晓风，乌云塔娜，中西テッ，李秀根，曹玉芬，杨谷良. 2005a. 中国梨品种自交不亲和新基因的分离鉴定. 中南林学院学报，25 (1)：1–4.
Tan Xiao-feng，Wuyun Ta-na，Nakanishi T，Li Xiu-gen. 2005b. Identification and sequencing of seven new S-RNase genes from Pyrus pyrifolia.
Journal of Central South Forestry University，25 (4)：1–7. (in Chinese)
谭晓风，乌云塔娜，中西テッ，李秀根. 2005b. 中国砂梨 7 个自交不亲和新基因的分离与测序. 中南林学院学报，25 (4)：1–7.
Tan Xiao-feng，Bi Fang-cheng，Wuyun Ta-na. 2005c. Determination of 9 cultivars’ genotypes and isolation of S29-RNase gene in Pyrus
bretschneideri. Journal of Central South Forestry University，25 (4)：13–16. (in Chinese)
谭晓风，毕方城，乌云塔娜. 2005c. 中国白梨 9 个主栽品种 S 基因型的确定及 S29-RNase 基因的分离鉴定. 中南林学院学报，25 (4)：13–16.
Tan Xiao-feng，Jiang Nan，Zhang Lin，Zeng Yan-ling，Zhang Dang-quan，Chen Hong. 2007. Application of genechip in S-genotyping of pear
cultivars. The 5th International Forum on Post-Genome Technologies（5IFPT），9 (10–11)：62–65.
Wuyun Ta-na，Tan Xiao-feng，Bi Fang-cheng，Li Xiu-gen，Cao Yu-fen. 2005. Determination of 7 cultivars of the S-genotype and identification of two
new allel of self-incompatibility of Pyrus bretschneideri（Chinese pear）. Journal of Central South Forestry University，25 (4)：7–12. (in Chinese)
乌云塔娜，谭晓风，毕方城，李秀根，曹玉芬. 2005. 中国白梨 7 个品种 S 基因型的确定和 2 个新 S 基因的鉴定. 中南林学院学报，25 (4)：
7–12.
Wuyun Ta-na，Tan Xiao-feng，Li Xiu-gen，Cao Yu-fen，Zhang Lin. 2006. Isolation and identification of S12-RNase gene of Pyrus bretschneider.
Scientia Silvae，42 (4)：117–121. (in Chinese)
乌云塔娜，谭晓风，李秀根，曹玉芬，张 琳. 2006. 梨自交不亲和新基因 S12-RNase 的分离鉴定及序列分析. 林业科学，42 (4)：117–121.
Wang Li-xin，Liang Wen-jie，Tan Xiao-feng，Li Xiu-gen，Zhang Lin. 2010. Identification of S-genotypes of six pear cultivars and sequence analyses
of S45-RNase. Journal of Fruit Science，27 (5)：689–693. (in Chinese)
王立新，梁文杰，谭晓风，李秀根，张 琳. 2010. 6 个梨品种 S 基因型鉴定及新基因 S45-RNase 序列分析. 果树学报，27 (5)：689–693.
Zhang Lin. 2008. Identification of S-genotypes of cultivars and cloning of self-incompatibility-associated genes in pear[Ph. D. Dissertation].
Changsha：Central South University of Forestry and Technology. (in Chinese)
张 琳. 2008. 梨品种 S 基因型鉴定及自交不亲和 S 基因的克隆[博士论文]. 长沙：中南林业科技大学.
Zhang Lin，Jia Bao-guang，Zou Feng，Tan Xiao-feng，Liu Min，Song Zhi-bo，Zeng Yan-ling，Jiang Nan，Yuan De-yi. 2014. Sequence characterization
and spatiotemporal expression patterns of PbS26-RNase gene in Chinese white pear（Pyrus bretschneideri）. The Scientific World Journal，
http：//dx.doi.org/10.1155/2014/147061：1–9.
Zhang Lin，Tan Xiao-feng，Wuyun Ta-na. 2007. Identification of new S-RNase genes and S-genotype in two pear species（Pyrus pyrifolia and P.
bretschneideri）grown in China by genomic PCR and pollination tests. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，35 (4)：403–413.
Zhang Lin，Tan Xiao-feng，Zhang Dong-lin，Shen Yan，Yuan De-yi. 2009. Full length cDNA sequence of pear（Pyrus bretschneideri Rehd.）S29-RNase
and S29-allele identification. HortScience，44 (4)：1088.