全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（1）：1–12 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–08–28；修回日期：2011–12–20
基金项目：国家‘863’计划项目（2011AA100204）；现代园艺科学优势学科建设工程专项
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhangzh@njau.edu.cn；zhongrenguo@cnbg.net）
湖北海棠二价融合表达载体 MhT2AC 的构建及
转化烟草耐盐性分析
张计育 1,2，王三红 1，乔玉山 1，渠慎春 1，郭忠仁 2,*，章 镇 1,*
（1 南京农业大学园艺学院，南京 210095；2江苏省中国科学院植物研究所，南京 210014）
摘 要：利用口蹄疫病毒 2A 序列将湖北海棠 MhTGA2 转录因子和几丁质酶基因（Mhchit1）两个抗
病相关基因融合在同一个开放阅读框下，构建二价融合植物双元表达载体，命名为 MhT2AC。将该载体转
化烟草，获得了 8个转基因株系，MhTGA2基因和Mhchit1基因在烟草中共表达，并且转基因株系中NtSOD、
NtAPX 和 NtPPO 等抗逆基因的表达量均加强；转基因烟草 T1 代植株抗盐性增强。
关键词：湖北海棠；二价融合表达载体；MhTGA2 转录因子；几丁质酶基因；耐盐性
中图分类号：S 661 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）01-0001-12

Construction of a Divalent Plant Binary Expression Vector MhT2AC from
Malus hupehensis and Analysis of Salinity Tolerance in the Tobacco
Transformants
ZHANG Ji-yu1,2，WANG San-hong1，QIAO Yu-shan1，QU Shen-chun1，GUO Zhong-ren2,*，and ZHANG
Zhen1,*
（1College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2Institute of Botany，Jiangsu Province
and the Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China）
Abstract：The plant binary expression vector containing the divalent genes of MhTGA2 and Mhchit1
isolated from Malus hupehensis and fused in a single open reading frame（ORF）by Foot and mouth
disease virus （ FMDV ） were constructed. The vector was then introduced into tobacco via
Agrobacterium-mediated. The expression of NtSOD，NtAPX and NtPPO genes were detected and salinity
tolerance was evaluated in the tobacco transformants. The results showed that we successfully constructed
a plant binary expression vector with bivalent fusion and denoted it as MhT2AC. The MhTGA2 gene and
the Mhchit1 gene were co-expression in the transformants. Comparing with the controls，the expression of
NtSOD，NtAPX and NtPPO genes were enhanced in transgenic lines. Moreover，the salinity tolerance of
the T1 transformants were significantly improved.
Key words：Malus hupehensis；MhT2AC；MhTGA2；Mhchit1；salinity tolerance

通过遗传转化提高植物的耐盐性一直是育种学家研究的热点问题。一个优良的性状往往是由多
个基因共同参与才能完成，所以通过遗传转化改良作物品种就需要对多个基因进行转导。目前多基

2 园 艺 学 报 39 卷
因转化法主要有：杂交（Hiatt et al.，1989；Bizily et al.，2000；Chabannes et al.，2001；郭龙彪 等，
2006；段晓光，2008）；重复转化（Jobling et al.，2002；Chan et al.，2005；刘晶 等，2005）；多质
粒共转化（Ye et al.，2000；Zhou et al.，2003）等，这些方法不仅耗时，而且得不到很好的效果。
通过口蹄疫病毒 2A 序列构建多价融合植物表达载体，可以一次性的将多个基因同时转化到植物体
内，并且在植物体内共表达，对于通过多基因转化技术培育新种质具有一定的理论和指导意义。
口蹄疫病毒 2A 序列为 19 个氨基酸，氨基酸序列为 LLNFDLLKLAGDVESN PGP，由 2A 连接
的多基因，发生“切割”的位置在 C 末端 18 位甘氨酸 G 和 19 位脯氨酸 P 之间。已有研究表明：通
过 2A 序列融合多基因在一个开放阅读框下，可以在植物等真核生物中共表达，发挥其各自基因的
功能作用（Ryan & Drew，1994；Mattion et al.，1996；Santa et al.，1996；Halpin et al.，1999；Amrani
et al.，2004；Wang et al.，2007）。Ryan 和 Drew（1994）用口蹄疫病毒 2A 序列连接报告基因氯霉
素乙酰转移酶基因 CAT 和 GUS 基因于一个开放阅读框中，在兔网织红细胞和人的 HTK-143 体外翻
译系统中发生剪切，将多聚蛋白剪切成 CAT-2A 和 GUS 两个蛋白。王三红（2007）将甜菜碱合成
相关的两个基因胆碱脱氢酶和甜菜碱醛脱氢酶通过 2A 序列构建到一个开放阅读框下面，并且在酵
母中进行表达，融合蛋白切割为两个独立蛋白。
TGA 转录因子是一类含碱性 DNA 结合结构域（basic DNA-binding domain）和亮氨酸拉链结构
域（leueine zipper domain），可以结合到 PR-1 基因启动子应答性 SA 的 as-l（activation sequence l）
顺式作用元件相结合，调控含 as-l 基因表达的 bZIP 类转录因子（Xiang et al.，1996）。另外，大量
研究表明 bZIP 类转录因子具有抗盐、抗渗透、抗病等多种功能（Stankovic et al.，2000；Kim et al.，
2002；Lee et al.，2006；Nijhawan et al.，2008）。几丁质酶作为病程相关蛋白的一种，存在于植物
和微生物中，为单基因编码，具有降解真菌细胞壁的作用，并且在抑制真菌生长过程中抗真菌作用。
目前已有 10 多种植物用几丁质酶基因进行了转化研究，如烟草、黄瓜、番茄、马铃薯、苹果、玫
瑰、小麦、水稻、胡萝卜、芸薹、花生、甜菜、大豆等，这些转基因植物对盐害、干旱、真菌病害
等具有一定的抗性（张志忠 等，2005）。
本研究中以湖北海棠为材料，在已经成功分离了湖北海棠 MhTGA2 转录因子和 Mhchit1 基因
（Zhang et al.，2011）的基础上，分别在其开放阅读框的两边设计含有限制性酶切位点的基因特异
引物，通过 RT-PCR 技术克隆其基因全编码区；以 pMD19-T 克隆载体为中间载体，首先对其进行
含有 2A 序列的多酶切位点改造，然后将 MhTGA2 基因和 Mhchit1 基因依次连接到该载体上，最后
将 MhTGA2 基因、2A 序列和 Mhchit1 基因一起酶切连接到植物双元表达载体上；构建二价融合植
物双元表达载体，通过农杆菌介导法转化烟草，并通过 PCR 和 RT-PCR 技术对其抗性株系进行检测；
通过荧光定量 RT-PCR 技术分析转基因株系中 NtSOD、NtAPX、NtPPO 等基因的表达情况，并对其
耐盐性进行了分析。旨在为二价或多价基因融合表达载体的构建提供技术支持，同时为进一步通过
转基因研究基因的功能和培育耐盐新种质奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料、菌株及酶等主要分子试剂
湖北海棠组培苗和烟草（K326）种子由本实验室保存。试验于 2009 年 2 月—2011 年 2 月在南
京农业大学园艺学院果树生物技术实验室完成。
工程菌 Escherichia coli DH5α、真核表达载体 pCAMBIA-S1300+及其宿主 EHA105 为本实验室
保存。T/A 克隆载体 pMD19-T 和 pMD19-T simple，限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、rTaq DNA 聚
1 期 张计育等：湖北海棠二价融合表达载体 MhT2AC 的构建及转化烟草耐盐性分析 3

合酶均购于大连宝生物公司。
1.2 引物以及 2A 序列的合成
根据已经克隆的湖北海棠 TGA2 转录因子（GeneBank 登录号：FJ598138）和几丁质酶基因
（Mhchit1，GenBank 登录号：FJ422811）全长序列，利用生物信息学软件 Bioxm2.6 分析两个基因
的限制性酶切位点，并根据 T/A 克隆载体 pMD19-T 和植物表达载体 pCAMBIA-S1300+的特点，在
MhTGA2 转录因子和 Mhchit1 ORF 两端分别设计含有酶切位点的基因特异引物（表 1）。分析合成
含有口蹄疫病毒 2A 序列的多酶切位点序列，命名为 Mh2A，序列为：TTA TCT AGA ACT AGT CCG
CGG GGA TCC CAG CTG TTG AAT TTT GAC CTT CTT AAG CTT GCG GGA GAC GTC GAG
TCC AAC CCC ACG CGT CGA TCG TAC GTA GGT ACC GAG CTC（Xba +Ⅰ Spe + Ⅰ SacⅡ+
BamH + 2A + Ⅰ Mlu +Ⅰ Pvu + Ⅰ Kpn + Ⅰ SacⅠ，下划线部分为 2A 序列），该序列由南京金丝特科技
有限公司合成。

表 1 试验用引物
Table 1 Primers for this experiment
引物名称
Primer name
序列（5′–3′）
Sequence
大小/bp
Size
用途
Usage
TGF1 ACTAGTCATGGCTGATGGC
TGR1 AACGGATCCCTCTCTTGG
1 015 MhTGA2 基因的分离
Isolation of MhTGA2
CHF1 ACGCGTATGAAGTTGCAAGCT
CHR1 GGTACCTTAGGCAAAAGGCCTTTGATT
963 Mhchit1 基因的分离
Isolation of Mhchit1
ZTGF1 GGCAGGAAGAGCACAATCG
ZTGR1 ACTGGCGGGTTGTCAAGATAC
549 转基因烟草中 MhTGA2 基因的检测
Detection of MhTGA2 in transgenic tobacco
ZCHF1 CGTATGTCCAAATGGGCTGTG
ZCHR1 CCCTATCATCCTGACCCTTGC
767 转基因烟草中 Mhchit1 基因的检测
Detection of Mhchit1 in transgenic tobacco
PPO F1： TGGAGGATATTGGGTTGGAAGATG
PPO R1： ACACACTGCGTTCAGATAATTTGG
159 荧光定量 PCR 分析
Real-time quantitative PCR
APXF1： GCTCTCCTCTCTGATCCTGCTTTC
APXR1： CACTCCCAACTCTTCCTCCTATCG
159 荧光定量 PCR 分析
Real-time quantitative PCR
SODF1 CCATTACCGACAAGCAGATTCCTC
SODR1 CAACCCTTCCACCAGCATTTCC
141 荧光定量 PCR 分析
Real-time quantitative PCR
TubulinF1 AGATGTTCCGTCGTGTCAGTG 200 荧光定量 PCR 分析
TubulinR1 TGCTTCCTCTTCATCCTCATATCC Real-time quantitative PCR
注：斜体部分表示限制性酶切位点；阴影部分表示起始密码子和终止密码子。
Note：Italic letters represent the restriction enzyme sites；The Shaded letters represent the start codon and stop codon.

1.3 湖北海棠 MhTGA2 和 Mhchit1 基因 ORF 的扩增
本课题组成功构建了水杨酸处理后的湖北海棠组培苗叶片全长 cDNA 文库（张计育 等，2010）。
从该文库中，克隆了湖北海棠 MhTGA2 和 Mhchit1 ORF。
PCR 扩增体系为：稀释 10 倍的全长 cDNA 文库模板 1 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL；MgCl2 1.5 μL；
上下游引物各 1 μL，rTaq 酶 0.2 μL，最后用灭菌的 ddH2O 补足至 25 μL。
反应条件均为：94 ℃预变性 4 min；94 ℃ 30 s，MhTGA2 和 Mhchit1 的退火温度分别为 57 ℃和
59 ℃，时间 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。
在 1.2%（质量体积比）的琼脂糖凝胶上电泳检测 PCR 产物，回收目的片段并连接到 pMD19-T
simple 载体上，转化 DH5α 感受态细胞，随机筛选白色菌落，进行测序。将测序正确的菌液提取质
粒，用于载体构建。
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1.4 中间融合载体和植物二价融合表达载体的构建
pMD19-T 载体多克隆位点的改造：利用含有酶切位点的克隆载体 pMD19-T 作为中间载体，并
对其进行含有 2A 序列的多克隆位点改造，将 Mh2A 和 pMD19-T 分别进行 XbaⅠ和 SacⅠ双酶切，
酶切结束后进行目的片段的回收，连接，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，随机筛选白色菌落，进
行摇菌，提质粒，酶切鉴定，命名为 P2A。
将 P2A 和 MhTGA2 分别进行 SpeⅠ和 BamHⅠ双酶切，目的片段回收，连接，转化大肠杆菌
DH5α 感受态细胞，进行菌液 PCR 鉴定和酶切鉴定。将正确的质粒命名为 TP2A。将 TP2A 和 Mhchit1
分别进行 MluⅠ和 KpnⅠ双酶切，同样进行目的片段的回收，连接，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细
胞，进行菌液 PCR 鉴定和酶切鉴定。并且同时利用 SpeⅠ和 KpnⅠ双酶切鉴定，将酶切鉴定结果正
确的质粒进行测序，命名为 TP2AC。
植物二价融合表达载体的构建：pCAMBIA-S1300 + 表达载体的改造同 pMD19-T 载体多克隆位
点的改造。将改造好的 pCAMBIA-S1300 + 表达载体和中间载体 TP2AC 分别进行 SpeⅠ和 KpnⅠ双
酶切，然后将目的片段回收，连接转化 DH5α 感受态细胞，对其阳性菌株进行菌液 PCR 鉴定和酶切
鉴定。并将酶切鉴定结果正确的质粒进行测序。正确的质粒命名为 MhT2AC。
1.5 农杆菌介导二价双元表达载体转化烟草
二价双元融合表达载体转化农杆菌 EHA105 采用 CaCl2 法，并将阳性克隆进行菌液 PCR 验证和
酶切验证，并且将酶切验证成功的质粒再次进行测序，以确保序列的准确性。农杆菌介导二价植物
双元表达载体转化烟草。具体步骤参考王三红（2007）的方法。
1.6 抗性 hyg 植株的分子检测
采用佟兆国等（2008）的方法提取潮霉素抗性烟草试管苗的基因组 DNA，以质粒 pCAMBIA-
S1300-T2AC 为阳性对照进行目的基因 MhTGA2 和 Mhchit1 PCR 扩增，引物见表 1。
PCR 的反应体系为：模板 1 μL、上下游引物各 1 μL、10 × PCR buffer 2.5 μL、MgCl2 1.5 μL、
dNTP 1.6 μL、rTaq 0.125 μL，最后用 H2O 补足至 25 μL。反应参数为：94 4℃ min；94 ℃ 30 s，53
℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。取 10 μL PCR 扩增产物于 1.2%（质量体
积比）的琼脂糖凝胶上电泳检测。
采用蔡斌华等（2008）的方法提取 PCR 检测阳性的烟草试管苗总 RNA，用 DNA 酶消化 RNA
中少量的 DNA，用 M-MLV 反转录酶进行反转录，反转录反应体系和反应程序参考说明书的方法进
行。
目的基因 MhTGA2 和 Mhchit1 RT-PCR 扩增的反应体系和反应程序同 PCR 检测。
1.7 转基因株系的 NtSOD、NtPPO、NtAPX 基因荧光定量 PCR 分析
在 8 个转基因阳性株系中随机挑取 3 个株系，以 Tubulin 作为内参，对其 NtSOD、NtAPX、NtPPO
等和抗病相关基因进行荧光定量表达特性的分析。荧光定量 PCR 反应在 Applied Biosystems 7300
Real Time PCR System 仪器上进行，引物信息见表 1。
具体的反应体系为：1 μL 稀释 10 × cDNA，上下游引物各 0.3 μL，10 μL SYBR® Premix Ex Taq™
（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR041A）8.4 μL ddH2O。PCR 反应程序为：95 ℃ 4 min；
95 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，40 个循环；数据分析采用 7300 system 软件和 2–△△CT方法（Livak
& Schmittgen，2001）。
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1.8 转基因烟草的耐盐性分析
将 T0 代的转基因烟草自交后，收取种子。将 T1 种子和非转基因（WT）种子播种在 1/2MS 培养
基上，待其将要发出第一片真叶时，将小苗根部剪掉，接种在附加不同浓度 NaCl（0.5%和 1.0%，
质量体积比）的 1/2MS 培养基上，分别于 7 d 和 14 d 后统计生根率，并对其进行拍照记录。每个株
系 10 棵苗左右，重复 3 次。
利用 SPSS17.0 软件进行差异显著性分析（P < 0.01）。
2 结果与分析
2.1 MhTGA2 和 Mhchit1 基因 ORF 的 PCR 扩增
根据已经克隆的 MhTGA2 和 Mhchit1 基因的 cDNA 序列，并结合载体本身的酶切位点，设计含
有酶切位点的引物（表 1）。
通过 RT-PCR 技术从 SA 处理的湖北海棠 cDNA 文库中分别扩增到了 MhTGA2 和 Mhchit1 基因
预期的目的条带（图 1），并将目的条带经回收、克隆、测序，分别得到了 1 015 bp 和 963 bp 的序
列，并将序列与本实验室所克隆的相应的基因进行比对，序列同源性均达到 100%，表明已经成功
的克隆了 MhTGA2 和 Mhchit1 基因的 ORF 序列，可以用于后续载体的构建。


图 1 湖北海棠 MhTGA2（A）和 Mhchit1（B）基因 ORF PCR 扩增
Fig. 1 PCR amplification for MhTGA2（A）and Mhchit1（B）ORF from Malus hupehensis
M：DL2000 plus marker.

2.2 二价双元表达载体的构建
利用口蹄疫病毒 2A 序列在真核细胞内该寡肽在 C 末端的氨基酸 G 和 P 处发生“切割”的特点，
将从湖北海棠中克隆的 MhTGA2 和 Mhchit1 两个抗病相关基因融合在一个 ORF 内，构建二价植物双
元表达载体，使之在植物体内共表达，载体构建流程图见图 2。
本研究中选用了 pMD19-T 克隆载体作为中间载体，首先对该载体进行改造，将含有多酶切位
点的 2A 序列连接到载体上，然后将 MhTGA2 和 Mhchit1 这两个基因依次进行酶切连接，确定连接
正确后，将 MhTGA2 基因序列、2A 序列和 Mhchit1 基因序列进行酶切（图 3，A），然后连接到
pCAMBIA-S1300 + 植物双元表达载体上，并进行菌液 PCR 验证和酶切验证（图 3，B），将酶切
验证正确的载体进行测序（图 4），并将测序结果正确的载体命名为 MhT2AC。
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图 2 MhT2AC 二价融合植物双元表达载体构建流程图
pMD19-T 克隆载体； pMD19-T simple 克隆载体； pCAMBIA-S1300 + 表达载体。
Fig. 2 Construction flow chart of MhT2AC bivalent fusion plant binary expression vector
pMD19-T clone vector； pMD19-T simple clone vector； pCAMBIA-S1300+ expression vector.
a：Xba + Ⅰ BamHⅠ+ SmalⅠ+ KpnⅠ+ SacⅠ；b：XbaⅠ+SpeⅠ + SacⅡ+ BamHⅠ + 2A + MluⅠ +PvuⅠ +ApaⅠ+ Eae Ⅰ+
BssH Ⅱ+SnaBⅠ+ KpnⅠ+ Sac Ⅰ；c：XbaⅠ+SpeⅠ + MhTGA2 + BamHⅠ + 2A + MluⅠ+PvuⅠ +ApaⅠ+
EaeⅠ + BssH Ⅱ+SnaBⅠ+ KpnⅠ+ Sac Ⅰ；d：XbaⅠ +SpeⅠ+ MhTGA2 + BamHⅠ+ 2A +
MluⅠ + Mhchit1 + KpnⅠ+ Sac Ⅰ；e：XbaⅠ+ HindⅢ+ PstⅠ+ ApalⅠ+
SmalⅠ+ SalⅠ+ SwaⅠ+ SpeⅠ+ kpnⅠ+ sacⅠ。

图 3 MhT2AC 载体构建酶切验证
M1：DL2000 plus marker；1：中间载体 SpeⅠ和 KpnⅠ双酶切；M2：DL 15000 marker；
2：二价植物双元表达载体 SpeⅠ和 KpnⅠ双酶切验证。
Fig. 3 Double digestion identification for MhT2AC vector construction
M1：DL2000 plus marker；1：Identification of the transitional plasmid by digestion with SpeⅠand KpnⅠ；M2：DL 15000 marker；
2：Identification of MhT2AC plant expression vector plasmid by digested with SpeⅠand KpnⅠ.
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图 4 融合基因 MhTGA2-2A-Mhchit1 核苷酸和推导的氨基酸序列
斜体部分为限制性酶切位点；阴影部分为 2A 序列。
Fig. 4 Nucleotide acid and deduced amino acid sequences of the fused genes MhTGA2-2A-Mhchit1
Italic letters represent the restriction enzyme sites；The letters underlined represent 2A sequence.

2.3 转基因烟草株系的获得
将构建成功的二价植物双元表达载体通过 CaCl2 法转化农杆菌 EHA105，并进行菌液 PCR、酶
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切和测序验证，确保了序列的准确性。通过农杆菌介导法转化烟草，并利用 PCR 和 RT-PCR 技术对
其抗潮霉素株系进行检测，检测结果见图 5。
在所检测的 8 个转基因株系中均可以扩增到预期大小的目的片段。并且通过 RT-PCR 试验表明，
MhTGA2 和 Mhchit1 这两个基因均可以在烟草植株体内共表达。


图 5 转基因烟草株系的 PCR 和 RT-PCR 检测
A：MhTGA2 基因的 PCR 检测；B：Mhchit1 基因的 PCR 检测；C：MhTGA2 基因的 RT-PCR 检测；
D：Mhchit1 基因的 RT-PCR 检测；M：DL2000 plus Marker；T1 ~ T8：转基因株系；
WT：非转基因株系；P：MhT2AC 质粒。
Fig. 5 PCR and RT-PCR detection of transgenic tobacco plants
A：PCR detection of MhTGA2；B：PCR detection of Mhchit1；C：RT-PCR detection of MhTGA2；
D：RT-PCR detection of Mhchit1；M：DL2000 plus marker；T1–T8：Transgenic
tobacco plants；WT：Non-transgenic tobacco plant；
P：MhT2AC plasmid.

2.4 转基因株系中抗逆相关基因的表达分析
以非转基因株系 WT 为对照，在 8 个转基因株系中选取 T1、T2、T3 进行 NtSOD、NtPPO、NtAPX
等抗病相关基因酶的荧光定量 RT-PCR 分析（图 6）。结果表明：与野生型非转基因株系相比，转
基因株系中的 NtSOD、NtPPO、NtAPX 的表达量增加，其中 NtPPO 的表达量增加最大，其次是 NtAPX，
NtSOD 的表达量增加最小。说明在转基因烟草株系中，过量表达湖北海棠 MhTGA2 和 Mhchit1 基因
可以提高 NtSOD、NtPPO、NtAPX 等抗病相关基因的表达量。

图 6 利用荧光定量 RT-PCR 技术分析转基因株系中 NtSOD、NtPPO 和 NtAPX 基因的表达量
WT：非转基因株系；T1 ~ T3：转基因株系。
Fig. 6 Expression level of NtSOD，NtPPO and NtAPX in transgenic tobacco plants
using real-time quantitative RT-PCR assay
WT：Non-transgenic tobacco plant；T1–T3：Transgenic tobacco plants.

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2.5 转基因烟草株系耐盐性提高
转基因烟草株系 T1 代与非转基因株系小苗接种在含有 0.5%NaCl 的 1/2MS 培养基上，7 和 14 d
后，转基因烟草株系（T1、T2 和 T3）的生长情况好于非转基因株系（图 7），并且生根率显著高
于非转基因烟草株系（图 8）。当 NaCl 的浓度增加到 1.0%时，14 d 后，非转基因株系几乎全部黄
化，很少长出真叶，但是，转基因株系几乎全部长出第 1 或第 2 片真叶，并且保持绿色（图 7），
同时，转基因烟草的生根率显著高于非转基因（图 8）。

图 7 转基因烟草的抗盐性分析（14 d）
WT：非转基因株系；T1 ~ T3：转基因株系。
Fig. 7 Salt resistance analysis of transgenic tobacco plants（14 d）
WT：Non-transgenic tobacco plant；T1–T3：Transgenic tobacco plants.

图 8 NaCl 处理条件下转基因烟草生根率分析
WT：非转基因株系；T1 ~ T3：转基因株系。（P < 0.01）。
Fig. 8 Roots generation ratio analysis under NaCl treatment
WT：Non-transgenic tobacco plant；T1–T3：Transgenic tobacco plants. （P < 0.01）.
3 讨论
利用 2A 序列构建二价或者多价融合表达载体可以一次性的将多个目的基因转化到目标受体系
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统，实现多基因遗传转化。在一些植物表达载体系统中，由于载体本身含有抗性和筛选标记基因，
所以载体很大，载体长度越长，装载能力越小。作者曾尝试将 MhTGA2 和 Mhchit1 这两个目的基因
依次连接到植物双元表达载体 pCAMBIA-S1300 +（约 15 kb），经过菌液 PCR 和酶切验证，第 1 个
基因可以成功的装载到植物表达载体上，但是第 2 个基因转化失败。所以本试验中，利用 pMD19-T
克隆载体为中间载体，该载体本身较短，约 2.6 kb，转载能力较强。首先对其进行含有 2A 序列的多
酶切位点进行改造，然后将 MhTGA2 基因和 Mhchit1 基因依次连接到该载体上，分别经菌液 PCR 验
证和酶切验证，表明 MhTGA2 基因和 Mhchit1 基因已经成功的连接到了中间载体上。最后将 MhTGA2
基因、2A 序列和 Mhchit1 基因一起酶切连接到植物双元表达载体上，初步验证成功的构建了二价植
物融合表达载体。然后将该载体通过农杆菌介导法转化烟草，通过 PCR 和 RT-PCR 验证表明 MhTGA2
基因和 Mhchit1 基因已经成功的转化到烟草中并共表达。进一步验证了二价植物融合表达载体构建
成功，对今后通过多基因遗传转化改良品种具有重要意义。
植物在正常的生长和发育过程中，活性氧（ROS）的积累和消除处于动态平衡过程中。但是，
当植物面临恶劣的环境条件（如干旱、寒冷、高盐、病虫害等），这种平衡就会被打破，体内 ROS
的含量就会大幅度的增加，对植物造成很大的伤害（Apel & Hirt，2004；Bartoli et al.，2004）。细胞
抗氧化剂，包括非酶和酶类氧化剂在植物抵抗由于活性氧造成的伤害过程中是非常关键的。SOD 与
APX 活性的平衡对于细胞内超氧化物阴离子及过氧化氢浓度的稳定具有重要作用，在逆境条件下，
植物中表达这两种酶可以减少过氧化氢的含量（Mitter，2002）。SOD 在清除植物体内活性氧起着关
键的作用，可以酶解超氧阴离子成为 H2O2。随后，APX 将过氧化氢降解（Apel & Hirt，2004）。Sunkar
等（2006）研究表明转基因拟南芥过量表达 SOD 可以提高氧化胁迫的抗性。Sarowar 等（2005）认
为烟草中过量表达 APX 可以提高对病原菌和氧化胁迫的抗性。已有研究表明：在逆境条件下，转基
因烟草过量表达 ThbZIP1 蛋白可以提高 POD、SOD 的活性，增加可溶性糖和可溶性蛋白的含量，
提高抗盐性。过量表达 CAbZIP1 拟南芥通过调控降解酶，如 POD 和 CAT 消除植物的活性氧，提高
对逆境的抗性（Karpinski et al.，2001；Murgia et al.，2004）。另外，植物在逆境条件下过量表达
bZIP 类蛋白类可以通过提高植物的光合能力，从而提高植物对盐和冷（Liao et al.，2008）、甲基紫
精（Lee et al.，2006）、干旱、热等各种胁迫抗性（Zhang et al.，2008）。TGA 转录因子中含有 bZIP
结构域，属于 bZIP 类转录因子 D 类亚家族（Jakoby et al.，2002）。在本研究中过量表达抗病相关
基因 MhTGA2 和 Mhchit1 基因提高了 NtSOD、NtAPX 和 NtPPO 等基因的表达量，并且转基因烟草
耐盐性得到了提高。
综上所述，转基因烟草株系通过调控 NtSOD、NtAPX 和 NtPPO 等基因的表达量，从而提高植
株的耐盐性。

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