全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（11）：2222–2228 http：// www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail：yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–05–20；修回日期：2013–09–22
基金项目：浙江省科技计划面上项目（2008C22002）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：weidongguo68@yahoo.com）
佛手种质资源遗传多样性的 ISSR 分析
廖芳蕾，陈民管，桑 丹，陈文荣，郭卫东*
（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004）
摘 要：收集佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）13 份、枸橙（C. medica var. yunnanensis
Ding）1 份及香椽（C. medica L.）6 份，共 20 份种质资源，其中 14 份成功引种在佛手资源圃。在对其中
14 份资源生物学特性进行描述的基础上，采用 ISSR 分子标记技术对 20 份样品进行遗传多样性分析。筛
选出的 11 条引物共检测到 102 条 DNA 条带，其中 58 条为多态性条带，多态性条带比率为 56.9%。各样
品之间的遗传相似性系数在 0.608 ~ 0.990 之间。聚类分析结果表明，当遗传系数为 0.798 时，可将供试材
料分为枸橙、香橼和佛手 3 个类群，新发现的 3 个芽变材料是佛手中一个新的类群。
关键词：佛手；种质；ISSR；遗传多样性
中图分类号：S 666.9 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）11-2222-07

Genetic Diversity Analysis of Fingered Citron Germplasm by ISSR
LIAO Fang-lei，CHEN Min-guan，SANG Dan，CHEN Wen-rong，and GUO Wei-dong *
（College of Chemistry and Life Sciences in Zhejiang Normal University，Jinhua，Zhejiang 321004，China）
Abstract：Thirteen fingered citron accessions，1 citrate acid orange and 6 citron accessions were
collected and fourteen genotypes were introduced and survived in the germplasm resources garden. Based
on the biological traits，the genetic diversities of 20 samples were evaluated by ISSR markers. A total of
102 DNA bands were amplified from the 11 polymorphic primers，which were screened from 100 ISSR
primers. Among those obtained bands，58 were polymorphic ones，accounting for 56.9% polymorphism.
The genetic similarity coefficient among the accessions ranged from 0.608 to 0.990. At the point of the
similarity coefficient 0.798，all the accessions might be separated into three groups，fingered citron，citrate
acid orange and citron，meanwhile three pieces of Yabian mutants belonged to a new group of fingered
citron.
Key words：fingered citron；germplasm；ISSR；genetic diversity

佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）是芸香科柑橘属植物枸橼（Citrus medica L.）
的变种。中国是枸橼（俗称香橼，佛手的原变种）的起源地之一，美国以及东南亚国家和地区有少
量引种栽培。在中国，佛手栽培地主要分布在浙江、广东、广西、四川、福建、云南等地，在各地
形成了一些各具特色的地方品种（施学武 等，1997；何云芳和金晓玲，2001；周春丽和郭卫东，2003）。
佛手的野生种质类型较少，有限的种质类型仍在散失（张桂芳和徐鸿华，2007）。在生产上，佛手

11 期 廖芳蕾等：佛手种质资源遗传多样性的 ISSR 分析 2223

一般通过扦插及嫁接繁殖（周莹，2009）。长期无性繁殖可能导致佛手基因型趋于单一，造成多样性
缺失（Aydin & Turgut，2012）。各种病原菌易通过无性繁殖传递，从而引起佛手的炭疽病、黑斑病、
溃疡病和煤烟病等（路梅 等，2011）。另外，对佛手种质资源的多样性也缺乏系统的比较和研究，
存在收集的种质数量少、来源范围不广、命名不统一等问题。研究和整理佛手种质资源势在必行。
作者在广泛收集佛手种质资源的基础上，利用 ISSR 分子标记技术对一些地方品种的佛手及近缘种
香橼、枸橙进行遗传多样性分析，对佛手种质资源的保存选育和可持续开发利用具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
以 2010—2011 年在国内广泛收集到的共 20 个佛手及香橼资源为试材（表 1），每个样品分别提
取 DNA，用于 ISSR 分析。

表 1 收集的佛手种质资源
Table 1 Fingered citron germplasm resources
编号
Code
种类
Species
样品
Material
采集地
Sampling spot
1 佛手 芽变 1 号 Yabian 1 浙江金华 Jinhua，Zhejiang
2 Citrus medica L. var. sarcodactylis 芽变 2 号 Yabian 2 浙江金华 Jinhua，Zhejiang
3 Swingle 芽变 3 号 Yabian 3 浙江金华 Jinhua，Zhejiang
4 青皮佛手 Qingpi 浙江金华 Jinhua，Zhejiang
5 矮化佛手 Aihua 浙江金华 Jinhua，Zhejiang
6 红花小种 Honghua Xiaozhong 浙江金华 Jinhua，Zhejiang
7 广佛手 Guangdongenenis 广东广州 Guangzhou，Guangdong
8 云佛手 1 号 Yunnanensis 1 云南巍山 Weishan，Yunnan
9 云佛手 2 号 Yunnanensis 2 云南巍山 Weishan，Yunnan
10 川佛手 Sichuanensis 四川乐山 Leshan，Sichuan
11 马鞍山佛手 Maanshan 云南巍山 Weishan，Yunnan
12 爪佛手 Zhua 云南巍山 Weishan，Yunnan
13 章鱼佛手 Zhangyu 云南巍山 Weishan，Yunnan
14 枸橙 C. medica var. yunnanensis Ding 枸橙 Jucheng 云南巍山 Weishan，Yunnan
15 香橼 Citrus medica L. 野生香橼 1 号 Yesheng 1 云南昆明 Kunming，Yunnan
16 野生香橼 2 号 Yesheng 2 云南昆明 Kunming，Yunnan
17 长果香橼 Changguo 云南德宏 Dehong，Yunnan
18 圆果香橼 Yuanguo 云南德宏 Dehong，Yunnan
19 酸心香橼 Suanxin 云南巍山 Weishan，Yunnan
20 甜心香橼 Tianxin 云南巍山 Weishan，Yunnan

1.2 ISSR-PCR 扩增
参照冷欣等（2005）改良的 CTAB 法提取各样品叶片基因组 DNA。用紫外分光光度法和琼脂糖
电泳法检测 DNA 质量，稀释至 50 ng · μL-1，–20 ℃保存备用。
参照王俊平（2007）报道的关于佛手 ISSR-PCR 扩增体系，验证优化后，反应体系为 25 μL，其
中 DNA 模板浓度 2.0 ng · μL-1，引物浓度 0.4 μmol · L-1，dNTPs 浓度 0.2 mmol · L-1，Taq 酶浓度 0.06
U · μL-1，1× Buffer（含 Mg2+）。PCR 反应在 Bio-Rad Thermal My Cycler 梯度 PCR 仪上进行，反应
程序如下：94 ℃预变性 5 min，之后进行 35 个循环：94 ℃变性 1 min，50 ~ 52 ℃（退火温度根据引
物的 Tm值变化 1 ~ 5 ℃）复性 40 s，72 ℃延伸 1 min，循环结束后于 72 ℃延伸 8 min。
对 100 个 ISSR 引物（根据加拿大 British Columbia 大学公布的 ISSR 引物序列，由上海生工生
物技术公司合成）进行筛选，选择扩增条带清晰、重复性好、可获得 4 个以上扩增片段的引物作为
候选引物，共 11 个。PCR 产物经 2%琼脂糖（西班牙 Biowest 公司）凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，
2224 园 艺 学 报 40 卷
电泳缓冲液为 1× TAE，采用 Bio-Rad Universal holdⅡ凝胶成像分析仪进行图像处理，保存。
1.3 数据分析
根据各分子标记在相同电泳迁移率的有无统计得到所有位点的数据，分别记录为 1（有）或 0
（无），形成数据矩阵。利用 NTSYSpc（2.10）软件进行分析（Rohlf，1998），用 UPGMA 法（非加
权配对算术平均法）对所有样品进行聚类分析，构建亲缘关系聚类图。
2 结果与分析
2.1 佛手种质资源圃的建立
至今共收集了 20 份来自云南、四川、浙江、广东等不同地理分布的佛手种质资源（表 1），并
在浙江省金华市浙江师范大学科研基地建立了佛手种质资源圃，其中 14 份资源利用嫁接方法引种成
功，其余 6 份未能成活。资源圃内地处 29°07′N，119°39′E，属亚热带季风气候，年平均气温 17.9 ℃。
年降水量在 1 604 mm，年平均日照时数 2 062 h，无霜期 263 d。
2.2 资源圃内佛手资源的基本性状
芽变 1 号：植株形态类似于青皮佛手；成熟果实金黄色，果实先端有裂纹，但未开裂成指状（图
1，1）。
芽变 2 号：植株形态类似于青皮佛手；成熟果实为金黄色，同一植株上有两种形态的果实，其
中一种为先端有裂纹，并略微张开，但并未呈指状伸出，而另一种果实与芽变 1 号类似（图 1，2）。
芽变 3 号：植株形态与青皮佛手类似；叶片大小中等，成熟果实为金黄色，果实先端裂开呈两
轮指状伸出（图 1，3）。
青皮佛手：分枝多，嫩茎绿色，老枝青灰色，枝多刺；叶片大并且肥厚，先端钝圆；成熟果实
金黄色，果型大，果实性状多指状开放（图 1，4）。
矮化佛手：树冠小，紧凑；分枝多，节间短，刺少；叶片小而厚，密生；果实短小，果实先端
裂痕明显而深，果先端开放或闭合指状（图 1，5）。
红花小种：株型较小；叶片中等而薄；花色淡红；成熟果实为金黄色，果型中等，果实基部有
裂纹，并由指状伸出（图 1，6）。
广佛手：树体较大；分枝较多，多刺；叶片宽大肥厚；果型大，果实顶端指状闭合如拳（图 1，7）。
云佛手 1 号：树体较为高大；刺较长；叶片大肥厚，叶表面光滑（图 1，8）。由于在金华地区
栽培时间较短，尚未结果。
云佛手 2 号：树体矮小；叶片小，较长（图 1，9）。由于在金华地区栽培时间较短，尚未结果。
川佛手：树体较为高大；多刺；叶片宽大肥厚（图 1，10）。由于在金华地区栽培时间较短，尚
未结果。
章鱼佛手（青华佛手）：叶片中等偏大，绿色，叶表面光滑。由于在金华地区栽培时间较短，尚
未结果。
枸橙：叶片小而薄，绿色，表面光滑，先端钝圆；果实椭圆形（图 1，14）。由于在金华地区栽
培时间较短，尚未结果。
酸心香橼：枝条多刺，且刺长；叶片大而肥厚，果实较小（图 1，19）。由于在金华地区栽培时
间较短，尚未结果。
甜心香橼（图 1，20）：叶片大而肥厚，由于在金华地区栽培时间较短，尚未结果。
11 期 廖芳蕾等：佛手种质资源遗传多样性的 ISSR 分析 2225


图 1 部分佛手资源的基本性状
图上各数字代表材料详见表 1。
Fig. 1 Basic character of fingered citron germplasm
The codes represent the materials on the figure shown in Table 1.
2226 园 艺 学 报 40 卷
2.3 ISSR 扩增多态态性
从 100 条 ISSR 引物筛选得到的 11 条引物：UBC809、UBC810、UBC 818、UBC 835、UBC 847、
UBC 848、UBC 851、UBC 855、UBC 864、UBC 873、UBC 880。上述引物对各个样品进行 ISSR-PCR
扩增，获得了清晰的扩增条带，而且多态性丰富（图 2，引物 UBC835 扩增结果）。11 条引物共扩
增出 102 条清晰可重复的条带，其中有 58 条为多态性条带，多态位点百分率为 56.9%。每个引物扩
增的条带为 5 ~ 14 条，平均扩增条带数为 10.2 条。



图 2 引物 UBC835 对 20 份植物材料基因组 DNA 的扩增条带
1 ~ 20 见表 1，M：DL 2000 DNA marker。
Fig. 2 PCR result of 20 samples using ISSR primer UBC835
1–20 see Table 1，M：DL 2000 DNA marker.

2.4 遗传多样性分析
通过 Nei’s 计算各植物材料间的遗传相似性在 0.608 ~ 0.990。其中 13 份佛手品系的遗传相似系
数在 0.843 ~ 0.990 之间，这说明供试佛手种质之间虽然存在不同程度的遗传差异，但其遗传多样性
并不高。香橼材料的遗传相似系数在 0.608 ~ 0.941 之间，枸橙与其他香橼材料间的遗传相似系数在
0.637 ~ 0.745。由此说明，枸橙是与香橼、佛手基因组差异较大，亲缘关系较远的近缘种。
2.5 聚类分析
利用 UPGMA 法进行聚类分析，构建了各资源（佛手、香橼和枸橙）的亲缘关系树（图 3）。聚
类分析表明，当遗传相似系数为 0.798 时，将试材可分为 3 类，第 1 类为枸橙；第 2 类为香橼类群，
分别为野生香橼 1 号、野生香橼 2 号、长果香橼、圆果香橼、酸心香橼、甜心香橼；第 3 类为佛手
类群，分别为芽变 1 号、芽变 2 号、芽变 3 号、青皮佛手、矮化佛手、红花小种、广佛手、云佛手
1 号、云佛手 2 号、川佛手、马鞍山佛手、爪佛手、章鱼佛手。
当遗传相似系数 0.866 时，野生香橼与酸心香橼和甜心香橼在聚为一类，表明相对于长果香橼
和圆果香橼，野生香橼与酸心香橼和甜心香橼的亲缘关系较近。在佛手类群中，来自云南的爪佛手
和章鱼佛手亲缘关系较近，可聚为一类，这一类与川佛手、广佛手和浙佛手（金华佛手等）的差异
较大。但同样来自云南的其它佛手如云佛手 1 号、2 号等，有的与川佛手聚为一类，有的却同广佛
手聚为一类（图 3）。浙佛手和广佛手及云佛手在相似系数大于 0.95 之后，是聚为一类的，另外 3
个芽变材料聚为一类（图 3）。由聚类图可知，矮化佛手、青皮佛手、红花小种、广佛手、川佛手、
马鞍山佛手呈层状聚为一类，其中青皮佛手与矮化佛手的亲缘关系最近。

11 期 廖芳蕾等：佛手种质资源遗传多样性的 ISSR 分析 2227


图 3 20 个材料间亲缘关系聚类图
Fig. 3 Dendrogram based on 20 materials
3 讨论
3.1 ISSR 分析与佛手形态特征的相关性较大
张桂芳等（2009）采用 RAPD 技术将 13 份佛手种质材料聚类为广佛手、川佛手和浙佛手 3 个
类群，但各类中品种数相对较少。鲁振华（2008）采用 cpDNA 分析柑橘属及其近缘属植物的分类
和进化关系时，认为佛手和香橼在同一个分支中。高晓霞等（2006）以 rDNA ITS-RFLP 分析对佛手
和其近缘种香橼进行分子鉴定，发现佛手只有 1 个碱基的缺失和 3 个碱基的突变，酶切图谱也大部
分相同。本研究中将佛手与香橼聚成 2 类，即相对其它佛手生态型间的比较，佛手与香橼间的遗传
背景差异较大，表明 ISSR 方法分析的结果更符合二者实际形态学的观察结果。青皮佛手经辐射诱
变产生的矮化佛手不仅具有明显的矮化特征，并且具有稳定的遗传性（王俊平，2007）。应用 ISSR
从分子水平上鉴定矮化佛手的遗传基础，结果显示矮化佛手与青皮佛手亲缘关系最近（王俊平，2007；
张真真 等，2009）。研究认为 SSR 分析的结果受所选引物的影响较大，在矮化佛手的遗传分析上，
ISSR 相对较适合佛手遗传背景的研究（王俊平，2007）。本研究结果也再次验证了前人的结论。
3.2 聚类结果对于佛手及其近缘种分类的参考
芸香科演化系统中具有离生心皮的种属被认为是最为原始的，如香橼。佛手是具有部分离生心
皮的植物。枸橙是香橼的另一个变种，其心皮的结构处于典型的佛手与香橼之间，由此认为枸橙为
佛手向香橼演化的过渡类型（丁素琴，1979）。本研究中枸橙与其他材料间的遗传相似系数的变化范
围为 0.608 ~ 0.745，并没有表现出与佛手或香橼之间的预期相似性，香橼与佛手之间的相似性反而
较大。这一结果与前人的形态学观察的结果不符，尚需要其它分子标记的方法结合聚类分析重新探究。
采自浙江金华 3 个不同佛手基地 3 个芽变材料，原品种均为青皮佛手。3 个芽变材料与青皮佛
手的遗传相似系数分别为 0.9411、0.9215 和 0.9313，这一结果与材料的来源相符。3 个芽变材料的
果实形态以拳状为主（图 1，1 ~ 3），有别于指状佛手（图 1，4 ~ 6）及其他香橼品种的材料（图 1，
14，15，19）。可知这 3 个芽变材料为佛手的新突变品种，对其突变位点的确定还有待研究。
前人的研究认为，佛手种质间聚类结果与以产地为依据对佛手进行品种类群划分较为一致（张
2228 园 艺 学 报 40 卷
桂芳 等，2009）。本研究中收集的不同产地佛手间表现出一定的遗传多样性，但也表现遗传距离和
地理距离有一定差异。从聚类图看，来自浙江的青皮和矮化品种与广东的广佛手亲缘关系较近，来
自云南的云佛手也可与金华的红花小种聚到一起，即佛手品种间的遗传关系与以产地为依据对佛手
进行品种划分并不完全一致，这可能与近些年区域间相互引种有关，但需要更多证据支持这一推测。

References
Aydin Uzun，Turgut Yesiloglu. 2012. Genetic diversity in citrus//Mahmut Çalişkan. Genetic Diversity in Plants：213–230.
Ding Su-qin. 1979. Yunnan citron—A new variant of Citrus medica L. from Yunnan. Acta Horticulturae Sinica，6 (2)：85–87. (in Chinese)
丁素琴. 1979. 云南香橼——柑橘属枸橼的一个新变种. 园艺学报，6 (2)：85–87.
Gao Xiao-xia，Chen Xiao-ying，Luo Yuan-sheng，Wen Zhan-feng. 2006. Preliminary analysis of rDNA of fingered citron and its related species citron
by ITS-RFLP. Journal of Changchun University of Traditional Chinese Medicine，22 (4)：77. (in Chinese)
高晓霞，陈晓颖，罗源生，温占峰. 2006. 佛手及其近缘种香橼 rDNA ITS-RFLP 初步分析. 长春中医药大学学报，22 (4)：77.
He Yun-fang，Jin Xiao-ling. 2001. Review of research progress in Citrus medica with reference to prediction of development prospects. Economic
Forest Reseaches，(4)：41–43. (in Chinese)
何云芳，金晓玲. 2001. 佛手的研究现状及发展前景. 经济林研究，(4)：41–43.
Leng Xin，Wang Zhong-sheng，An Shu-qing，Feng Jue，Liu Yu-hong，Wang Guo-ming. 2005. ISSR analysis of genetic diversity of Ilex integra，
an insular endemic plant. Biodiversity Science，13 (6)：546–554. (in Chinese)
冷 欣，王中生，安树青，冯 珏，刘玉虹，王国明. 2005. 岛屿特有种全缘冬青遗传多样性的 ISSR 分析. 生物多样性，13 (6)：546–554.
Lu Mei，Yang Jia-ni，Zhou Duan-xu，Li Yong-qiang. 2011. Biological characteristics of the pathogenic fungus causing anthracnose in fingered citron.
Journal of Zhejiang Normal University：Nat. Soi，34 (3)：323–327. (in Chinese)
路 梅，杨佳妮，周端顼，李永强. 2011. 佛手炭疽病病原菌的生物学特性研究. 浙江师范大学学报：自然科学版，34 (3)：323–327.
Lu Zhen-hua. 2008. Taxonomic and phylogenetic relationships between citrus and its close relatives based on cpDNA sequences[M. D. Dissertation].
Chongqing：Southwest University. (in Chinese)
鲁振华. 2008. 柑橘及其近缘属植物分类与进化关系的 cpDNA 分析[硕士论文]. 重庆：西南大学.
Rohlf F J. 1998. NTSYS-pc，Numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.02. New York：Setauket.
Shi Xue-wu，Shao Jie-an，Qi Xin-yue. 1997. Exoticness of Jinhua. Beijing：China Forestry Publishing House：50–51. (in Chinese)
施学武，邵介安，戚信跃. 1997. 金华奇葩. 北京：中国林业出版社：50–51.
Wang Jun-ping. 2007. Studies on morphological characteristics and freezing tolerance of dwarfed Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle and the
ISSR and SSR analysis[M. D. Dissertation]. Jinhua：Zhejiang Normal University. (in Chinese)
王俊平. 2007. 矮化佛手形态特征、抗寒性极其 ISSR、SSR 分子标记的研究[硕士论文]. 金华：浙江师范大学.
Zhang Gui-fang，Xu Hong-hua. 2007. Research overview of fingered citron germplasm. Jouranl of Guangzhou Uiversity of Traditional Chinese
Medicine，24 (1)：69–72. (in Chinese)
张桂芳，徐鸿华. 2007. 佛手种质资源研究概况. 广州中医药大学学报，24 (1)：69–72.
Zhang Gui-fang，Xu Hong-hua，He Hong. 2009. An RAPD analysis on genetic diversity of Citrus medica L. var. sarcodactylis (Noot) Swingle
germplasms. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，20 (3)：604–606. (in Chinese)
张桂芳，徐鸿华，贺 红. 2009. 佛手种质资源遗传多样性的随机扩增多态性 DNA 分析. 时珍国医国药，20 (3)：604–606.
Zhang Zhen-zhen，Wang Jun-ping，Guo Wwei-dong. 2009. An SSR analysis of genetic differences of dwarfed fingered citron. Journal of Zhejiang
Agricultural Sciences，(1)：67–71. (in Chinese)
张真真，王俊平，郭卫东. 2009. 矮化佛手遗传差异的 SSR 标记分析. 浙江农业科学，(1)：67–71.
Zhou Chun-li，Guo Wei-dong. 2003. Research progress of fingered citron germplasm. Shaanxi Journal of Agricultural Sciences，(3)：89–92. (in Chinese)
周春丽，郭卫东. 2003. 佛手种质资源研究进展. 陕西农业科学，(3)：89–92.
Zhou Ying. 2009. The research on the introduction cultivation and propogatiom of bergamot[M. D. Dissertation]. Changsha：Central South
University of Forestry and Technology. (in Chinese)
周 莹. 2009. 佛手的引种栽培及繁殖技术的研究[硕士论文]. 长沙：中南林业科技大学.