全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（6）：1218–1226 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–11–20；修回日期：2014–05–08
基金项目：国家高技术研究发展计划（‘863’）项目（2011AA1008）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhangyanlong@nwsuaf.edu.cn）
岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导的LrPR10的克隆
及表达分析
张响玲，张延龙*，牛立新，孙道阳，梁振旭
（西北农林科技大学林学院，陕西杨凌 712100）
摘 要：为了研究黄瓜花叶病毒（CMV）诱导的岷江百合（Lilium regale）病程相关蛋白 PR10 基因
在抗病毒防御反应中的作用，对岷江百合叶片接种 CMV，采用 RACE 技术获得岷江百合 LrPR10 的全长
cDNA 序列，并对其进行生物信息学分析；利用实时荧光定量 PCR 对 LrPR10 在各器官特异性以及 CMV
和水杨酸（SA）处理后的表达模式进行了测定分析。结果表明：LrPR10 全长 756 bp，可编码由 157 个氨
基酸组成的蛋白质，该蛋白具有病程相关蛋白典型的 Bet_v1_like 保守结构域；LrPR10 在岷江百合鳞茎中
相对表达量最高，在嫩叶中最低；该基因可以被 CMV 和 SA 诱导上调表达，岷江百合、卷丹（L. lancifolium）
和宜昌百合（L. leucanthum）在 CMV 接种处理后 LrPR10 的相对表达量分别在 4 d、4 d 和 1 d 达到最大值，
分别为处理前的 58 倍、27 倍和 292 倍，在 SA 处理后 LrPR10 的相对表达量都在 8 h 达到最大值，分别为
处理前的 34 倍、8 倍和 38 倍。以上结果表明 LrPR10 在岷江百合抗黄瓜花叶病毒防御反应过程中发挥作
用。
关键词：岷江百合；黄瓜花叶病毒；LrPR10；RACE；表达分析
中图分类号：S 682.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1218-09

Cloning and Expression Analysis of LrPR10 Gene from Lilium regale
Induced by Cucumber mosaic virus
ZHANG Xiang-ling，ZHANG Yan-long*，NIU Li-xin，SUN Dao-yang，and LIANG Zhen-xu
（College of Forestry，Northwest A & F University，Yangling，Shaanxi 712100，China）
Abstract：This study aimed to clone PR10 gene which was up-regulated in the leaves of Lilium regale
infected by Cucumber mosaic virus（CMV）and examine the role of PR10 gene in defense response against
CMV. The full length of LrPR10 was amplified by RACE and analyzed with bioinformatics tools.
Real-time PCR was performed to check the transcript levels of LrPR10 in different organs of L. regale，
CMV-inoculated and salicylic acid（SA）–treated leaves. The results showed that the length of complete
cDNA of LrPR10 was 756 bp，which encoded 157 amino acids consisting of a Bet_v1_like conserved
domain of pathogenesis-related proteins. The transcript level of LrPR10 was the highest in bulbs，whereas
the lowest in tender leaves. LrPR10 was significantly induced by CMV inoculation and SA treatment.
Transcript level of LrPR10 reached a peak at 4 d，4 d and 1d in the CMV-inoculated leaves of L. regale，

6 期 张响玲等：岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导的 LrPR10 的克隆及表达分析 1219

L. lancifolium and L. leucanthum respectively，while the maximum relatively expression values in
CMV-inoculated samples were about 58，27 and 292 times higher than the uninoculated ones in these three
species. After SA treatment，LrPR10 peaked at 8 h in L. regale，L. lancifolium and L. leucanthum and the
maximum relatively expression values in treated samples were about 34，8 and 38 times higher than the
untreated ones in three species. We hypothesize that LrPR10 from L. regale probably plays an essential
role in plant defense against CMV.
Key words：Lilium regale；Cucumber mosaic virus；LrPR10；RACE；expression analysis

自 Stewart（1896）首次报道侵染百合的黄瓜花叶病毒（CMV）到现在，已经确定能够侵染百
合的病毒有 19 种（Yamaji et al.，2001；刘博，2009），CMV 是其中危害最为严重的病毒之一，常
与其他病毒进行复合侵染（Asjes，2000）。百合育种专家都亟希望利用分子生物学的方法获得抗病
毒种质资源（Lipsky et al.，2002；徐秉良 等，2004；Benidito et al.，2005；王进忠 等，2005），以
选育抗病毒百合新品种。
岷江百合（Lilium regale）被公认为百合属中抗病性优异的种类（Yoshiji et al.，1996；Yumi et al.，
2000），对尖孢镰刀菌具有很高的抗性（Lim et al.，2003），对病毒病的表现尤其突出。王仙芝等（2008）
用 RT-PCR 技术对岷江百合及秦巴山区的 5 种野生百合进行抗病毒病检测，发现岷江百合对 CMV、
百合无症病毒（LSV）及百合斑驳病毒（LMoV）的抗性达到免疫水平。
PR10 蛋白最早在真菌诱导的欧芹培养细胞中发现（Somssich et al.，1986），目前已经从 70 多
种植物中鉴别出了 100 多种 PR10 基因（Wen et al.，1997；Markovic-Housley et al.，2003；Colditz et
al.，2007）。研究表明，PR10 蛋白具有体外抑菌活性和核酸酶活性（Park et al.，2004；Liu et al.，
2006），能被病原体（包括病毒、细菌、真菌）、SA、脱落酸、茉莉酸甲酯或乙烯诱导表达（Constabel
& Brisson 1992；Lo et al.，1999；McGee et al.，2001；贺明阳，2012；Parinita et al.，2013）。van Loon
和 van Strien（1999）及 Park 等（2004）认为，PR10 蛋白可以通过降解病毒的 RNA 来增强植物的
抗性。在麻风树中，PR10 蛋白具有核酸酶活性，并且对炭疽病菌表现出抗性（Parinita et al.，2013）。
PR10 在华东葡萄中可以被葡萄霜霉菌诱导表达，将该基因转到易感病的葡萄品种中可以增强其对霜
霉菌的抵抗能力（He et al.，2013）。
本研究中根据岷江百合在 CMV 诱导下 cDNA 文库中的 PR10 的 EST 序列设计特异引物，利用
RACE 技术克隆全长 cDNA，并通过实时定量 PCR 分析 LrPR10 在岷江百合不同器官中的表达模式，
以及 CMV 和 SA 处理后该基因的表达情况，旨在了解该基因的有关特性及在抗病防御反应中的作
用，为进一步开展百合抗病毒育种工作奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及其处理
供试植物材料岷江百合（Lilium regale）、卷丹（L. lancifolium）和宜昌百合（L. leucanthum）均
取自西北农林科技大学百合资源圃，材料的处理及取样时间为 2012 年 4—6 月。已知岷江百合、卷
丹和宜昌百合复合接种 LMoV 和 CMV 的相对抗病毒指数分别为 0.64、0.64 和 0.18，抗病程度分别
为高抗、高抗和高感（王仙芝，2013）。黄瓜花叶病毒从该资源圃中感染该病毒的‘西伯利亚’百合
（L. Oriental Hybrids‘Siberia’）叶片中获得。
分别采集正常生长的岷江百合嫩叶、嫩茎、花、鳞茎、根等器官，于液氮中冷冻后，–80 ℃保
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存。
选取正常生长的岷江百合、卷丹和宜昌百合，将 CMV 毒源植株黑暗处理 8 h 后取嫩叶 1 g，用
已灭菌的 0.01 mol · L-1 磷酸缓冲液（pH 7.2）稀释至 0.001 mol · L-1，研磨后加少量石英砂摩擦接种
叶片，接种后用蒸馏水冲洗。取样时间为接种后 0、1、2、3、4、5 和 6 d，将所取样品液氮速冻
后–80 ℃保存。
用 2 mmol · L-1 的 SA 喷洒到正常生长的岷江百合、卷丹和宜昌百合叶片上，于处理后 0、2、4、
6、8、10 和 12 h 取样，样品经液氮速冻后，置于–80 ℃保存。
1.2 岷江百合基因 LrPR10 的全长克隆
百合叶片总 RNA 的提取采用改良的 CTAB 法（尹慧 等，2008）。反转录按照 Fermentas 公司
的 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 进行。
根据已获得的黄瓜花叶病毒诱导的岷江百合 cDNA 文库中的 EST 核心序列设计 3′RACE 特异引
物，Gene Racer 3′Primer：5′-AGCTCGCTCCCGAGATCTTGCTCAGT-3′，巢式特异引物 Gene Racer
3′Nested Primer：5′-GGGTGCATCGTGAAGGTGGTGACAG-3′。根据获得的基因 3′端序列设计
5′RACE 特异引物 Gene Racer 5′Primer：5′-TTCATTCTGCAAGTGGTTCTAAGCA-3′，巢式特异引物
Gene Racer 5′ Nested Primer：5′-AGGTAAGCTTCTGCAGCCTTGAAGAG-3′。引物设计用 Primer 5.0
软件进行并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
以接种黄瓜花叶病毒的岷江百合各时期叶片提取的 RNA 混合样为模板，使用 BD SMARTTM
RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）进行 RACE cDNA 扩增。扩增产物经 1%的琼脂糖电泳检
测，回收目标条带连接至 pGEM-T Easy 克隆载体（Promega）后测序（北京奥科鼎盛生物技术科技
有限公司）。对测序获得的 LrPR10 的 5′端序列和 3′端序列利用 DNAstar 软件进行拼接，获得岷江百
合基因 LrPR10 cDNA 全长序列。
1.3 岷江百合基因 LrPR10 的生物信息学分析
采用 NCBI 的 ORF finder 预测开放阅读框；通过 NCBI 网站上的 BLAST 搜索，查找 LrPR10 的
同源序列；用 NCBI 的 protein blast 进行蛋白序列保守结构域分析；通过 DNAman 软件分析 LrPR10
基因的编码氨基酸以及比较氨基酸序列的同源性；利用 MEGA 5.1 构建系统发育树；利用 ProtParam
程序（http：//expasy. org/cgi-bin/protparam）预测蛋白质的分子量和等电点；根据 SignalP 4.1 Server
（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）分析蛋白质的信号肽；用 TMHMM（http：//www. cbs. dtu.
dk/services/TMHMM/）进行蛋白质的跨膜结构域分析；据 ProtScale（http：//www. expasy. org/cgi-bin/
protscale. pl）分析蛋白质的亲水性。根据 Motif Scan（http：//hits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCAN/）研究
蛋白 motifs。
1.4 岷江百合 LrPR10 表达的器官特异性分析
根据已获得的岷江百合基因 LrPR10 3′端非保守区序列设计合成定量的引物 LrPR10-1：5′- TAAG
AGGCTGGCTACCCCAATTC-3′，LrPR10-2：5′- ATTGGGGTAGCCAGCCTCTTACA-3′。以 18S rRNA
基因（GenBank 登录号：D29775.1）为内参基因，其引物为 18S rRNA-1：5′-TCTCAACCATAAAC
GATGCCGA-3′，18SrRNA-2：5′-TTTCAGCCTTGCGACCATACTC-3′。分别取岷江百合嫩叶、嫩茎、
花、鳞茎、根等器官的总 RNA 各 1 µg，反转录为 cDNA。按照 SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real
Time）（TaKaRa，Japan）的说明书进行实时荧光定量，在 IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection
System（Bio-Rad，USA）上检测基因在不同组织的相对表达量，每个样品设 3 次重复。PCR 扩增
6 期 张响玲等：岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导的 LrPR10 的克隆及表达分析 1221

程序为：95 ℃变性 1 min；95 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，40 个循环。用 Excel 2007
和 Origin 7.5 对数据进行计算和处理，定量数据的处理方法采用 2-ΔΔCT法。用 SPSS 软件进行差异显
著性分析。
1.5 岷江百合 LrPR10 的表达模式分析
分别取 CMV 和 SA 处理后不同处理时间的叶片总 RNA 1 µg，进行表达模式分析，本操作所用
的引物、PCR 程序及数据处理方法均同 1.4 所示。
2 结果与分析
2.1 岷江百合 LrPR10 全长 cDNA 序列的获得
RACE 扩增后，得到长度为 405 bp 的 3′ cDNA 序列和长度为 518 bp 的 5′ cDNA 序列（图 1），
利用 DNAstar 软件进行拼接后，获得了 756 bp 的全长 cDNA。开放阅读框（open reading frame，ORF）
长 474 bp，编码 157 个氨基酸。将该基因命名为 LrPR10，GenBank 登录号为 KF690636。

图 1 岷江百合 LrPR10 的 RACE 扩增结果
Fig. 1 RACE amplification product of LrPR10 from Lilium regale
2.2 岷江百合 LrPR10 的生物信息学分析
经 ProtParam 预测 LrPR10 蛋白的分子量为 16.8 kD，等电点为 5.39，为酸性蛋白。利用 SignalP
4.1 分析可知，该序列无信号肽，为非分泌蛋白。经 TMHMM 预测该蛋白不具跨膜区，属于胞内蛋
白。通过 ProtScale 分析表明，LrPR10 蛋白为亲水性蛋白，其亲水性氨基酸含量高于疏水性氨基酸
含量。通过 NCBI 的 protein blast 分析显示，LrPR10 蛋白具有病程相关蛋白典型的 Bet_v1_like 保守
结构域（图 2）。





图 2 LrPR10 蛋白的保守域分析
Fig. 2 Conserved domain analysis of LrPR10 protein
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Motif Scan 分析表明，LrPR10 蛋白含有 1 个 N–糖基化位点（56 ~ 59 位氨基酸），4 个酪蛋白
激酶Ⅱ磷酸化位点（40 ~ 43、83 ~ 86、92 ~ 95 和 127 ~ 130 位氨基酸），3 个 N–豆蔻酰化位点（47 ~
52、87 ~ 92 和 124 ~ 159 位氨基酸），该编码蛋白 3 ~ 152 位氨基酸具有病程相关蛋白 Bet_v_I 家族
保守域。
氨基酸序列比对结果（图 3）显示：LrPR10 蛋白与同属的麝香百合中 6 种 PR10 蛋白（Lilium
longiflorum AAD17336.1、AAF21625.1、AAF21624.1、AAF21623.1、AAF21622.1、AAD17335.1）
的同源性分别为 91%、89%、89%、88%、88%、87%；而与小麦（Triticun aestivum，TaPR10，
ACG68733.1）、高粱（Sorqhum bicolor，AAVV83209.1）、玉米（Zea mays，NP 001131012.1）、番红
花（Crocus sativus，ADL09408.1）的 PR10 蛋白同源性分别为 54%、54%、53%、53%，这些蛋白都
具有病程相关蛋白 Bet_v1_like 保守结构域。

图 3 岷江百合 LrPR10 蛋白与其他植物 PR10 蛋白的氨基酸序列同源性比对
Fig. 3 Alignment of amino acid sequences of LrPR10 protein and PR10 protein from other plants

将 LrPR10 蛋白与 NCBI 检索的其他物种中 16 种 PR10 蛋白进行多序列比对后构建系统发育树
（图 4），结果显示，岷江百合 PR10 蛋白与同属的麝香百合 LlPR10-1（L. longiflorum，AAD17335.1）
和 LlPR10-7（L. longiflorum，AAD17336.1）蛋白的亲缘关系最近，与单子叶植物玉米（Zea mays，
NP 001131012.1），高粱（Sorqhum bicolor，AAVV83209.1），水稻（Oryza sativa，AAL74406.1），
小麦（Triticun aestivum，ACG68733.1），黑麦草（Lolium perenne，AEO11776.1）中的 PR10 蛋白
具有相对近些的亲缘关系，与裸子植物加州山松（Pinus monticola，AFR78290.1）的 PR10 蛋白亲缘
关系相对较远，而与双子叶植物 PR10 蛋白的亲缘关系最远。
6 期 张响玲等：岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导的 LrPR10 的克隆及表达分析 1223

图 5 LrPR10 在岷江百合不同器官中的相对表达量
不同字母表示差异显著（P < 0.05）。
Fig. 5 Expression analysis of LrPR10 gene in different
organs of Lilium regale
Different letters indicate significant differences among
different organs（P < 0.05）.
图 4 几种植物 PR10 氨基酸序列的系统发育树
数字代表进化距离。
Fig. 4 Phylogenetic tree of amino acid sequences of the PR10 from several plant species
Numbers stand for evolutionary distance.

2.3 LrPR10 在岷江百合不同器官中的表达
LrPR10 在岷江百合嫩叶、嫩茎、花、鳞茎、
根等各器官中的表达量均不相同，在鳞茎中的
表达量最高，在嫩叶中的表达量最低（图 5）。
说明 LrPR10 在岷江百合中存在组成型表达。
2.4 CMV 侵染后 LrPR10 的表达模式
岷江百合、卷丹和宜昌百合接种 CMV 后
LrPR10 的相对表达量均增加，达到最大值的时
间分别为 4 d、4 d 和 1 d（图 6）。LrPR10 的相
对表达量在高感病毒的宜昌百合中最高，为接
种前的 292 倍，在高抗病毒的岷江百合中相对
表达量居中，达处理前的 58 倍，在高抗病毒的
卷丹中表达量最低，为接种前的 27 倍（图 6）。
不同抗性的百合中 LrPR10 的表达情况存在明
显的差异，说明 CMV 可以诱导 LrPR10 的表达，该基因是一个百合抗病毒相关基因。
2.5 SA 处理后百合中 LrPR10 的表达模式
SA 处理不同抗性百合后，LrPR10 的表达量与百合的抗性有关。在高抗病毒的岷江百合中的表
达量明显区别于卷丹和高感病毒的宜昌百合。
1224 园 艺 学 报 41 卷
SA 处理后，岷江百合、卷丹和宜昌百合中 LrPR10 均被诱导表达，该基因在 3 种不同抗性的百
合中均在 8 h 时达到最大值，但表达量存在明显的差异，在高抗病毒的岷江百合中相对表达量为处
理前的 34 倍，而高抗病毒的卷丹中相对表达量仅为处理前的 8 倍，高感病毒的宜昌百合中表达量的
最大值为处理前的 38 倍（图 7）。由此可见，百合可以通过 SA 信号传导途径参与抗病毒反应。








3 讨论
本研究中，3 种不同抗性的百合叶片接种 CMV 后，LrPR10 的表达量均有较大提高。其中，高
感病毒的宜昌百合中表达量最高，高抗病毒的岷江百合中表达量居中，高抗病毒的卷丹中最低（图
6），岷江百合和卷丹仅为宜昌百合中的 20%和 9%。已知植物具有复杂的抗病机制，其对某种病毒
产生抗性是由结构抗病毒机制和生化抗病毒机制共同作用的结果。作者所在研究组以前的试验结果
表明，岷江百合和卷丹都易感蚜虫，而宜昌百合对蚜虫却高抗（王仙芝，2013），由此可知宜昌百合
的结构抗病毒能力远强于岷江百合和卷丹。而通过人工复合接种 LMoV 和 CMV 试验证明，3 种百
合接种初期均易被病毒感染，但最终对病毒的抗性表现却是高抗、高抗和高感（王仙芝，2013）。由
此可知，较强的结构抗病毒能力使高感病毒的宜昌百合中 LrPR10 的表达量远大于高抗病毒的岷江
百合和卷丹。以上结果表明，岷江百合 LrPR10 受 CMV 的诱导，且表达量与百合本身的抗性存在一
定的关系，是一个百合抗病毒相关基因。
水杨酸依赖途径是植物中主要的防卫反应信号途径之一（彭金英和黄勇平，2005）。依赖于水杨
酸的信号转导途径，可以通过外源施加 SA 激活相同的一套 PR 基因（王冬良 等，2005）。已知 SA
是植物对病原菌产生抗性反应的信号分子，能提高许多病原体响应基因的表达（Thomma et al.，
2001）。已有研究表明 SA 可诱导辣椒、刺茄等植物中 PR10 基因的表达（Park et al.，2004；Liu et al.，
2006）。本研究中，SA 处理不同抗性的百合叶片后，实时定量结果显示 LrPR10 上调表达，岷江百
图 6 岷江百合、卷丹和宜昌百合接种 CMV 后
LrPR10 的相对表达量
同一时间，不同字母表示组间差异显著（P < 0.05）。
Fig. 6 Expression analysis of LrPR10 in Lilium regale，
L. lancifolium and L. leucanthum in response to CMV
In the same period，different letters indicate significant differences
among groups（P < 0.05）.

图 7 岷江百合、卷丹和宜昌百合 SA 处理后
LrPR10 的相对表达量
同一时间，不同字母表示组间差异显著（P < 0.05）。
Fig. 7 Expression analysis of LrPR10 in Lilium regale，
L. lancifolium and L. leucanthum in response to SA
In the same period，different letters indicate significant differences
among groups（P < 0.05）.

6 期 张响玲等：岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导的 LrPR10 的克隆及表达分析 1225

合、卷丹和宜昌百合均在 8 h 时达到表达量的最大值，但最大值存在明显的差别，分别为未处理的
34 倍、8 倍和 38 倍。结果表明，LrPR10 可以通过 SA 信号传导途径参与岷江百合抗病毒的过程，
并且该过程与百合本身的抗性有关。
通过黄瓜花叶病毒诱导岷江百合中 LrPR10 的克隆及表达分析结果认为，LrPR10 基因是百合抗
病毒相关基因，而对于 LrPR10 在岷江百合抗病毒中的具体抗病作用以及抗性机理尚需进一步的研
究。

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