全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（10）：1935–1942 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–06–26；修回日期：2013–09–04
基金项目：福建省自然科学基金项目（2009J01066）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：348279953@qq.com）
建兰 AP1 基因的克隆、表达及其与 MADS-box
转录因子相互作用的分析
吴菁华，吴少华*，杨 超，张志忠
（福建农林大学园艺学院，福州 350002）
摘 要：为研究 APl/SQUA 类 MADS-box 基因在建兰花发育中作用，以‘四季大青’建兰花芽为材料，
用 RT-PCR 和 RACE 技术获得 AP1 基因，命名为 CeAP1。序列分析表明，CeAP1 基因 cDNA 全长 866 bp，
其开放阅读框编码一个含 241 个氨基酸的蛋白质。通过蛋白序列比对发现 CeAP1 与兰科植物的 AP1 蛋白
质同源性较高。荧光定量 PCR 分析表明，CeAP1 基因在建兰花发育初期高水平表达，同时在营养器官中
也表达。酵母双杂交试验分析显示，CeAP1 能自身形成同源二聚体，同时也能与除 CeAG1 外的其他
MADS-box 发生相互作用。
关键词：建兰；花发育；AP1 同源基因；相互作用
中图分类号：S 682.31 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）10-1935-08

Cloning and Expression Analysis on AP1 Homologous Gene from
Cymbidium ensifolium and Interaction Analysis Between AP1 and
MADS-box Transcription Factors
WU Jing-hua，WU Shao-hua*，YANG Chao，and ZHANG Zhi-zhong
（College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）
Abstract：To investigate the function of AP1 genes on flower development in Cymbidium ensifolium，
AP1 was cloned from‘Sijidaqing’flower buds and the full length of AP1 cDNA was amplified by RACE
method，named CeAP1. CeAP1 is 866 bp in length with a 726 nucleotides ORF that putatively encodes a
protein with 241 amino acids. Homology analysis showed that the CeAP1 was highly homologous to the
AP1MADS-box genes of orchids. Quantitative real-time PCR analysis demonstrated that CeAP1 was
expressed in the initial period of floral development and vegetative organs. The yeast two-hybrid analysis
indicated that the CeAP1was not only able to form homodimer but also formed heterodimers with the other
MADS-box transcription factors except for CeAG1.
Key words：Cymbidium ensifolium；flower development；AP1 homologous gene；interaction

开花受基因和外在环境的共同影响。根据对模式植物拟南芥和金鱼草花发育突变体的研究，
Coen 和 Meyerowitz（1991）在 20 世纪 90 年代初提出了花发育的 ABC 模型。随着研究的不断深入，

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ABC 模型发展为 ABCDE 模型（Theißen，2001；Theißen & Saedler，2001）。大部分花器官决定基
因是 MADS-box 家族基因，序列进化分析把开花植物的 MADS-box 基因分成 12 个家族（Becker &
Theißen，2003），其中 APl/SQUA 家族（又称作 APl/FUL 家族）基因被认为既是花分生组织特征基
因，又是花器官特征基因，它的家族成员在营养生长到生殖生长的转换和花器官发育中都发挥着重
要的作用。
APl/SQUA 家族基因，如拟南芥的 AP1 和金鱼草的 SQUA 突变常常会引起部分花芽转变以及花
瓣、花萼等花器官的变化（Huijser et al.，1992；Mandel et al.，1992；Bowman et al.，1993；
Gustafson-Brown et al.，1994）。拟南芥中的另一个 APl/SQUA 基因 CAULIFLOWER（CAL）与 AP1
基因存在部分功能冗余（Kempin et al.，1995）。大量的 APl/SQUA 家族基因异位表达也表明其具有
花器官和花分生组织特性决定两个方面的功能。AP1 或其同源异型基因的异位表达会导致拟南芥提
前开花（Mandel & Yanofsky，1995；Kyozuka et al.，1997）；Chen 等（2008）克隆了 3 个百合的 AP1
同源基因，过量表达这 3 个基因均能使转基因拟南芥提早开花；苹果的 MdMADS2 和兰花的 OMADS1
在烟草中异位表达能使其提早开花及花器官变化（Sung et al.，1999；Hsu et al.，2003）。
中国福建是建兰（Cymbidium ensifolium）的重要产地之一，近年来建兰的生产发展较快，出现
一些奇异花型，极具经济价值。本研究中以建兰花芽为材料，利用 RT-PCR 结合 RACE 技术克隆建
兰 AP1 基因——CeAP1，研究该基因在建兰不同花器官和花发育过程中的表达模式，并利用酵母双
杂交技术进一步分析了 CeAP1 与建兰其它 MADS-box 转录因子间的互作，为揭示 CeAP1 基因的功
能和在花发育过程中与其它转录因子间相互关系的分子基础提供依据。
1 材料与方法
1.1 总 RNA 提取与 cDNA 合成
试验于 2012 年在福建农林大学园艺学院遗传育种实验室进行。
以建兰‘四季大青’（购于福州市花鸟市场）花蕾为材料，采用百泰克公司多糖多酚 RNA 提取
试剂盒提取总 RNA，cDNA 第一链合成以 AP（5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)16-3′）为引物，
使用 Fermants 公司的逆转录试剂盒完成，5′-cDNA 合成采用 Clontech 公司的 SMARTTM RACE 试剂
盒。
1.2 建兰 AP1 基因的克隆
根据单子叶植物的 MADS-box 基因设计正向的简并引物 AP11 和反向的 AP12 两个引物，AP11：
5′-GCTGAAGAMGATAGAGAACAAGATC-3′；AP12：5′-CTGAGCATCC ATGGGGGCAG GC-3′，以
花蕾的 cDNA 为模板进行 PCR扩增，获得了基因的保守区。根据获得的保守区序列分别设计 5′RACE
和 3′RACE 引物：AP15R1：5′-CTATGGAATTAAGGAGTAGCTGGGTC-3′；AP15R2：5′-CGTTT
AAGGGTCCAAGATCCTCTCCAAG-3′；AP13R1：5′-GACCCAGCTACTCCTTAATTCCATAG-3′；
AP13R2：5′-CAAACGATCTTCCAACCCTGAATTTAG-3′。PCR 扩增分别获得该基因的 5′端和 3′端。
再设计一对正向引物 AP1F（5′-ATGGGGAGGGGGAGAGTTC-3′）和反向引物 AP1R（5′-TTAGGTTG
AAGAGCGAAGCATCC-3′），用 RT-PCR 方法分离其 ORF。
1.3 序列的生物信息学分析
利用 ExPASY 系统中的 ProtParam 工具（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析建兰
AP1 基因编码氨基酸的基本性质，然后运用 Blast 搜索其同源基因，再使用 Mega5 软件对搜索得到
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的基因进行多重序列比对，并构建系统发生树。
1.4 建兰 AP1 基因的表达分析
分别提取建兰‘四季大青’的萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱、花梗、根和叶及大小分别为 < 0.5 cm、
0.5 ~ 1.0 cm、1.0 ~ 2 cm、> 2.0 cm 花芽、全开花、衰败花的总 RNA，取 1 µg 总 RNA 逆转录后得到
cDNA，进行荧光定量 PCR 分析。以建兰 Actin 基因为内参基因。建兰 Actin 基因的引物为 Act1：
5′-CTGCTGGCATTCATGAGACGACC-3′和 Act2 ： 5′-CAATTCCAGGGAACATAGTCGAGCC-3′。
CeAP1 的引物为 CeAP1YGF：5′-ATGGATGCTTCGCTCTTCAACC-3′和 CeAP1YGR：5′-AGCT
CGCATTCAAGAAATCTGGG-3′。实时定量 PCR 的试剂盒为 SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit
（TaKaRa）。PCR 反应体积 20 μL，包括 2 μL cDNA、10 μL 2× Mix、浓度为 10 μmol · L-1 的正反向
引物各 0.4 μL，剩余体积用超纯水补足至 20 μL。每个反应重复 3 次。定量 PCR 反应程序：95 ℃ 3 min；
95 ℃ 5 s，59 ℃ 20 s，50 个循环。定量 PCR 使用罗氏 LightCycler 1.5 定量 PCR 仪。以清水为阴性
对照，每试验 3 次重复。采用 2-ΔΔCT 法计算相对表达量的高低。
1.5 CeAP1 与其它 MADS-box 转录因子相互作用的分析
将建兰 CeAP1 全长编码区 cDNA 连接到 pGADT7 酵母表达载体中，构建 AD-CeAP1 载体，引
物为 ADAP1（5′-CCGGAATTCATGGGGAGGG GGAGAGTTCAG-3′）和 ADAP2（5′-CGCGGATCCT
TAGGTTGAAG AGCGAAG-3′）。另一方面，将建兰 CeAP1 及从建兰 cDNA 文库中获得的其它与花
发育相关的 MADS-box 基因 CeAP31、CeAP32、CePI1、CeAG1、CeSTK、CeSEP3 和 CeAGL6 分别
连接到酵母表达载体 pGBDT7中，构建BD-CeAP1、BD-CeAP31、BD-CeAP32、BD-CePI1、BD-CeAG1、
BD-CeSTK、BD-CeSEP3 和 BD-CeAGL6。酵母双杂交系统参照 Clontech 公司说明书，酵母菌株为
AH109，采用醋酸锂转化法进行酵母的转化。将酵母克隆接种在加有 X-Gal 的 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade
四缺培养基上，正常生长且显蓝色为阳性结果。
2 结果与分析
2.1 建兰 AP1 全长 cDNA 的克隆
根据 AP1 保守序列设计引物，以建兰花蕾 cDNA 为模板，扩增得到一个 700 bp 左右的保守区
片段，测序结果表明，该片段具有 MADS-box 基因的保守区，与其它植物 AP1 基因有一定的相似性。
用 RACE 法分别获得 3′端 250 bp 和 5′端 300 bp 左右的目的片段，最后通过序列拼接得到全长 866 bp
序列（图 1）。RT-PCR 方法分离的 ORF 为 726 bp，与拼接的结果一致。ORF 编码一个含 241 个氨基
酸的蛋白质，蛋白结构域分析表明 AP1 蛋白含有典型的 MADS 结构域和 K 结构域两个保守结构域。
将此序列命名为 CeAP1，并在 GenBank 注册，登录号为 JX255735。
2.2 AP1 基因的生物信息学分析
预测 CeAP1 编码的蛋白的分子量是 27.7 kD，理论等电点 9.65。CeAP1 推定的氨基酸序列与文
心兰的 MADS10（HM140846）、萼脊兰的 MADS1（JQ776636）和球花石斛的 DthyFL2（AY927237）
等兰花的 AP1 都具有较高的相似性，与其它单子叶植物也有一定的相似性。如华山姜（ABS83558）、
油棕（AAQ03221）、麝香百合（ADT78583）和郁金香（BAJ09452）的 AP1 氨基酸序列的同源性也
达到 65%、65%、61%和 60%。图 2 是 CeAP1 基因推定的氨基酸序列与其他物种 AP1 基因的氨基酸
序列比对结果，结果显示 AP1 氨基酸序列的 5′端保守性较高，而 3′端保守性较低，这是 MADS-box
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基因的典型特征，并在 C 端存在单子叶植物 APl/SQUA 基因所特有的 paleoAPl（LPPWML）结构域
（Vandenbussehe et al.，2003）。


图 1 CeAP1 基因的克隆
M：DL2000 marker；1：保守区；2：3′RACE；3：5′RACE。
Fig. 1 Cloning of CeAP1 gene from Cymbidium ensifolium
M：DL2000 marker；1：Conserved region；2：3′RACE；3：5′RACE.


图 2 CeAP1 编码的氨基酸序列与其他物种 APl/SQUA 蛋白的序列比较
Fig. 2 Alignment of the deduced amino acid sequence of CeAP1 with other APl/SQUA proteins

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为了分析 CeAP1 基因与其他植物 APl/SQUA 基因的系统进化关系，采用 MEGA 5.0 软件构建了
系统进化树，结果如图 3 所示。所有的单子叶植物归为一类，双子叶植物可以明显的分为两大类。
CeAP1 与球花石斛的 DthyFL2 聚在一起，而且兰科植物的 AP1 大多数都聚在一起，说明兰科植物
AP1 的相似度较高，这预示着它们的功能具有一定的相似性。


图 3 CeAP1 基因编码蛋白的系统进化树分析
自展值（1 ~ 1 000）标记各个节点。
Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of proteins encoded by CeAP1 genes
Boot-strap values from 1 000–replicates are indicated at each node.
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2.3 AP1 在建兰不同发育时期和不同组织的表达分析
为了解 CeAP1 的功能，利用荧光定量 PCR 方法检测了其在建兰不同器官和不同发育阶段的表
达情况，结果如图 4 所示。在花发育初期（< 0.5 cm 花芽）CeAP1 高水平表达，以后各发育阶段都
较低，衰败时期最低。同时也检测了盛开花的各组织和各营养器官的表达情况，CeAP1 在根、叶和
花梗等营养器官中表达水平较高，尤其在花梗中的表达水平最高；在成熟的花器官中只有在合蕊柱
中表达，其他花组织中几乎不表达。

图 4 CeAP1 基因的表达分析
Fig. 4 Expression analysis of CeAP1

2.4 建兰 AP1 与其它 MADS-box 转录因子相互作用的分析
为了分析建兰各类 MADS-box 转录因子间的互相作用，将构建好的 AD-CeAP1 质粒分别与
BD-CeAP1、BD-CeAP31、BD-CeAP32、BD-CePI1、BD-CeAG1、BD-CeSTK、BD-CeSEP3 和
BD-CeAGL6 相应地共转化到酵母 AH109 菌种中。试验结果表明：共转化的酵母菌株能在二缺培养
基中正常生长，除 CeAP1 和 CeAG 质粒共转化的酵母菌种不能在四缺培养基中正常生长外，其它共
转化的酵母菌株都能在四缺培养基中正常生长，且 X-gal 显色检验都呈蓝色（图 5），这说明 CeAP1
能形成同源二聚体，同时 CeAP1 也能与 B 类、D 类和 E 类 MADS-box 转录因子相互作用，但不能
与 C 类 MADS-box 转录因子 CeAG 相互作用。


图 5 酵母共转化子在 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 培养基的生长情况
1：阳性对照；2：阴性对照；3：CeAP1 和 CeAP1；4：CeAP1 和 CeAP31；5：CeAP1 和 CeAP32；6：CeAP1 和 CePI1；7：CeAP1 和 CeAG1；
8：CeAP1 和 CeSTK；9：CeAP1 和 CeSEP3；10：CeAP1 和 CeAGL6。
Fig. 5 Selective dropout medium lacking Leu，Trp，His and Ade supplemented
1：Positive control；2：Negative control；3：CeAP1 and CeAP1；4：CeAP1 and CeAP31；5：CeAP1 and CeAP32；6：CeAP1 and CePI1；
7：CeAP1and CeAG1；8：CeAP1 and CeSTK；9：CeAP1 and CeSEP3；10：CeAP1 and CeAGL6.
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3 讨论
APl/SQUA 亚族的 AP1 及其同源基因已从多种植物中克隆获得，但对它们的确切功能还不是十
分清楚。为了研究 APl/SQUA 基因在建兰中的作用，本试验中通过 RACE 技术克隆了 CeAP1。氨基
酸序列比对结果显示它和大多数兰花的 APl/SQUA 亚族基因的蛋白相似，CeAP1 的 C 末端有一个保
守的 paleoAP1 结构域（LPPWML），系统进化分析表明，CeAP1 基因属于 APl/SQUA 亚族单子叶植
物的 SQUA 分化枝，且和其它兰花的相似度较高。这些结果均表明，CeAP1 基因属于 MADS-box 基
因家族中的 APl/SQUA 亚族成员。
Litt 和 Irish（2003）研究了 APl/SQUA 亚族 MADS-box 基因的系统进化，指出在核心双子叶植
物内有 euAP1 和 euFUL 两个分化枝，在单子叶植物中只有一个类似于 euFUL 的分化枝 FUL-like。
euAP1 进化枝在非核心双子叶植物和单子叶植物内缺乏其同源基因，这表明控制这两类植物花发育
的机制可能与核心双子叶植物存在一定的差异。系统发育分析表明，所有单子叶植物基因属于同一
分化枝，这也表明在单子叶植物的祖先中只有一个 FUL-like 基因存在。同时系统发育分析结果还表
明在单子叶植物中至少发生了两个主要重复事件：一个发生在禾本科分化之前和另一个发生在禾本
科内。兰科植物的 APl/SQUA 亚族应该在树兰亚科分化前就发生了基因重复。
大多数 APl/SQUA 亚族基因在植物的早期分生组织和花原基中表达，如典型的 APl/SQUA 亚族
基因 SQUA 和 AP1。本试验的 CeAP1 基因在建兰花发育初期高水平表达，在以后各阶段表达水平都
较低，这与 AP1 是花分生组织特性决定基因的功能相吻合。CeAP1 只在营养器官和成熟花的合蕊柱
中表达，这表明建兰的 APl/SQUA 亚族基因 CeAP1 与外两轮花器官的发育关系不大。APl/SQUA 亚
族基因在盛开花中的表达模式有一定的差异。正常的 SQUA 和 AP1 只存在于成熟花的萼片和花瓣中
（Huijser et al.，1992；Mandel et al.，1992；Kempin et al.，1995）。DOMADS2 只在合蕊柱和胚珠中
表达（Yu & Goh，2000），烟草的 NtMADS11 在萼片、心皮和花瓣中表达（Yan et al.，2000），MdMADS2
在成熟花 4 轮花器官中都表达（Sung et al.，1999）。有趣的是，单子叶植物水稻的 OsMADS18、百
合的 LMADS5/6、石斛兰的 DthyrFL2 和文心兰 OMADS10 与 CeAP1 一样，都在营养器官中表达
（Masiero et al.，2002；Fornara et al.，2004；Martin et al.，2005；Chen et al.，2008；Chang et al.，
2009），这可能意味着某一类 AP1 基因在单子叶植物中功能保守。
MADS-box 蛋白间的相互作用对于正确行使它们的功能是必需的（Pelaz et al.，2001；Theißen &
Saedler，2001），所以通过酵母双杂交的方法来验证 CeAP1 与建兰其他 MADS-box 蛋白间的相互作
用。试验结果显示除了 CeAG1 不能与 CeAP1 相互作用，其他的 MADS-box 转录因子都能与 CeAP1
相互作用。在建兰中有两个 C 类 MADS-box 基因 CeMADS1 和 CeMADS2，而且 Wang 等（2011）认
为 CeMADS1 在建兰生殖器官的发育中起着主要作用。本试验分离的 CeAG1 与 CeMADS2 具有极高
的相似性，应该是同一个基因。APl/SQUA 亚族基因在单子叶植物中大都存在基因重复的现象，如
在玉米中至少有 5 个（Fischer et al.，1995；Mena et al.，1995），水稻中有 3 到 4 个（Kyozuka et al.，
2000），石斛兰中有 3 个（Martin et al.，2005）。同时 APl/SQUA 亚族基因具有花器官和花分生组织
特性决定两方面的功能。因此，本试验中分离的 CeAP1 基因应该是花分生组织特性决定基因，在建
兰中应该还有其它行使花器官决定的 APl/SQUA 亚族基因存在。

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