全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（1）：1–9 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–07–05；修回日期：2012–12–19
基金项目：国家‘863’计划项目（2011AA100204）；国家自然科学基金项目（31171935）；现代园艺科学优势学科建设工程专项项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhangzh@njau.edu.cn；Tel：025-84395724）
致谢：美国田纳西大学（University of Tennessee，Knoxville，USA）程宗明教授帮助修改审校了英文摘要和关键词等部分文字。
湖北海棠 MhWRKY40b 在几种胁迫下的表达分
析
罗昌国 1,2，渠慎春 1，张计育 3，王三红 1，乔玉山 1，张仕杰 1，刘 丹 1，
章 镇 1,*
（1 南京农业大学园艺学院，南京 210095；2贵州省农业科学院果树科学研究所，贵阳 550006；3江苏省中国科学院
植物研究所，南京 210014）
摘 要：为了分析 WRKY40 抗病抗逆作用，以湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp）Rehd.]为试材，
利用特异引物进行 RT-PCR 基因克隆，利用实时荧光定量 PCR 方法分析组织中基因的表达及低温、高盐、
干旱、PEG6000 胁迫和外源 IAA、ABA 处理对基因表达的影响。结果表明，克隆到的片段长度为 1 240 bp，
包含一个完整的开放阅读框，长 999 bp，编码 333 个氨基酸。该基因与拟南芥 AtWRKY40 同源，故命名
为 MhWRKY40b，GenBank 登录号为 JX112913。基因表达分析表明，MhWRKY40b 在根、茎、叶等组织均
有表达，其中在花萼、花辨、果实中表达量较高。该基因明显受低温、高盐、干旱胁迫诱导表达，最高
相对表达量可达 20 倍以上；而受 PEG、苹果白粉病菌及外源 ABA 和 IAA 轻微诱导，最高相对表达量在
10 倍以下。MhWRKY40b 除了在抗白粉病方面与 AtWRKY40 具有相似功能外，可能还在湖北海棠的抗寒、
抗盐、抗旱过程中起到比较重要的作用。
关键词：湖北海棠；WRKY 转录因子；抗逆性；抗病性；ABA
中图分类号：S 661 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）01-0001-09

Expression Analysis of Malus hupehensis（Pamp）Rehd. MhWRKY40b Gene
in Response to Several Stresses
LUO Chang-guo1,2，QU Shen-chun1，ZHANG Ji-yu3，WANG San-hong1，QIAO Yu-shan1，ZHANG
Shi-jie1，LIU Dan1，and ZHANG Zhen1,*
（1College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2 Institute of Fruit，Guizhou Academy
of Agricultural Sciences，Guiyang 550006，China；3Institute of Botany，Jiangsu Province & Chinese Academy of Sciences，
Nanjing 210014，China）
Abstract：In order to reveal the role of WRKY40 gene in response to diseases and environmental
stresses，Malus hupehensis（Pamp）Rehd. was used for gene cloning by reverse transcription PCR
amplification by using specific primers. Quantitative real-time PCR was used in analyzing gene expression
in tissues and in response to stresses，including cold，high salinity，drought，PEG6000 and treatments of
exogenous ABA（abscisic acid）and IAA（indole-3-acetic acid）. A 1 240 bp fragment Arabidopsis

2 园 艺 学 报 40 卷
AtWRKY40，and it is named as MhWRKY40b. Its GenBank accession is JX112913. Gene expression
indicated that MhWRKY40b expressed in root，stem，leaf and other tissues，especially high in calyx，petal
and fruit. It was clearly induced by cold，high salinity，and drought with more than 20 folds increased
expression at the highest level，and slightly induced by PEG osmotic stress，Podosphaera leucotricha，
exogenous ABA，and IAA，with less than 10 folds increase at the highest level. MhWRKY40b may have
similar function to AtWRKY40 in powdery mildew resistance，it may also have a role in cold，salinity and
drought tolerance.
Key words：Malus hupehensis（Pamp）Rehd.；WRKY transcription factor；stress tolerance；diseasy
resistance；ABA（abscisic acid）

湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp）Rehd.]为蔷薇科梨亚科苹果属多年生落叶小乔木，是中国
南方苹果常用的砧木，抗病、抗逆性强（束怀瑞，1999）。从苹果属中的一些抗性较强材料中挖掘优
异的抗性基因资源有可能在苹果抗性育种得到应用（Patocchi et al.，1999）。湖北海棠是中国不可多
得的苹果属多抗植物资源之一，对其抗性相关的 WRKY 基因展开克隆、表达等方面的研究，可从
一定层面上揭示其抗性机理。
WRKY 转录因子家族是一类 N 端具保守的 WRKY 氨基酸系列、C 端具保守的 Cx4–5Cx22–23HxH
或 Cx7Cx23HxC 锌指结构的转录因子家族。根据高等植物的 WRKY 保守结构域可将其分为 GroupⅠ、
GroupⅡa、GroupⅡb、GroupⅡc、GroupⅡd、GroupⅡe 和 Group Ⅲ。不同的植物种类 WRKY 基因
的数量不一样，例如拟南芥 74 个、水稻 102 个、大豆 197 个，WRKY 基因具有很多的功能，其中
主要功能是调控植物的抗病性和抗逆性（李淑敏 等，2008；Rushton et al.，2010；Ishihama & Yoshioka，
2012）。在果树中，葡萄（Vitis vinifera）的 VvWRKY1、VvWRKY2 等基因与抗病相关（李慧娥和郭
其强，2012）；野生的华东葡萄（Vitis pseudoreticulata）的 VpWRKY1 和 VpWRKY2 与抗病抗逆相关
（Li et al.，2010）；柑橘和苹果中亦有少量抗病或抗逆相关 WRKY 的报道（Sanchez-Ballesta et al.，
2003；蒋阿维 等，2010；高华 等，2011；Gardiner et al.，2012）。
张计育等（2011）亦从湖北海棠中克隆到了一个属于 GroupⅡd 的抗病相关的 WRKY 基因。Group
Ⅱa WRKY 转录因子在拟南芥和水稻分别有 3 个和 4 个（Wu et al.，2005），在拟南芥及大麦中发现
该类型基因与抗白粉病有关，此外，在拟南芥上还发现该类型基因与 ABA 信号通路相关。
目前还没有苹果属 GroupⅡa WRKY 转录因子的研究报道，在 GenBank 上亦查不到相关的基因
序列信息。本研究中对湖北海棠中一个该类型的基因开展初步研究，以期为进一步的研究或应用提
供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2010—2011 年在南京农业大学进行。植物材料为湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp）
Rehd.]，本实验室保存。组织表达分析材料取自约 20 年生的植株，胁迫处理材料为来自组培苗的 2
年生盆栽植株。
1.2 基因克隆
采用 RT-PCR 方法从叶片的 cDNA 模板中克隆目的基因。以拟南芥（Arabidopsis thaliana）
1 期 罗昌国等：湖北海棠 MhWRKY40b 在几种胁迫下的表达分析 3

AtWRKY40 核苷酸为种子序列通过 Blastn 在苹果基因组数据库中（http：//genomics. research. iasma.
it）和 NCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/genbank/）中分别查找到苹果较相近核苷酸序列和苹果
属植物相似 EST 序列，采用 Premier 5 设计引物，经筛选后最终获得基因全长克隆用的特异引物，
上游引物 MhWRKY40b F（5′-TTAATTTCTGCAAATTGCAAGCC-3′）、下游引物 MhWRKY40b R
（5′-AAAAGAAAGGATAATGCCTACTC-3′）。
PCR 反应体系为模板 cDNA 1 μL（50 ng · μL-1），10 × PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 μL（25
mmol · L-1），dNTP 2.0 μL（2.5 mmol · L-1），上下游引物各 1.0 μL（100 ng · μL-1），1.0 U rTaq 酶，用
超纯水补足至 25 μL。PCR 程序为 94 4 min℃ ；94 30 s℃ ，56 30 s℃ ，72 2 min℃ ，35 个循环；
72 ℃延伸 10 min。
取 20 μL 的 PCR 产物，在 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。目的片段回收、连接、克隆参照相应说
明书方法进行，随机挑取 5 个以上单菌落进行测序（测序结果正确且结果之间一致性很好的序列 5
个或以上）。
经测序后在 BioXM2.2 软件上进行分析，预测其编码区和编码的蛋白，并在 NCBI 上进行 Blast
比对分析。
1.3 组织表达分析
分别取湖北海棠根、茎、叶、花、果实、种子及花药、花萼、花瓣、子房、花柱、花梗进行组
织表达分析，种子于 2010 年 11 月取样、果实于 2011 年 5 月下旬取样、其它组织于 2011 年 4 月中
旬取样，根系为直径 0.5 cm 以下细根，叶片为成熟叶片（枝条顶部自下 4 ~ 5 叶）。采用 CTAB 法分
别提取相应样品的 RNA，并反转录成单链 cDNA。每处理 3 次重复。
1.4 胁迫处理
各处理于 2011 年 5 月份进行。
白粉病处理：用苹果白粉病菌（Podosphaera leucotricha）接种，分别于 0、6、8、10、24、48 h
后取叶样。
冷胁迫处理：将苗木置于 4 ℃的低温光照培养箱中分别培养 0、4、12、24 h 后取叶样。
盐胁迫处理：用 200 mmol · L-1 的 NaCl 浇施 0、1、6、12 h 后取叶样。
渗透胁迫处理：用 10% PEG6000 浇施 0、1、6、12 h 后取叶样。
ABA 处理：用 10 mmol · L-1 的 ABA 喷施 0、4、12、24 h 后取叶样。
IAA 处理：用 1 μmol · L-1 的 IAA 喷施 0、1、3、5、7 h 后取叶样。
种子处理：4 ℃珍珠岩层积发芽处理 40 d 的发芽种子和常温干燥保存种子。
水分胁迫处理：模拟干旱（干旱 10 d）、正常（每 2 d 浇水 1 次）、水涝（苗木连同花盆在水中
浸泡 14 h）的条件，同一时间点取叶样，并采用烘干法测定叶片的相对含水量（relative water content，
RWC），公式为：RWC =（FW–DW）/（TW–DW），FW 为叶片鲜样质量（fresh weight），DW 为
叶片干样质量（dry weight），TW 为水分饱和叶片鲜样质量（turgid weight）。
每处理 3 次重复。采用 CTAB 法分别提取相应样品的 RNA，并反转录成单链 cDNA。
1.5 荧光定量 PCR 分析
以上述组织和胁迫处理的单链 cDNA 为模板，采用 ABI 7300 实时荧光定量系统进行基因表达
分析。实时荧光定量 RT-PCR 上游引物为 Q-MhW40b F（5′-GTCCCAATAGTGCCGTGTG-3′）、下游
引物为 Q-MhW40b R（5′-TCTCTAAGTGATAACAAGGTAAC-3′）。内参基因引物上、下游引物分别
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为 Mh tubulin F（5′-AGGATGCTACAGCCGATGAG-3′）和 Mh tubulin R（5′-GCCGAAGAACTGAC
GAGAATC-3′）。反应体系为：模板 cDNA 1 μL（10 ng · μL-1），上下游引物分别为 0.25 μL，SYBR®
Premix Ex TaqTM（TaKaRa）10 μL，ddH2O 8.5 μL。反应程序为：95 ℃ 4 min；95 20 s℃ ，60 20 s℃ ，
72 40 s℃ ，40 个循环。
数据分析用 ABI 7300 system 软件和 2- C△△ T方法（Livak & Schmittgen，2001）。每处理重复 3
次。
2 结果与分析
2.1 MhWRKY40b 克隆及序列分析
利用研究中设计的引物，从叶片的 cDNA 模板上扩增出单一的条带，大小约 1 300 bp 左右。经
进一步克隆测序，目的片段大小为 1 240 个核苷酸，具有一个完整的开放阅读框，长度为 999 个核
苷酸，编码 333 个氨基酸。通过在苹果基因组数据中进行比对，发现所获得序列与位于第 8 条染色
体的 MDC017768.324 contig 一致性最高，为 95% ~ 100%。其推导的氨基酸序列 N 端具有 LZ 和
WRKYGQK 的保守结构域，C 端具 Cx4–5Cx22–23HxH 保守结构域（图 1），因此认为所获得的片段系
WRKY 家族基因成员。
进化分析表明该基因与 AtWRKY40 同源并聚在同一支中，属于 WRKY 家族基因 GroupⅡa 成员，
故命名为 MhWRKY40b，GenBank 登录号为 JX112913。



图 1 AtWRKY40 蛋白和推导的 MhWRKY40b 蛋白的保守结构域
阴影部分为氨基酸序列一致性为 100%的区域；下划线部分表示保守的结构域。
Fig. 1 The conserver domain of AtWRKY40 and predicted MhWRKY40b protein
Shaded regions indicate that the identity is 100%；
The underline region shows conserver domain.

2.2 MhWRKY40b 在组织中的表达特性
MhWRKY40b 在根、茎、叶、花、果实、种子等组织中都有表达，表达量从高到低依次为：花
萼、花瓣、果实、种子、雄蕊、子房、花、叶片、花梗、花柱、根、茎（图 2）。其中，花萼表达量
为叶片的 206 倍；茎的表达量仅为叶片的 1/10。
1 期 罗昌国等：湖北海棠 MhWRKY40b 在几种胁迫下的表达分析 5


图 2 MhWRKY40b 在组织中的表达
Fig. 2 Tissues expression of MhWRKY40b gene in Malus hupehensis plants

2.3 MhWRKY40b 在非生物胁迫下的表达特点
冷和盐胁迫都能够强烈诱导 MhWRKY40b 表达，4 ℃的低温（图 3，A）和 200 mmol · L-1 的 NaCL
处理（图 3，B）下其上调表达至最高值分别出现在 12 h 和 6 h，相对表达量分别为 0 h 时的 77.0 倍
和 36.1 倍。


图 3 4 ℃低温（A）和 NaCl（B）诱导 MhWRKY40b 表达
Fig. 3 Expression of MhWRKY40b in Malus hupehensis induce by cold（4 ℃，A）and NaCl（B）treatments


正常、干旱、水淹处理的叶片相对含水量分别为 71.8%、89.6%、92.3%。MhWRKY40b 受水分
胁迫上调表达，尤其是干旱胁迫诱导较为强烈，相对表达量为正常条件下的 21.8 倍；而水淹诱导较
为轻微，为正常条件的 4 倍（图 4，A）。
水分胁迫导致 ABA 积累。为进一步了解 ABA 处理是否对基因表达产生影响，采用了 10
mmol · L-1 的 ABA 喷施苗木，结果 MhWRKY40b 受到 ABA 诱导上调表达，处理后 4 h 达到最高，是
0 h 时表达量的 3.2 倍，之后 12 h、24 h 分别下降至 2.5 倍和 1.4 倍（图 4，B）。
休眠的种子含水量低，ABA 含量高。为深入了解 MhWRKY40b 与 ABA 之间的关系，分别在休
眠和萌发种子中测定基因的表达量。结果显示 MhWRKY40b 在萌发种子中表达量为休眠种子的 6.8
倍（图 5，A）。
高分子量的 PEG 亦是使植物体或组织产生失水效应的一种试剂，PEG6000 浇施苗木后 1 h，基
因表达即上调 3.2 倍，6 h 和 12 h 又下降至 1.8 和 1.1 倍（图 5，B）。
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图 4 水分胁迫（A）和 ABA（B）处理中的 MhWRKY40b 表达
Fig. 4 Expression of MhWRKY40b in response to water stress（A）and exogenous ABA（B）treatment


图 5 休眠和发芽种子处理（A）及 PEG 处理（B）的 MhWRKY40b 表达
Fig. 5 Expression of MhWRKY40b in response to seeds treatments（A）and PEG treatments（B）

2.4 MhWRKY40b 受苹果白粉病菌和外源 IAA 诱导的表达特点
在接种苹果白粉病菌后，MhWRKY40b 出现了上调表达，相对于对照（0 h），在处理后 8 h 出现
3.8 倍的最高表达量，之后下降（图 6，A）。
喷施 IAA，MhWRKY40b 亦上调表达，最高表达量出现在处理后 3 h，是 0 h 时的 5.8 倍，表现
为先升后降的特点（图 6，B）。

图 6 接种苹果白粉病菌（A）和 IAA（B）处理中 MhWRKY40b 表达
Fig. 6 Expression of MhWRKY40b in response to P. leucotricha（A）and exogenous IAA（B）treatments
1 期 罗昌国等：湖北海棠 MhWRKY40b 在几种胁迫下的表达分析 7

3 讨论
利用所设计的特异引物可从湖北海棠 cDNA 模板上克隆到 MhWRKY40b 的完全编码区，从推导
的氨基酸序列的一致性、保守结构域、进化方面都支持其与 AtWRKY40[tair（http：//www. arabidopsis.
org/）登录号：AT1G80840]基因同源。苹果基因组已于 2010 年公布（Velasco et al.，2010），使得苹
果属植物基因克隆更容易了，同源基因克隆的策略大致可采取从模式植物上获取同源基因序列（核
苷酸或氨基酸），通过在苹果基因组数据库比对出相似度高的苹果序列（核苷酸或氨基酸），再用获
得苹果序列（核苷酸）去比对苹果属植物 EST 序列的方法或辅之以 RACE 的方法来获得基因的完整
编码区，经过引物的进一步设计和筛选可获得某一基因克隆的特异引物（许瑞瑞 等，2012）。虽然
苹果基因组测序完成使得苹果属植物克隆变得相对容易（许瑞瑞 等，2012），但是苹果遗传背景较
为复杂，预测的基因数多达 57 386 个，基因组数据还需要不断完善，有待于大量的研究去证实。例
如，通过 AtWRKY40 在苹果基因组数据库中比对得到相似性最高的前 3 个苹果预测蛋白，其氨基酸
序列长度最长的只有 321 个氨基酸，很显然仅从长度上看，与实际克隆得到的目标基因（333 个氨
基酸）有一定差距。本研究中所获得的 MhWRKY40b 证实了湖北海棠具有 AtWRKY40 的同源基因。
此外，还克隆到了一个 AtWRKY40 的同源基因 MhWRKY40a（待发表），MhWRKY40a 和 MhWRKY40b
在序列上差异较大，功能上可能亦如此。因此，MhWRKY40 很多方面还很值得去深入研究。
MhWRKY40b 在所分析的组织中均有表达，尤其在花萼、花辨等花部位及果实中表达量相对较
高。从前人的相关研究和作者所做的研究都表明 WRKY40 基因可能参与调控了植物多方面的抗性。
胁迫可诱导植物开花、结实（Kranner et al.，2010；Yaish et al.，2011），从这一角度看，其在生殖器
官中表达量较高与其在多种胁迫条件下上调表达情况较一致则不难理解了。
MhWRKY40b 受外源 ABA、冷、干旱、盐胁迫诱导上调表达，尤其是受到冷、盐、干旱的强烈
诱导，相对表达量最高均达 20 倍以上，说明 MhWRKY40b 响应这些胁迫，并有可能在这些胁迫反应
中起到了重要调控作用。ABA 信号途径参与了冷、干旱、盐等植物逆境胁迫反应（Mahajan & Tuteja，
2005），而在模式植物拟南芥上的逆境研究为其它植物提供了良好的基础（Chew & Halliday，2011）。
拟南芥中 Group Ⅱa WRKY 转录因子包括 AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY60，它们在 ABA 信
号通路中都扮演重要的角色，三者作用从大到小依次为 AtWRKY40、AtWRKY18、AtWRKY60，应
用酵母双杂证实了它们都能与 ABA 受体蛋白 ABAR 互作，AtWRKY40 还可直接结合到 ABA 信号
应答基因 ABI5 的 W box 元件上，从而调控 ABA 信号通路（Chen et al.，2010；Shang et al.，2010；
Antoni et al.，2011；Rushton et al.，2012）。AtWRKY40 亦受到外源 ABA 处理及盐、干旱、冷胁迫诱
导上调表达（Matsui et al.，2008）。MhWRKY40b 在应答上述胁迫过程中可能具备了 AtWRKY40 类似
的功能，并与 ABA 信号途径有所联系。
ABA 是促进种子休眠、抑制种子萌发的重要植物激素，而 GA 则是打破休眠、促进种子萌发的
植物激素（Koornneef et al.，2002；Razem et al.，2006；Daszkowska-Golec，2011）。值得注意的是，
MhWRKY40b 在萌发的种子出现上调表达。在种子萌发过程中，MhWRKY40b 蛋白可能具备了
AtWRKY40 相似的功能，即可结合到 ABA 信号通路关键基因 ABI5 启动子区的相应元件上，抑制
ABI5 的表达和 ABA 信号传递，从而达到解除种子休眠、促进种子萌发的作用（Piskurewicz et al.，
2008；Raghavendra et al.，2010；Hauser et al.，2011）。
已经有研究证实，AtWRKY40 通过调节 EDS1 信号通路和亚麻荠素（camalexin）的合成过程参
与了拟南芥白粉病抗性的调控，白粉菌处理野生型拟南芥 8 h，AtWRKY40 上调表达 2.1 倍（Pandey et
al.，2010）。植保素是植物抗病的重要代谢产物，它的合成与生长素的合成具有类似的途径（Lau et
8 园 艺 学 报 40 卷
al.，2008；Ahuja et al.，2012）。植保素也是黄瓜受到白粉病菌浸染后产生的主要抗病产物，其含量
在病原菌浸染后明显增加（Daayf et al.，1997）。大麦上与 AtWRKY40 同源的基因 HvWRKY1、HvWRKY2
编码的蛋白与R抗病基因MLA编码的蛋白互作，实现了对大麦白粉病抗性的调控（Shen et al.，2007）。
本研究中，MhWRKY40b 都受到苹果白粉病菌和外源的 IAA 处理诱导上调表达，其在抗白粉病方面
可能与 AtWRKY40 具有相似的功能，并可能通过 IAA 或植保素的合成途径来参与湖北海棠抗病性的
调控。

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