全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（2）：387–394 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–09–07；修回日期：2011–12–27
基金项目：国家自然科学基金项目（40961019）；‘西部之光’人才培养计划项目[2009（236）]；广西科技攻关项目（桂科攻 11107010-2-10）；
桂林科技攻关项目（20080103-1）；广西植物研究所基本科研业务费项目（桂植业 09005）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xiyang0687@163.com）
多倍体无籽罗汉果及其亲本遗传背景的 ISSR分
析
韦荣昌 1,2,3，李 虹 1，蒋建刚 4，李 锋 1,5，蒋水元 1，黄夕洋 1,*
（1 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西桂林 541006；2 中国医学科学院 & 北京协和医学院，药用植
物研究所，北京 100193；3 广西药用植物园，南宁 530023；4 桂林亦元生现代生物技术有限公司，广西桂林 541004；
5 广西科学院，南宁 530003）
摘 要：应用 ISSR 分子标记探讨多倍体无籽罗汉果及其亲本材料的遗传背景。结果发现：多倍体无
籽罗汉果及其亲本的相似性系数为 0.6399 ~ 0.8566，F1 代与四倍体母本之间的平均相似性系数高于其与二
倍体父本之间的相似性系数，说明子代从母本继承的遗传物质更多，遗传上倾向母本。且 F1 代与亲本之
间的平均遗传相似性系数大于或小于亲本之间，随亲本的组合和相应的 F1 代而定；结合聚类图和双变量
主坐标分析，可知：基本上子代和母本排列并聚在一起，而且父本、母本、子代彼此之间距离相对较近
地聚在一起；因此还是体现了“子似亲”的遗传现象。
关键词：罗汉果；多倍体；遗传背景；ISSR
中图分类号：S 668.9 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）02-0387-08

ISSR Analysis of Genetic Background of Polyploidy Seedless Siraitia
grosvenorii and Their Parents
WEI Rong-chang1,2,3，LI Hong1，JIANG Jian-gang4，LI Feng1,5，JIANG Shui-yuan1，and HUANG
Xi-yang1,*
（1Guangxi Institute of Botany，Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences，Guilin，Guangxi
541006，China；2Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical
College，Beijing 100193，China；3Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants，Nanning 530023，China；4Guilin Sunnylife
Modern Bio-Tech INC，Guilin，Guangxi 541004，China；5Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530003，China）
Abstract：In this study，the genetic background of polyploidy seedless Siraitia grosvenorii and their
parents were revealed by ISSR（Inter simple sequence repeats）molecular marker technique. The results
showed that the genetic similarity coefficient between two individuals was from 0.6399 to 0.8566，and the
average coefficient between F1 generation and tetraploid female parent was higher than that between F1
generation and diploid male parent，which showed that the F1 generation got more genetic substance from
female parent than that from male parent，and the genetic phenomenon showed F1 generation was apt to
female parent. And the average coefficient between F1 generation and parents was higher or lower than that

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between parents. According to dendrogram analysis and double principal coordinate analysis，filial
generation and female parent arrayed and clustered together，and if genetic distance of male parent，female
parent and filial generation was near，they would array together too. So，in general，the genetic
phenomenon embodied“filial generation was similar to parents”.
Key words：Siraitia grosvenorii；polyploidy；genetic background；ISSR

罗汉果[Siraitia grosvenorii（Swingle）C. Jeffrey]是单性、雌雄异株的葫芦科（Cucurbitaceae）
罗汉果属多年生藤本植物（路安民和张志耘，1984），为中国特有的珍贵药用和甜料植物，主要产
于广西的永福、临桂、龙胜等地。罗汉果果实含多种甜苷，其中甜苷Ⅴ为世界上最强的非糖甜味物
质之一，为蔗糖甜度的 300 ~ 400 倍，广泛应用于食品、保健品、药品中，是糖尿病人、肥胖者、
高血压患者的理想糖替代品（李典鹏和张厚瑞，2000）。多倍体罗汉果可大幅提高根、茎、叶、果
实等部位的生物量和产量，增强抗逆性，提高活性成分含量，其中三倍体罗汉果还具有无籽的特性，
大大提高整果利用率和甜苷提取收得率（黄夕洋 等，2009；蒋水元 等，2009）。
为了选育出具有更强大杂交优势和多倍体优势的新型多倍体无籽罗汉果品种（系），必须大量地
选择杂交亲本和在杂交后代中进行大量的筛选，所以有必要弄清杂交后代及其亲本的遗传背景。因
此，本研究中利用 ISSR 分子标记技术（Zietkiewicz et al.，1994；范凯 等，2008；宋常美 等，2011），
探讨多倍体无籽罗汉果及其亲本的遗传背景，为罗汉果新品种（系）选育提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料采自广西桂林兴安县漠川乡的罗汉果种植基地，总共采集到 15 份材料：四倍体母本 3
份，由秋水仙素人工诱导二倍体母本染色体加倍，并通过组织培养获得；二倍体父本 3 份；F1代 9
份，由四倍体母本和二倍体父本人工授粉杂交获得（表 1）。每份材料选取生长状况良好的罗汉果
单株 3 ~ 5 株，采集约 10 片健康成熟叶片并混合成该份材料的样品，用硅胶干燥保存，带回实验室
中待用。
表 1 试验材料来源、倍性和雌雄
Table 1 Materials of variety、ploid and male/female used in the study
编号
Number
材料
Material
倍性
Ploid
雌雄
Male/female
F401  农家品系 Nongjia 4x ♀
F403 伯林 3 号 Bolin 3 4x  ♀
F406 科研 1 号 C 株系 Keyan 1 C  4x  ♀
M202 青皮果 Qingpiguo 2x  ♂
M205 冬瓜果 Dongguaguo 2x  ♂
M206 长滩果 Changtanguo 2x  ♂
F301 F403 × M205 3x  ♀
F302 F403 × M206 3x  ♀
F304 F403 × M202 3x  ♀
F305 F406 × M205 3x  ♀
F306 F406 × M206 3x  ♀
F308 F406 × M202 3x  ♀
F310 F401 × M205 3x  ♀
F311 F401 × M206 3x  ♀
F313  F401 × M202  3x  ♀
2 期 韦荣昌等：多倍体无籽罗汉果及其亲本遗传背景的 ISSR 分析 389

1.2 ISSR 分析
采用改良的 CTAB（2 ×）法（Doyle & Doyle，1987）提取罗汉果叶片的总 DNA。
PCR-ISSR 反应体系及反应程序（周俊亚 等，2005）：25 μL PCR 扩增反应体系中含 10 × Buffer
2.5 μL，MgCl2 2.0 mmol · L-1，脱氧核糖核苷酸（dNTP）0.2 mmol · L-1（上海生工生物工程技术服务
有限公司），ISSR 引物 0.5 μmol · L-1（上海生工生物工程技术服务有限公司），Taq DNA 聚合酶（MBI
Fermentas 公司）1.0 U，模板 DNA 约 30 ~ 50 ng，超纯水补至 25 μL。在 PCR 仪（美国 BIO-RAD
伯乐公司，Model：PTC-200）上进行以下扩增反应程序：94 ℃预变性 3 min，接着进行 40 个循环
（94 ℃变性 1 min，52 ℃退火 52 s，72 ℃延伸 2 min），循环结束后 72 ℃延伸 7 min。
引物筛选：从材料中随机选出 6 份样品（包含 2x、3x、4x）进行引物筛选，从 100 条 ISSR 引
物中筛选出 13 条扩增反应稳定，条带清晰，具有多态性的引物，并用于所有材料的扩增。13 个 ISSR
引物名称、序列见表 2。
表 2 引物名称、序列及其对 15 份材料的扩增条带统计
Table 2 Primers，sequences and the amplification on 15 individuals
引物
Primers
引物序列（5′–3′）
Sequence
扩增总条带数
No. of total bands
多态性条带数
No. of polymorphic bands
多态性百分比/%
Percentage of polymorphic bands
UBC823 (TC)8C 5 3 60.00
UBC825 (AC)8T 8 5 62.50
UBC826 (AC)8C 7 3 42.86
UBC827 (AC)8G 9 5 55.56
UBC846 (CA)8RT 10 7 70.00
UBC850 (GT)8YC 4 3 75.00
UBC857 (AC)8YG 8 5 62.50
UBC873 (GACA)4 14 12 85.71
UBC881 (G)3(TGGGG)2TG 11 10 90.91
UBC889 DBD(AC)7 9 4 44.44
UBC891 HVH(TG)7 9 7 77.78
UBC896 AGGT(CG)2G
CCGC(N)5ATG
11 10 90.91
UBC900
总计 Total
AC(T)2(C)3(CA)2
(G)2(T)2(A)2(CA)2
20
125
18
92
90.00
73.60
注：N =（A、G、C、T），R =（A、G），Y =（C、T），B =（C、G、T）（i.e. not A），D =（A、G、T）（i. e. not C），H =（A、C、T）
（i.e. not G），V =（A、C、G）（i. e. not T）。
Note：N =（A，G，C，T），R =（A，G），Y =（C，T），B =（C，G，T）（i.e. not A），D =（A，G，T）（i. e. not C），H =（A，C，T）
（i.e. not G），V =（A，C，G）（i. e. not T）.

琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物：将扩增产物置于 1.5 %的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶上所加电压
不超过 5 V · cm-1，用 Lambda DNA/EcoRⅠ+ HindⅢ Marker（MBI Fermentas 公司）作为标准分子
量对照，经溴化乙锭（EB）染色 20 ~ 30 min，在凝胶成像系统上观察照相、记录。
ISSR 为显性标记，同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，相同迁移
位置上有扩增条带记录为 1，无扩增条带记录为 0，构建 0，1 原始矩阵。仅清晰、稳定、可分辨的
并且长度在 400 ~ 2 000 bp 范围内的 ISSR 扩增条带才被记录。
用 AFLP-SURV version 1.0（Vekemans et al.，2002）计算材料间遗传距离 D，按 D =–LnI 计算
Nei & Li 遗传相似性系数。
用 NTSYS-pc version 2.02（Rohlf，1998）软件的 UPGMA（Unweighted Pair Group Method Using
Arithmatic Average）方法进行聚类分析；用 GenAIEx version 6.3（Peakall & Smouse，2006）进行主
坐标分析。
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2 结果与分析
2.1 多态性分析
用 13 个 ISSR 引物对 15 份样品的总 DNA 进行 PCR 扩增，重复两次，两次扩增产物重复性好
且稳定，扩增得到的条带数及多态性条带见表 2。13 个引物扩增条带数的范围为 4 ~ 20 条，共同带
在 1 ~ 5 条内，多态性条带数范围为 3 ~ 18 条，多态性百分比为 44.44% ~ 90.91%，且由总计的结果
可知，扩增总条带数为 125 条（平均每个引物 9.62 条），其中多态性总条带数为 92 条，多态性条带
百分比（PPB）为 73.60%。引物 UBC900 得到的条带数最多，为 20 条；引物 UBC850 得到的条带
最少，为 4 条。其中引物 UBC873 和 UBC900 的扩增图谱见图 1。此外，在不同罗汉果品种间存在
的多态性条带可作为鉴定品种的特征带。
图 1 引物 UBC873（左）和 UBC900（右）对 15 份材料的 ISSR 扩增图谱
Fig. 1 ISSR profiles amplified from DNA of 15 individuals using primer UBC873（left）and UBC900（right）

2.2 遗传相似性系数及遗传距离
15 份材料的相似性系数及遗传距离见表 3。由表可知，15 份材料间的相似性系数变化范围为
0.6399 ~ 0.8566，其中子代 F311 与父本 M205 间的相似性系数最低（0.6399），即遗传距离最高
（0.4465）；而子代 F313 与母本 F403 间的相似性系数最高（0.8566），即遗传距离最小（0.1548）。
而且，从 F1代与母本之间、以及其与父本之间的遗传相似性系数相比较可知，子代与母本的相似性
系数大多数比与父本的高，遗传上更可能倾向母本多些。
表 3 15 份材料的遗传距离（左下）及相似性系数（右上）
Table 3 The genetic distance（down left）and similarity coefficient（up right）of 15 individuals
编号
Number F401 F403 F406 M202 M205 M206 F301 F302 F304 F305 F306 F308 F310 F311 F313
F401 0.8161 0.7778 0.8391 0.6858 0.7701 0.7291 0.7212 0.7530 0.8008 0.7609 0.8406 0.7212 0.7763 0.8088
F403 0.2032 0.8084 0.8237 0.7165 0.7395 0.7132 0.7690 0.7530 0.8008 0.8088 0.8247 0.7212 0.7450 0.8566
F406 0.2513 0.2127 0.8161 0.7089 0.7625 0.7212 0.7451 0.6973 0.7929 0.7212 0.8168 0.6813 0.6733 0.7849
M202 0.1754 0.1939 0.2032 0.7089 0.7931 0.7165 0.7395 0.7395 0.8314 0.7778 0.7625 0.7395 0.7165 0.8391
M205 0.3771 0.3334 0.3441 0.3441 0.8237 0.6858 0.7241 0.7089 0.7089 0.7778 0.7012 0.7548 0.6399 0.7318
M206 0.2612 0.3018 0.2712 0.2318 0.1939 0.7241 0.7318 0.7165 0.7625 0.7854 0.7548 0.7778 0.7089 0.7701
F301 0.3159 0.3380 0.3269 0.3334 0.3771 0.3228 0.8084 0.7165 0.7625 0.7548 0.7548 0.7318 0.7395 0.7701
F302 0.3269 0.2627 0.2943 0.3018 0.3228 0.3122 0.2127 0.7395 0.8008 0.7931 0.7778 0.7701 0.7471 0.8237
F304 0.2837 0.2837 0.3606 0.3018 0.3441 0.3334 0.3334 0.3018 0.7701 0.7778 0.7625 0.7241 0.7625 0.8237
F305 0.2221 0.2221 0.2321 0.1846 0.3441 0.2712 0.2712 0.2222 0.2612 0.8084 0.8084 0.7854 0.7931 0.8544
F306 0.2732 0.2122 0.3269 0.2513 0.2513 0.2415 0.2813 0.2318 0.2513 0.2127 0.8161 0.8237 0.8008 0.8314
F308 0.1736 0.1927 0.2024 0.2712 0.3550 0.2813 0.2813 0.2513 0.2712 0.2127 0.2032 0.7165 0.7548 0.8314
F310 0.3269 0.3269 0.3838 0.3018 0.2813 0.2513 0.3122 0.2612 0.3228 0.2415 0.1939 0.3334 0.8391 0.7471
F311 0.2532 0.2943 0.3955 0.3334 0.4465 0.3441 0.3018 0.2915 0.2712 0.2318 0.2222 0.2813 0.1754 0.8008
F313 0.2122 0.1548 0.2422 0.1754 0.3122 0.2612 0.2612 0.1939 0.1939 0.1573 0.1846 0.1846  0.2915  0.2222  
2 期 韦荣昌等：多倍体无籽罗汉果及其亲本遗传背景的 ISSR 分析 391

2.3 聚类分析
图 2 为 15 份材料的聚类树状图，从图中可看出：子代 F313 与母本 F403 最先直接聚为一类，
两者距离最近；子代 F304 单独一支，与其余材料相距较远；基本上子代和母本排列并聚在一起；
父本除了 M202 外，M205 和 M206 也是排列并先聚类。


图 2 供试 15 份材料的 UPGMA 聚类图
Fig. 2 UPGMA dendrogram for 15 individuals

2.4 双变量主坐标分析
主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）是基于 Nei & Li 遗传距离及相应的相似性系
数进行的。因此，主坐标分析图中各个个体（品种）间的位置关系反映了它们在遗传上的相似性。
由于每份试验材料都是通过选取生长状况良好的罗汉果单株 3 ~ 5 株，共采集约 10 张健康成熟叶片
混合而成的，故此 15 份材料的主坐标分析可看作“双变量主坐标分析”（double principal coordinate
analysis，DPCoA：一种将物种与物种之间差异考虑到群体间相互关系的测度之中的排序方法）
（Pavoine et al.，2004；熊雄 等，2008）。通过 ISSR 标记对 15 份材料进行 DPCoA 排序，发现前 3
个主坐标的方差贡献率分别为 23.99%、21.69%和 16.64%，相对应的累积贡献率分别为 23.99%、
45.68%和 62.32%。一般认为，如果前 3 个主要特征向量的方差占总方差的 40%以上，则排序效果是
满意的（Gauch，1982），本试验结果前 15 份材料的前 3 个主要特征向量的方差累积贡献率高达
62.32%，说明了降维效果较好。因此，保留 DPCoA的前二轴对 15份材料进行排序分析，应用 GenAIEx
version 6.3 获取坐标轴特征值及样品特征向量，并据此划分出 15 份不同材料在 DPCoA 前二轴空间
中的排序图见图 3。
由 Proj 划分而得的 15 份材料在 DPCoA 排序图中空间分布十分明显，除 F308、F401 和 F403，
以及 F301 和 F302 有部分交叉重叠外，其余样品间均无交叉重叠现象。PCoA 排序图把 15 份材料分
为 3 大类。
第 1 大类为位于第Ⅰ和第Ⅲ区间的 7 份材料，其中 4x 母本 3 份：F401、F403、F406，2x 父本
1 份：M202，3x 子代 3 份：F305、F308、F313。
392 园 艺 学 报 39 卷

第 2 大类为位于第Ⅱ区间的 2 份材料，其中只包括 2x 父本 2 份：M205、M206。
第 3 大类为位于第Ⅳ区间的 6 份材料，其中只包括 3x 子代 6 份：F301、F302、F304、F306、
F310、F311。
比较图 2 和图 3 可知，对 15 份材料所进行的亲缘关系聚类分析和双变量主坐标分析的结果基
本上是一致的，父本、母本、子代彼此之间的距离相对较近聚在一起，而双变量主坐标分析能从多
个方向、多个层面更直观和准确地反映材料间的遗传关系。

图 3 15 份材料的第一、第二主坐标二维散点图
Fig. 3 The scatterplot of the first and second double principal coordinates on 15 individuals

2.5 遗传倾向性分析
根据表 3 中的 15 份材料间的相似性系数与遗传距离，分别求每个 4x 母本与 3 个 2x 父本、每
个 4x 母本与其 3 个 3x 子代的平均相似性系数与遗传距离，以及 2x 父本与 3x 子代的平均相似性系
数与遗传距离，如表 4 所示。
从表 4 的相似性系数来看，F1代与母本 F401、F403、F406 之间的平均相似性系数为 0.7688、
0.7451、0.7770，均高于 F1代与父本之间的平均相似性系数 0.7676、0.7190、0.7523，这说明了 F1

表 4 母本与父本和与 F1 及父本与 F1 间的平均遗传距离和相似性系数
Table 4 The average genetic distance and similarity coefficient between parents and between male and F1

世代
Generation
平均遗传距离
Average genetic distance
平均相似系数
Average similarity coefficient
母本 F401 与父本 Female F401 and male 0.2712 0.7650
母本 F401 与 F1 Female F401 and F1 0.2641 0.7688
父本与 F1 Male and F1 0.2669 0.7676
母本 F403 与父本 Female F403 and male 0.2764 0.7599
母本 F403 与 F1 Female F403 and F1 0.2948 0.7451
父本与 F1 Male and F1 0.3304 0.7190
母本 F406 与父本 Female F406 and male 0.2728 0.7625
母本 F406 与 F1 Female F406 and F1 0.2535 0.7770
父本与 F1 Male and F1 0.2856 0.7523
2 期 韦荣昌等：多倍体无籽罗汉果及其亲本遗传背景的 ISSR 分析 393

代与 4x 母本比与 2x 父本在遗传上更相似更接近、亲缘关系更近一些，即子代从母本继承的遗传物
质更多。且 F1代与亲本之间的平均遗传相似性系数大于或小于亲本之间的，随亲本的组合和相应的
F1代而定，但综合上还是体现了“子似亲”的遗传现象。
3 讨论
3.1 ISSR 技术多态性分析及其应用
根据 13 个 ISSR 引物对 15 份多倍体无籽罗汉果及其亲本的扩增结果表现出了不同程度的多态
性和共同性，这一方面说明了多倍体无籽罗汉果及其亲本材料遗传背景的复杂性，另一方面也说明
了材料之间具有一定的共同性（徐立 等，2005）。其中，有些子代的父本或者母本是相同的，则它
们之间的距离相对较近。由此可见，ISSR 对于亲缘关系较近的材料也能检测出较高的多态性，甚至
可能应用于同品种不同单株之间的多态性比较。同时在不同罗汉果品种间检测出数量不等的特征带，
说明 ISSR 技术可以应用于不同罗汉果品种之间的鉴别。
3.2 多倍体无籽罗汉果及其亲本的 ISSR 相关遗传分析
在 ISSR 分析结果中，遗传相似性系数和遗传距离的结果是一致的；而且系统聚类分析和主坐
标分析的结果基本上也是一致的，虽然聚类和主坐标都能对样品进行聚类分析，但它们所反映的信
息却有所不同，系统聚类分析对密切相关的个体间有很高的分辨率，其最终结果将所有的种质都聚
为一类，而主坐标分析却能在不同群体之间的距离上、从不同的方向和层面提供更多的信息，可以
更加直观的揭示供试材料之间的差异（张大乐 等，2007）。因此两者并不重复，一般将主坐标分析
和系统聚类分析结合起来使用，以便对聚类结果做全面的解释，所以，本研究中将遗传相似性系数、
遗传距离和聚类、主坐标分析结合起来全面分析多倍体无籽罗汉果及其亲本的遗传背景。
根据 ISSR 分析结果，有的材料之间虽然是不同的品种，但遗传相似性系数较高，说明了它们
的亲缘关系近；如：F313 因为由 F401（农家品系）与 M202（青皮果）株系杂交而成，所以与 M202
关系较近，其相似性系数高达 0.8391。此外，在 F1代中，如果子代的亲本是相同或相似性系数高的，
由于子代继承了亲本一定的遗传物质，从而 F1代间的相似性系数也会较高，如 F310 和 F311 由于其
母本都是 F401，故其相似性系数高达 0.8391；而 F308 和 F313 也都为同一父本 M202（青皮果），
所以其相似性系数也高达 0.8237。
3.3 多倍体无籽罗汉果育种中亲本选择的遗传依据分析
本研究的结果表明，F1代 3x 无籽罗汉果与四倍体母本之间的相似性系数都高于与二倍体父本之
间的，说明了 F1代 3x 无籽罗汉果从四倍体母本那里继承的遗传物质要多一些，即 F1代 3x 无籽罗汉
果的遗传倾向于四倍体母本。所以，在多倍体无籽罗汉果杂交育种亲本选配时，要特别重视四倍体
母本的选择。应选择生活力强、经济性状、农艺性状、生物学特征都较优良的四倍体作为杂交母本，
以便将更多的优良性状传给下一代。
此外，虽然四倍体母本具有很多优点，但是由于四倍体的细胞分裂速度要比二倍体慢得多，这
可能会导致它的某些生活力较差（季道藩，1984）。因此在今后的多倍体无籽罗汉果杂交育种中，需
要重视多倍体罗汉果、特别是无籽罗汉果的栽培管理研究，同时也要重视二倍体父本的选择，要选
择花粉数量多，可育性花粉数量多，生活力强、经济性状、农艺性状、生物学特性等各种性状优良
的二倍体作为杂交父本。

394 园 艺 学 报 39 卷

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