全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (8) : 1215 - 1220
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 02 - 24; 修回日期 : 2009 - 07 - 02
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30760146) ; 国家科技支撑计划项目 (2007BAD36B0123)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lijiangxj@1631com; Tel: 099128762363)
扁桃 AcSFB基因的克隆与原核表达分析
郭长奎 1 , 罗淑萍 1 , 李　疆 23 , 高启明 2
(1 新疆农业大学农学院 , 乌鲁木齐 830052; 2 新疆农业大学林学与园艺学院 , 乌鲁木齐 830052)
摘 　要 : 利用 RT2PCR和 RACE技术 , 从新疆栽培扁桃 ‘鹰嘴 ’花药中获得了一个全长的 SFB ( S2hap2
lotype2specific F2box gene) 基因 ( GenBank登录号为 FJ362525) , 命名为 A cSFB d。该基因全长 1 125 bp, 编
码 374个氨基酸 , 在 N末端含有一个大约 50个氨基酸组成的 F2box基序 , 含有两个高变区 (Hva和 Hvb)
和两个可变区 (V1和 V2)。生物信息学的方法成功预测了 AcSFBd蛋白分子质量为 43 kD, 为亲水性、非
分泌型蛋白 , 在基质内起连接酶 ( EC 61 - 1 - 1 - ) 的作用。成功构建了原核表达载体 , 并转化大肠杆菌
BL21 (DE3) , SDS2PAGE检测结果显示表达了一个约 60 kD的蛋白。
关键词 : 扁桃 ; 基因 ; 克隆 ; SFB 基因 ; 原核表达 ; 生物信息学
中图分类号 : S 66219; Q 78　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0821215206
Iden tif ica tion and Prokaryotic Expression of A lm ond A cSFB Gene
GUO Chang2kui1 , LUO Shu2p ing1 , L I J iang23 , and GAO Q i2m ing2
(1 College of A gronom y, X injiang A gricultural U niversity, U rum qi 830052, China; 2 College of Forestry and Horticulture, X in jiang
A gricultural U niversity, U rum qi 830052, Ch ina)
Abstract: Style S2determ inants have been determ ined to be S 2RN ase and the SFB ( S2hap lotype2specific
F2box gene) alleles are considered to be the first candidates of the pollen S2determ inants. A total length SFB
gene ( GenBank accession No1FJ362525) named A cSFB d was cloned with RT2PCR and RACE technolgy from
the anther of almond Yingzui p lanted in Xinjiang. A cSFB d was 1 125 bp in length encoding a p rotein of 374 a2
m ino acids. This gene encoded p roteins with the F2box motif in the N2am ino term inus, and with four ( hyper)
variable regions, i e. , V1, V2, Hva and Hvb which were sim ilar with S 2RN ase genes, considered to be rec2
ognition site between SFB and S2RNase. W ith the bioinformatics analysis, the AcSFBd p rotein was 43 kD ,
was instable, hydrophilicity and non2secretory p rotein and had ligase enzyme activity. After transformed to
Escherich ia coli BL21 and induced by isop ropyl2β2D2thiogalactopyranoside ( IPTG) , recombinant p rotein about
60 kD was exp ressed in pET2AcSFB system and separated by SDS2PAGE electrophoresis.
Key words: almond; gene; clone; SFB gene; p rokaryotic exp ression; bioinformatics
显花植物中 , 自交不亲和 ( Self2incompatibility, SI) 是阻止自花授粉的一种遗传机制 , 有利于提
高植物应对自然选择的能力和进化潜力。到目前为止 , 花粉 S -决定子认为是在花粉中特异表达的 F2
box基因 , 命名为 SFB ( S hap lotype2specific F2box p rotein, SFB ) 基因 , 并且从梅 ( Zhang et al. ,
2007) 和樱桃 (Vaughan et al. , 2008) 等蔷薇科植物中克隆到了大量的 SFB 基因。国外扁桃 SFB 基
因的研究已经开展 , 通过染色体步移法 (U shijima et al. , 2003) 及 RACE技术 (郭振宇 等 , 2006;
郭长奎 等 , 2009) , 获得了多个扁桃 SFB 基因 , 并证明 S FB 基因为花粉 S基因。但国内扁桃品种花
粉自交不亲和的相关研究仍很滞后 , 而且 SFB 基因的表达产物至今未能鉴定出来。本试验研究以新
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疆扁桃 (Am ygdalus comm unis L. ) 主栽品种 ‘鹰嘴 ’的花药为材料 , 利用 RT2PCR和 RACE技术克隆
AcS FB 基因 , 首次结合生物信息学和原核表达的方法对 A cSFB 基因的推导氨基酸序列进行分析 , 旨在
为分离 SFB蛋白和自交不亲和机制的研究提供理论依据。
1　材料与方法
111　材料
材料为扁桃 ‘鹰嘴 ’蕾期花药 , 2008年 3月采自喀什英吉沙县巴旦杏林场 , 液氮中保存备用。
引物合成和测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司 (以下简称上海生工 ) 完成。
112　方法
11211　花药总 RNA的提取及 cDNA的合成 　
花药总 RNA的提取方法参照 TianGen RNA p lant Reagent说明操作 , 用 DNaseⅠ ( TaKaRa) 去除
DNA的污染 , SMARTTM RACE cDNA Amp lification Kit (BD) 合成双链 cDNA。
11212　AcS FB 基因全长的克隆　
根据 GenBank登录的 21个李属 ( P runus) SFB 基因保守区设计简并引物 SFB2P1和 SFB 2P2 (表
1) , 以花药 cDNA为模板 , PCR扩增目标基因片段。115%琼脂糖凝胶电泳分离 PCR产物 , 离心柱型
琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒 ( TianGen) 回收 PCR产物 , 连接到 pMD192T ( TaKaRa) 载体上 , 转化
大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ( TianGen) , 挑取白斑 , 用通用引物菌液 PCR验证转化情况 , 把阳性克
隆子送上海生工测序。
根据测序结果设计两个扩增片段的 3′2RACE上游特异性引物 GSP1和 GSP2 (表 1) , SMARTTM
RACE cDNA Amp lification Kit (BD ) 配备的引物和酶扩增基因的 3′末端序列 , 按试剂盒说明具体操
作。测序后 , 把获得的 3′片段和简并引物 ( SFB2P1 /SFB 2P2) 扩增获得的 5′片段用 DNAMAN进行拼
接 , 并 BLAST比对分析。
表 1　引物列表
Table 1　L ist of pr im ers
引物名称
Primer name
引物序列 (5′- 3′)
Primer sequence
备注
Note
SFB2P1 CCTCAAAAGATGNCATTC 简并引物 Degenerate p rimer
SFB2P2 TYTGTTYTRAGACTATAAACCTC 简并引物 Degenerate p rimer
GSP1 TTAGGACCCCTCCAGTCACCA 3′2RACE
GSP2 GGTGCTTTGGCAGTTGAGGT 3′2RACE
myz2f CGCG GATC ATGGCATTCATACTACGTAAG 含 B am HⅠ酶切位点引物 Primer with cutting site of B am HⅠ
myz2r CCC AAGCTT TCAATTATTGAGTAAAACCAAAC 含 H ind酶切位点引物 Primer with cutting site of H ind
　　N =A /T/C /G; R =A /G; Y = C / T.
11213　 A cS FB 基因生物信息学分析 　
把获得的扁桃全长 AcS FB 基因在 NCB I网站上 BLAST比对 , 用 ORF Finder寻找开放阅读框 , 并
对 F2box区域进行分析。用 Protparam分析 AcSFB编码蛋白的氨基酸序列组成、相对分子质量、等电
点等理化性质 ; 利用 DNASTAR软件预测 AcSFB蛋白二级结构和亲水性情况 ; 利用 TMHMM Server
v1210软件进行蛋白质跨膜区段预测 ; 利用 Signal P程序分析 N -末端的信号肽序列 ; 用 ProtFun分析
预测 AcSFB蛋白的功能。
11214　AcS FB 基因重组表达载体构建 　
根据 A cSFB 基因全长序列设计引物 myz2f和 myz2r (表 1) , 将 PCR扩增产物双酶切后定向克隆到
原核表达载体 pET232a ( + ) 的 B am HⅠ、H indⅢ位点 , 构建重组表达载体 pET2AcSFB , 转化 DH5α
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　8期 郭长奎等 : 扁桃 A cSFB 基因的克隆与原核表达分析 　
感受态细胞 ( TianGen) , 提取重组质粒 , 转化至表达宿主菌 BL21 (DE3) , 挑取阳性菌落 , 碱法提取
质粒 , B am HⅠ和 H indⅢ双酶切验证转化情况并进行测序。
11215　AcSFB蛋白原核表达与 SDS2PAGE分析 　
pET2AcSFB重组菌株和 pET232a ( + ) 空载体 BL21菌株于 LB液体培养基中 (含 Amp ) 培养至
OD600值 016, 加 IPTG至终浓度为 1 mmol·L - 1 , 分别培养 0、2、4、6 h后各取出 115 mL菌液用于分
析总蛋白。离心上述菌液 , 弃上清液 , 1 ×SDS加样缓冲液重悬后煮沸 5 m in, 经 12 000 r·m in - 1离心
1 m in, 取 10μL上清液进行 SDS2PAGE电泳检测。凝胶用考马斯亮蓝 R2250染色并脱色至背景清晰。
2　结果与分析
211　扁桃 A cSFB 基因的克隆和序列分析
以简并引物 SFB 2P1和 SFB2P2, ‘鹰嘴 ’扁桃花药 cDNA为模板 , PCR扩增目标基因片段 , 获得
了 580 bp左右的片段 (图 1, A ) , 回收 , 测序。测序结果在 NCB I网站上 BLAST比对 , 结果显示为
S FB 基因的部分片段。根据扩增结果设计 3′RACE巢式扩增引物 , 扩增获得了 SFB 基因的 3′端 (图
1, B) , 用 DNAMAN软件把 3′端与简并引物 ( SFB 2P1 /SFB2P2) 扩增获得的 5′端连接获得了 1 200 bp
的片段。引物 myz2f /myz2r扩增 , 获得了大约 1 130 bp左右的片段 (图 1, C)。
用 ORF Finder寻找开放阅读框 , 结果 (图 2) 显示 , ‘鹰嘴 ’扁桃 A cSFB 基因 ( GenBank登录号
为 FJ362525) 全长 1 125 bp, 编码 374个氨基酸 , 3′非编码区长度为 75 bp, 命名为 A cSFB d。A cSFB d
与 GenBank公布的 SFB 基因核苷酸同源性在 86% ～89%之间 , 蛋白质序列的同源性在 78% ～84%之
间 , 显示了 SFB 基因的多态性。AcSFBd蛋白 N -末端有一个大约 50个氨基酸组成的 F2box区域 , 并
包含两个高变区 (Hva和 Hvb) 和两个可变区 (V1和 V2)。
图 1　A cSFB 基因 PCR扩增结果
A: 简并引物扩增 ; B: 3′RACE; C: 全长引物扩增。
A1: 简并引物扩增 ; B1: GSP1扩增 ; B2: GSP2扩增 ; C1: myz2f /myz2r扩增 ; M: DL2000 marker。
F ig. 1　PCR am plif ied results of A cSFB gene
A: Degenerate p rimer amp lification; B: 3′RACE; C: Full2length amp lification.
A1: Degenerate p rimer amp lification; B1: GSP1 amp lification;
B2: GSP2 amp lification; C1: myz2f /myz2r amp lification; M: DL2000 marker.
212　扁桃 AcSFBd蛋白生物信息学分析
生物信息学分析 , 推测 AcSFBd蛋白的分子式为 C1968 H3003 N495 O556 S20 , 分子质量为 43 13416 D , 等
电点为 5186, 二级结构以α螺旋为主 ; 理论推导半衰期大约为 30 h, 不稳定参数为 48182, 属于不稳
定蛋白 ; 并且推测此蛋白为亲水性、非分泌型蛋白 , 在基质内起连接酶 ( EC 61 - 1 - 1 - ) 的作用 ,
特异性的识别底物 , 正好吻合了 F2box蛋白的作用。
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图 2　A cSFB d基因 cD NA及推测的氨基酸序列
F ig. 2　Sequences of A cSFB d cD NA and its deduced am ino ac ids
213　A cSFB 基因原核表达载体 pET2AcSFB构建
将重组质粒 pET2AcSFB用 PCR及 B am HⅠ和
H indⅢ双酶切验证 (图 3) , 结果表明 , 1和 3号
泳道重组质粒双酶切获得了线性空质粒 (同 4号
泳道 ) 和目的 DNA条带 (同 5号泳道的 PCR扩
增结果 ) 两条带 , 结合测序结果证实 1和 3号泳
道重组质粒的外源基因插入正确。2号泳道重组
质粒双酶切也获得了两条谱带 , 但小片段明显小
于插入的目的片段 , 测序结果显示 , 基因 3′端发
生突变 , 在 1 042 ～1 046 bp 间由 AAGTT变为
AAGC3 TT (C3 表示插入的碱基 ) , 形成了一个
H indⅢ酶切位点。
图 3　重组质粒 pET2AcSFB PCR和酶切验证结果
1～3: pET2AcSFB双酶切结果 ; 4: pET232a ( + ) 双酶切结果 ;
5: PCR结果 ; M: Marker。
F ig. 3　PCR and restr iction enzym e d igestion
ana lysis of pET2AcSFB
1 - 3: pET2AcSFB restriction enzyme digestion; 4: pET232a ( + )
restriction enzyme digestion; 5: PCR analysis; M: Marker.
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214　A cSFB d基因的原核表达与 SD S2PAGE分析
重组质粒 pET2AcSFB转入大肠杆菌 BL21后 , 用 IPTG诱导其表达。结果发现 , 重组质粒能够表
达 1条约 60 kD的特异蛋白带 (图 4箭头所指 ) , 而 pET232a ( + ) 质粒表达的蛋白中没有这条带。
不用 IPTG诱导的重组质粒也有重组蛋白的表达 , 可能说明本底水平的表达也比较高。
图 4　pET2AcSFB原核表达 SD S2PAGE分析
1～4: IPTG诱导转 pET232a ( + ) 大肠杆菌 0、2、4、6 h蛋白结果 ;
5～8: IPTG诱导转 pET2AcSFB大肠杆菌 0、2、4、6 h蛋白结果 ; M: Protein marker。
F ig. 4　SD S2PAGE of expression of pET2AcSFB in BL21
1 - 4: IPTG induced 0, 2, 4, 6 h of pET232a ( + ) ; 5 - 8: IPTG induced
0, 2, 4, 6 h of pET2AcSFB; M: Protein marker.
3　讨论
SFB 基因是现在公认的花粉 S - 基因决定子的首选 , 已经在 P1persica ( Tao et al. , 2007) , P1
avium (Marchese et al. , 2007) 和 P1m um e (U shijima et al. , 2004) 等中通过转基因技术和花粉部分
突变的方法确认了 SFB 基因就是花粉 S -决定子。SFB 基因表达产物的分离及体外与 S2RNase相互作
用研究将有助于自交不亲和机理的确定。但其表达产物至今未分离出来 , 还不能从根本上去认识 SFB
基因在配子体自交不亲和中的具体作用。
本研究利用 RT2PCR和 RACE技术从 ‘鹰嘴 ’扁桃花药中获得了全长的 A cSFB d基因 , 并利用生
物信息学的方法对 AcSFBd蛋白进行了预测分析。在 AcSFBd蛋白的 N - 末端有一个保守性很高的
F2box区域 , 还含有两个高变区 ( Hva和 Hvb) 和两个可变区 (V1和 V2)。 SFB高变区的存在和 S2
RNase相似 , 被认为是自交不亲和的作用位点 (U shijima et al. , 1998) , 通过突变的方式改变此区域
的序列 , 降低 SFB与 S2RNase的识别能力 , 将可能是研究自交不亲和机制的突破口。生物信息学分
析 , AcSFBd蛋白分子质量为 43 kD, 为亲水性、非分泌型蛋白 , 在基质内起连接酶 ( EC 61 - 1 - 1
-
) 的作用 , 正好符合 F2box蛋白在泛素 /26S蛋白酶体中的作用过程 (吴静 等 , 2002)。同时本研究
成功的构建了重组质粒 pET2AcSFB, 并在大肠杆菌 BL21中获得了表达。但是在没有 IPTG诱导也同
样出现了目的蛋白 , 证明了 pET载体的强大表达效果。并且表达产物大约在 60 kD左右 , 与生物信息
学预测的结果 (43 kD ) 有一定的差距 , 可能原因是在载体构建过程中 , 基本上保留了 pET232a ( + )
载体上的所有序列 , 因而表达的蛋白是包括β - 半乳糖苷酶、硫氧还原蛋白 ( TrxA )、H is·Tag和 S
·Tag在内的融合蛋白 , 由此推断表达产物约为 60 kD与电泳结果基本吻合。外源基因原核表达分析
是离体分离纯化蛋白质的方法之一 , 表达时 , 在目的蛋白的基础上可以增加载体上本身所具有的表达
标签 , 为分离未知蛋白提供了重要的分离信号。本研究选用载体 pET232a ( + ) 和宿主菌 BL21
(DE3) 作为β -半乳糖苷酶的原核表达系统 , 可以把克隆与表达步骤分开 , 从而避免对宿主细胞有
毒的蛋白产物影响质粒的稳定性 (卞伟华 等 , 2006)。A cSFB d基因的原核表达分析并检测到有目的
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蛋白的产生 , 利用离体技术分离蛋白 , 结合生物信息学手段对其性质的推测将为 SFB蛋白质的分离
提供重要的参考。SFB 基因表达产物获得之后 , 通过体外与 S2RNase相互作用就能揭开自交不亲和的
机理。
SFB 基因的原核表达分析国内外还未见报道 , 本研究中成功的克隆到全长的 A cSFB d基因 , 构建
了 pET2AcSFB重组质粒 , 并进行了原核表达分析。A cSFB d基因的获得结合 GenBank公布的扁桃 SFB
基因 , 根据其基因型的不同 , 可以为田间授粉树的合理配置 (张树军 等 , 2008) 提供参考 , 合理化
种植扁桃 , 提高扁桃的产量 ; pET2AcSFB重组质粒的构建为 A cSFB d基因的体外表达成为可能。本研
究中虽然获得了 A cS FB d基因表达的目的条带 , 但依然没有分离到 SFB 基因的表达产物 , 进一步的研
究将是根据生物信息学预测的蛋白性质 , 结合离体分离蛋白技术分离纯化 SFB蛋白 , 以便从根本上
弄清楚扁桃配子体自交不亲和机制。
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