全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (3) : 437 - 440
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 09; 修回日期 : 2009 - 02 - 04
基金项目 : 云南省自然科学基金面上项目 ( 2005C0036M, 2007C0036M ) ; 云南省教育厅自然科学基金项目 ( 5Y0171B ) ; 国家
‘973’项目 (2006CB100204) )3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lizhengyue@ vip1km1691net; Tel: 087125227633)
致谢 : 感谢美国北卡罗来那州立大学植物病理系主任 JamesW. Moyer教授为本研究提供完善的试验条件。
云南省建水县番茄上 Tospovirus属病毒的初步鉴定
刘雅婷 1, 3 , 郑元仙 1 , 李永忠 2 , 李正跃 33
(1 云南农业大学农学与生物技术学院 , 昆明 650201; 2 云南农业大学烟草学院 ; 昆明 650201; 3 云南农业大学植保学
院 , 昆明 650201)
摘 　要 : 2005—2006年对云南省主要蔬菜种植区昆明、红河和楚雄等 3个地区进行调查 , 获得 9份疑
似番茄斑萎病毒属 ( Tospovirus) 病毒的样本。通过该属病毒引物 ( Tospovirus Group Primer) 进行 RT2PCR
扩增 , 其中 1份来自红河州建水县番茄上的样品获得约 500 bp核酸片段 , 通过 NCB IBLAST网络数据库比
对 , 确定为 Tospovirus属的病毒 ; 应用 DNAMAN软件与已经公布的 Tospovirus属病毒 L RNA序列比对分析 ,
从得到的相似性树状图可以看出 , 该样品与血清组 Ⅳ的 Tospovirus属病毒聚为一簇。
关键词 : 番茄 ; 番茄斑萎病毒属 ; 血清组
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0320437204
Prelim inary Iden tif ica tion of Tospovirus on Toma to in J ian shu i Coun ty of
Y unnan Prov ince
L IU Ya2ting1, 3 , ZHENG Yuan2xian1 , L I Yong2zhong2 , and L I Zheng2yue33
(1 College of A gricultural and B iotechnology, Yunnan A gricultural U niversity, Kunm ing 650201, Ch ina; 2 College of Tobacco
Science, Yunnan A gricu ltura l U niversity, Kunm ing 650201, China; 3 College of P lan t Protection, Yunnan A gricultural
U niversity, Kunm ing 650201, China)
Abstract: N ine samp les possibly from genus Tospovirus were collected from major vegetable2growing field
in Yunnan p rovince, including Honghe, Chuxiong and Kunm ing, during 2005—2006 period. A round 500 bp
fragments were obtained after RT2PCR were executed on 9 samp les using Tospovirus Group Primer. The
sequence results of around 500 bp fragments were compared in the NCB I BLAST website, one samp le from
tomato in Honghe County of Yuannan Province was identified as Tospovirus genus. A phylogenetic tree was
constructed using DNAMAN software according to the sequence of the samp le and their corresponding public
L RNA fragment sequences of Tospovirus. The results indicated that this samp le obtained in this study fell into
the Serogroup Ⅳ.
Key words: tomato; Tospovirus; serogroup
番茄斑萎病毒属 ( Tospovirus) 是布尼亚病毒科 (Bunyaviridae) 惟一的植物病毒属 , 能够侵染烟
草、番茄、辣椒和花生等多种重要作物 , 致使这些作物发生严重病害 , 导致世界范围内重大农业经济
损失 (W hitfield et al. , 2005)。该属病毒球状 , 具有包膜 , 由 S RNA、M RNA和 L RNA, 3个单链
RNA分子构成 ( German et al. , 1992 )。 Tospovirus属目前已经有 14 个确定种 (W hitfield et al. ,
2005)。在亚洲报道的种有 : 花生芽坏死病毒 ( Peanut bud necrosis virus, PBNV )、西瓜芽坏死病毒
(W aterm elon bud necrosis virus, WBNV )、鸢尾黄斑病毒 ( Iris yellow spot virus, IYSV )、花生黄斑病毒
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( Peanu t yellow spot virus, PYSV )、辣椒褪绿病毒 ( Capsicum ch lorosis virus, CaCV )、西瓜银斑病毒
(W aterm elon silverm ottle virus, W SMoV)、瓜类黄斑病毒 (M elon yellow spot virus, MYSV)、花生褪绿扇
斑病毒 ( Peanut ch lorotic fan virus, PCFV ) 和彩色马蹄莲褪绿斑病毒 ( Ca lla lily h lorotic spot virus,
CCSV )。张仲凯等 (1997) 报道了云南烤烟上发现 Tospovirus, 并在 2005年报道了云南省具有其广泛
的野生自然寄主 (张仲凯 等 , 2005)。
作者在云南省蔬菜种植基地调查了 Tospovirus属病毒侵染情况 , 并应用 RT2PCR 技术确定
Tospovirus属病毒在云南省番茄上的发生。
1　材料与方法
111　病毒样本收集
2005—2006年 , 在云南省昆明、楚雄和红河地区对主要蔬菜基地的番茄、辣椒、莴苣和花生等
蔬菜作物进行田间调查 , 获得 9份具有感染 Tospovirus属病毒较为典型症状的植株样品 (表 1)。按照
Ndunguru等 (2005) 的方法将具有疑似症状的叶片转移到 FTA 卡 (W hatman, Inc) 上备用。
表 1　本研究采集的病毒样本及其分离物
Table 1　V irus sam ples and isola tes collected in the study
样品编号
Samp le No.
自然寄主
Natural host
症状
Symp tom
采样地点
Location
采样时间 / ( Y - M - D)
Date
To22 番茄 Tomato 黄斑和同心环纹 Yellow spot, concentric ring 昆明呈贡 Chenggong, Kunm ing 2005 - 07 - 19
Pep23 辣椒 Pepper 同心环纹 Concentric ring 楚雄元谋 Yuanmou, Chuxiong 2006 - 02 - 14
Le21 莴苣 Lettuce 坏死斑 Necrotic spot 楚雄元谋 Yuanmou, Chuxiong 2006 - 02 - 14
Tomato 番茄 Tomato 黄斑和同心环纹 Yellow spot, concentric ring 红河建水 J ianshui, Honghe 2006 - 05 - 30
Pean21 花生 Peanut 坏死斑 Necrosis spot 楚雄元谋 Yuanmou, Chuxiong 2006 - 08 - 03
To23 番茄 Tomato 同心环纹和坏死斑 Concentric ring, necrosis spot 楚雄元谋 Yuanmou, Chuxiong 2006 - 08 - 03
Pep24 辣椒 Pepper 同心环纹和坏死斑 Concentric ring, necrosis spot 昆明呈贡 Chenggong, Kunm ing 2006 - 07 - 27
To24 番茄 Tomato 同心环纹和坏死斑 Concentric ring, necrosis spot 昆明呈贡 Chenggong, Kunm ing 2006 - 07 - 27
Onion21 洋葱 Onion 褪绿斑 Chlorotic lesion 红河蒙自 Mengzi, Honghe 2006 - 09 - 06
112　RNA的提取
应用 PureL ink Total RNA 纯化试剂盒 ( Invitrogen, Carlsbad, CA ) 从 FTA 卡上提取 RNA, 根据
Invitrogen公司使用说明书操作 , 并略有改动 , 在 RNA溶解溶液中加入了 2% PVP和 1% β - 巯基乙
醇 , 取 5 mm2 FTA卡溶解于 500μL RNA裂解溶液中。
113　L RNA片段的 RT2PCR
用随机引物 N6 ( Invitrogen, Carlsbad, CA) 逆转录合成 cDNA 。使用 AGD IA公司设计的 Tospovirus
通用引物 Tospovirus Group Primer和试剂盒 (AGD IA , Elkhart, IN ) 进行 L RNA 片段 PCR扩增 , PCR
反应在 MJ研究 (W atertown, MA ) 的 PTC2100热周期循环中完成 , 反应程序如下 : 预变性 94 ℃ 10
m in; 94 ℃ 1 m in, 45 ℃ 2 m in, 72 ℃ 3 m in, 5个循环 ; 然后 94 ℃ 1 m in, 52 ℃ 2 m in, 72 ℃ 3 m in,
30个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。然后在 1%琼脂糖凝胶电泳 , 紫外成像系统拍照。
114　基因克隆和测序
用 Q IAquick PCR纯化试剂盒 (Q iagen Inc. , Chatsworth, CA ) 纯化 PCR扩增产物 , 将扩增产物克
隆到 pGEM 2T载体 ( Promega, Madison, W I, USA) 上 , 并转化大肠杆菌菌株 JM 2109, 在美国北卡州
立大学基因组研究所完成重组体克隆的测序。
115　序列分析
用 Vector NTI Version 910 ( Invitrogen, Carlsbad, CA ) 创 建 序 列 数 据 库 ; B ioedit ( http: / /
834
　3期 刘雅婷等 : 云南省建水县番茄上 Tospovirus属病毒的初步鉴定 　
www1mbio1ncsu1edu /B ioEdit/bioedit1html) 用于序列整理 ; 通过 BLAST ( http: / /www1ncbi1nlm1nih1gov/
BLAST/ ) 进行比对分析 ; 使用 DNAMAN (version 215, Lynnon B iosoft, Quebec, Canada) 将获得的序列与已
知的 TSWV、 IYSV以及其他公布的 Tospovirus属病毒序列进行多序列比对产生相似性矩阵及系统进化树。
2　结果与分析
211　云南省 Tospovirus属病毒分布
通过引物 Tospovirus Group Primer进行 L RNA
序列 RT2PCR扩增 , 其中采自云南省红河州建水
县番茄的样本获得 4条 500 bp左右的序列 (图 1,
tomato25, tomato28, tomato29, tomato210 ) , 通过
BLAST比对发现该序列与 Tospovirus属其他已经
在 GenBank中公布的序列有较高的一致性 , 因此
确定该样本为 Tospovirus属病毒。
图 1　样品番茄应用引物 Tospovirus
Group Pr im er的 PCR扩增
F ig. 1　PCR am plif ica tion from toma to sam ples
by Tospovirus Group Pr im er
212　L RNA核酸序列片段比对和系统进化关系分析
通过引物 Tospovirus Group Primer进行 L RNA 序列 RT2PCR扩增 , 该样品均获得约 500 bp L RNA
片段。应用 DNAMAN软件将这些核酸序列和 GenBank公布的其他序列比对 , 从图 2可以看出 , 云南
的该样本与 Tospovirus属血清组 IV的病毒 PBNV和 W SMoV聚为一簇 , 相似性超过 79%。
图 2　应用 Tospovirus Group Pr im er获得 Tospovirus属 L RNA序列的系统进化树
F ig. 2　A phylogenetic tree ba sed on the L RNA fragm en t of Tospovirus
IYSV (Moyer et al. , unpublished data)
213　该病毒在自然寄主上的典型症状
该病毒在番茄果实上表现出黄斑和同心环纹的症状 (图 3)。
图 3　Tospovirus属病毒自然侵染番茄的症状表现
F ig. 3　The sym ptom of toma to infected by Tospovirus
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3　讨论
血清组是一种广泛用于 Tospovirus属病毒新种确定和分类的重要标准 , 血清学比较是检测和鉴定
Tospovirus属病毒最有效的方法 (Chu et al. , 2001)。目前 Tospovirus属病毒划分为 6个血清组 , 即 Ⅰ,
Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ和 Ⅵ ( de Haan et al. , 1990; Maiss et al. , 1991; de Avila et al. , 1993) , TSWV是血
清组 I的代表种。番茄褪绿斑病毒 ( Tom a to ch lorotic spot virus, TCSV ) 和花生环斑病毒属于血清组
Ⅱ. 凤仙花坏死病毒 ( Im patiens necrotic spot virus, INSV ) 和花生芽坏死病毒 ( Peanut bud necrosis vi2
rus, PBNV) 分别是血清组 Ⅲ和 Ⅳ的代表种。两种新的 Tospovirus即花生黄斑病毒 ( Peanut yellow spot
virus, PYSV ) 和鸢尾黄斑病毒 ( Iris yellow spot virus, IYSV ) 分别是血清组 Ⅴ ( Satyanarayana et al. ,
1998) 和 Ⅵ (Cortez et al. , 1998) 的代表种。本研究中的云南样品与 Ⅳ聚为一群 , 因此可能属于血清
组 Ⅳ。
自 1947年以来 , 陆续有关于 Tospovirus的发现 , 但是中国对于 Tospovirus很少有系统的调查和研
究 , 关于种的鉴定鲜见报道。
作者在过去的几年中对云南省蔬菜进行调查 , 确定采自云南红河建水县番茄上的病毒样本为
Tospovirus属病毒 , 但是属于 Tospovirus属的哪一个种 , 还有待进一步的研究确定。
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