全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (4) : 521 - 526
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 01 - 19; 修回日期 : 2009 - 03 - 31
基金项目 : 河南省科技攻关项目 (30200302)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xmzxyj@1261com)
马铃薯 C28 , 7甾醇异构酶基因 ( S tS I1) cDNA克隆
及表达
牛洪斌 1 , 白润娥 2 , 邓德芝 1 , 尹　钧 13
(1 河南农业大学国家小麦工程技术研究中心 , 郑州 450002; 2 河南农业大学植物保护学院 , 郑州 450002)
摘 　要 : 以拟南芥 C28, 7甾醇异构酶的氨基酸序列为信息探针搜索 GenBank数据库 , 对高度同源的马
铃薯 EST序列进行拼接、引物设计和 RT2PCR扩增 , 扩增产物测序结果证实获得一个马铃薯 C28, 7甾醇异
构酶基因 (S tS I1) 的全长 cDNA序列。序列分析结果显示 , S tS I1全长 886 bp, 包含 59 bp的 5′非编码序列、
161 bp的 3′非编码序列和一个长度为 666 bp编码 221个氨基酸的开放阅读框 , 分子量约为 25 kD。氨基酸
结构分析显示该蛋白的 N端含有一个长度由 35个氨基酸残基组成的信号肽 , C端成熟肽区域含有典型的类
EBP结合域。氨基酸比对分析表明 , StSI1与已知 C28, 7甾醇异构酶同源性介于 3219% ～6113%之间 , 与
拟南芥 A tSI1相似性最高 (6113% )。RT2PCR表达谱分析显示 , S tS I1在马铃薯的块茎芽眼和表皮组织中均
能表达 , 并且该基因的表达水平受贮藏温度升高和光照增强的正向调节。
关键词 : 马铃薯 ; 基因克隆 ; 表达分析
中图分类号 : S 532　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0420521206
C lon ing and Expression of C28 , 7 Sterol Isom era se Gene ( S tS I1) cD NA from
Pota to
N IU Hong2bin1 , BA I Run2e2 , DENG De2zhi1 , and YIN Jun13
(1N ationa l Eng ineering Research Center forW heat, Henan A gricu ltura l U niversity, Zhengzhou 450002, China; 2 College of P lant
Protection, Henan A gricultural U niversity, Zhengzhou 450002, China)
Abstract: C28, 7 sterol isomerase p lays a vital role in the sterol biosynthesis pathway. U sing A rabidopsis
C28, 7 sterol isomerase ( GenBank accession No. AAD03489) am ino acid sequence as a querying p robe,
many highly homologous EST sequences were obtained from GenBank and a putative cDNA sequence of potato
C28, 7 sterol isomerase was assembled. Futhermore, a putative C28, 7 sterol isomerase gene cDNA, named
S tS I1 ( GenBank accession No. EU103613 ) was cloned from potato (Solanum tuberosum L. ). S tS I1 was 886
bp in full length, including a 5′untranslated region of 59 bp, 3′untranslated region of 161 bp with poly A ,
and a 666 bp length open reading frame (ORF) encoding 221 am ino acids with the molecular weight of 25
kD. Software p rediction results showed that StSI1 contained a 35 am ino acid lenghth signal pep tide at the N
term inal. Homology analysis showed that the deduced am ino acid sequence of StSI1 shared 3219% - 6113%
identity with sterol isomerase from other organism s. RT2PCR analysis showed that the S tS I1 was highly ex2
p ressed in skin and eyes of potato stem tuber. The exp ression p rofiling also showed that S tS I1 mRNA was up2
regulated intensively both by temperature and light.
Key words: potato; gene cloning; exp ressing analysis
植物甾醇类化合物属于类异戊二烯化合物家族的次生代谢产物 , 广泛参与植物体内多种代谢过
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程 , 例如作为生物膜结构因子 , 甾醇类化合物可以有效地调节细胞膜的流动性和渗透性 (Hartmann,
1998) , 并且作为油菜素内脂合成的前体物质广泛参与植物体内的多种代谢过程 (B ishop & Koncz,
2002)。研究结果表明 , 谷物类种子中甾醇化合物多达 250种以上 , 其中含量最高的为谷固醇、豆甾
醇和油菜甾醇 , 三者占植物甾醇总量的 60%以上 (Noguchi et al. , 2000)。相比之下 , 马铃薯块茎中
植物甾醇主要以龙葵素形式存在 , 主要包括α - 查茄碱 (α2chaconine) 和α - 龙葵碱 (α2solanine)
(Bushway & Ponnampalam, 1981)。现有马铃薯品种的块茎都不同程度地含有龙葵素 , 尤其是在贮藏
期间光、温条件不当的情况下 , 块茎中将会大量合成该类有毒物质 , 降低马铃薯品质 , 危害人体健
康 , 甚至死亡 ( FAO /WHO , 1999; Korpan et al. , 2004; Sengül et al. , 2004; R ita et al. , 2007)。植物
体内甾醇类物质的合成涉及到 60多种酶类参与 , 其中 C28, 7甾醇异构酶是存在于内质网上催化三烯
类化合物向 2, 4 -次甲基甾醇类化合物转变的关键酶类。酵母突变体遗传分析显示 , C28, 7甾醇异
构酶在麦角甾醇生物合成和细胞增殖过程中发挥关键作用 (Moebius et al. , 1996) , 拟南芥 C28, 7甾
醇异构酶基因缺失突变体 hyd1表现为甾醇合成受阻、胚胎细胞发育异常等突变表型 ( Souter et al. ,
2002) , 表明 C28, 7甾醇异构酶在植物体内发挥重要作用。C28, 7甾醇异构酶基因已从啤酒酵母
(A rthington et al. , 1991; Silve et al. , 1996)、稻瘟病 ( Keon et al. , 1994) 和玉米黑穗病病原菌 (An2
drew et al. , 1994 ) 等低等生物 , 仓鼠和人类等高等动物 (Markus et al. , 1995 ) , 以及拟南芥
( Grebenok et al. , 1998) 和水稻 (Ohyanagi et al. , 2006) 等高等植物克隆获得。本研究中根据已知 C2
8, 7甾醇异构酶氨基酸序列 , 采用序列拼接和 RT2PCR扩增克隆获得源自马铃薯的 C28, 7甾醇异构
酶基因 cDNA片段 , 并对该基因的表达特性和结构特点进行了分析 , 为深入研究 C28, 7甾醇异构酶
基因功能及其与植物探索甾醇生物合成的关系奠定基础。
1　材料与方法
111　材料处理
供试马铃薯 (S olanum tuberosum L. ) 主栽品种 ‘东农 303’块茎于 2006年秋季采自河南农业大
学实验农场。选取健康、无虫口的马铃薯块茎置于 4 ℃和 20 ℃条件下进行贮藏试验 , 同时设置光照
和黑暗处理 , 并于贮藏的第 15天时切取块茎表皮 (厚度 )、芽眼部位和内部组织 (块茎表皮 110 mm
以下内部组织 ) , - 80 ℃冰箱保存、备用。另取部分健康、无虫口的马铃薯块茎种植于含有蛭石 /草
炭土 (3 ∶1) 基质的营养钵中 , 置于光照培养箱中培养 , 温度设置为 22 ℃ (昼 ) /20 ℃ (夜 ) , 光
照强度为 6114 ×104 lx, 光照时数为 8 h·d - 1 , 并于第 45天收取马铃薯幼苗的叶片和茎 , - 80 ℃冰
箱保存备用。
112　 RNA的提取和 cD NA第一链的合成
以 20 ℃光照条件下贮藏 15 d马铃薯块茎的芽眼部位组织为材料 , 采用上海宝生生物公司的 Trizol
试剂提取该组织总 RNA, 在进行 RNA质量和浓度检测后取 2μg的总 RNA用于 cDNA第一链的合成 ,
并用 RNase H消化 cDNA产物。
113　S tS I1的 cD NA克隆与序列测定
以拟南芥 C28, 7甾醇异构酶基因 ( GenBank accession No. AAD03489) 的氨基酸序列为信息探
针 , 运行 tblastn程序搜索 GenBank ( http: ∥www1ncbi1nlm1nih1gov) 的 EST数据库 , 获得许多与之高
度同源的马铃薯 EST序列 , 利用软件 DNAMAN对上述 EST序列进行模拟拼接了马铃薯 C28, 7甾醇
异构酶基因的完整 cDNA序列 , 根据拼接序列设计 PCR引物 StSI1f1: 5′2CCCTTTTCTTCTTCATCGCCG2
3′, StSI1 r1: 5′2GACATATTTCAGCAGGAATGAGC23′, PCR 扩增条件为 : 94 ℃ 3 m in 预变性 , 94 ℃
30 s, 59 ℃ 30 s, 72 ℃ 115 m in, 35个循环 , 最后 72 ℃延伸 10 m in。PCR扩增产物经 1%琼脂糖凝
胶检测、回收目的条带 , 与 pBS2T载体 ( TIANGENE) 连接 , 16 ℃过夜。连接产物转化到大肠杆菌
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　4期 牛洪斌等 : 马铃薯 C28, 7甾醇异构酶基因 (S tS I1) cDNA克隆及表达 　
JM109, 在 Xgal/ IPTG琼脂糖平板上挑选白色克隆 , 由宝生物 (大连 ) 有限公司完成序列测定 , 以
Megalign和 Clustalx1183软件包对包括 S tS I1在内的已报道 C28, 7甾醇异构酶基因进行氨基酸序列联
配和聚类分析 , 信号肽预测采用软件 Signal P 310 (Bendtsen et al. , 2004) 进行。
114　马铃薯 S tS I1的 m RNA表达谱分析
采用半定量 RT2PCR法对 StSI1的转录表达水平进行检测 , 所用引物和 PCR反应条件同上述基因
克隆 , 循环次数降为 28个。以 actin 作为内部参照 , actin PCR 引物为 : A1: 5′2GGAACTGGTATGGT2
CAAGGC23′, A2: 5′2AGTCTCATGGATAACCGCAG23′, PCR 扩增程序如下 : 94 ℃ 5 m in 预变性后 ,
94 ℃ 30 s, 56 ℃ 40 s, 72 ℃ 50 s共 28个循环 , 最后 72 ℃延伸 10 m in。扩增产物经 115% 琼脂糖凝
胶电泳、EB染色后 , 凝胶成像仪成像 , 并采用软件对该基因的表达丰度进行分析 , 同时以组成性表
达基因 actin为内参。以 S tS I1和 actin的积分光密度值 ( IOD ) 比值作为表达水平的直观指标。试验
所得数据用 SPSS 1310统计软件进行方差分析和平均数差异显著性分析。
2　结果与分析
211　马铃薯 S tS I1基因的 cD NA克隆及序列分析
以拟南芥 C28, 7甾醇异构酶的氨基酸序列为信息探针搜索 GenBank数据库 , 获得许多与之相匹
配的马铃薯 EST。利用软件对上述序列人工拼接获得了马铃薯 C28, 7甾醇异构酶基因的完整 cDNA
序列 , 并根据拼接序列设计引物 , 其中正向引物产生于序列 CV498333, 反向引物产生于序列
CV472667, PCR产物测序结果证实扩增所得序列为目的片段。序列分析显示该目的片段全长为 886
bp, 包含 59 bp的 5′非编码序列、161 bp的 3′非编码序列和一个长度为 666 bp编码 221个氨基酸残基
的开放阅读框 , 分子量约为 25 kD。在推导氨基酸序列同一读码框的上游存在一个终止密码子 , 表明
S tS I1 5′端的第一个 ATG为该基因的起始密码子 , 同时 3′UTR中 764～768位有一个典型的加尾信号
AATAA, 表明 S tS I1是一个完整的 cDNA序列。该序列已提交到 GenBank, 登录号为 EU103613。
图 1　马铃薯 C28, 7甾醇异构酶 S tS I1 cD NA核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
信号肽序列以方框标识 , 信号肽酶识别位点以箭头标识 ; 加黑部分为加尾信号 ; S tS I1基因登录号为 EU103613。
F ig. 1　 cD NA and deduced proe in sequence of S tS I1 from pota to
The putative signal pep tide are highlighted in box, while the cleavage sites is marked by the wedge.
A putative poly (A + ) signal is highlighted in black. The accession No. for S tS I1 is EU103613.
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采用软件分析 S tS I1编码氨基酸序列 , 结果 (图 1) 显示 , StSI1的 N端含有一个由 35个氨基酸
残基组成的信号肽 , 信号肽酶剪切位点介于 G35 ～ I36之间。推导的蛋白质功能域分析显示 StSI1含有 5
个跨膜结构域 (30～52, 61～83, 116～138, 147～169, 179～201) , 表明该蛋白属于膜结合蛋白。此
外 , 该蛋白还存在 4个酪蛋白激酶 Ⅱ磷酸化位点 (3～6, 26～29, 56～59和 103～106) , 两个蛋白激
酶 C I磷酸化位点 (58～60, 140～142) , 以及一个 N -糖基化位点 (173～175) 和一个 N -豆蔻酰化
位点 (155～160) , 表明在 StSI1的生物合成过程中需要多种翻译后加工修饰才能成为具有特定功能
的成熟多肽。
氨基酸序列比较结果 (图 2) 显示 , StSI1与其他已知 C28, 7甾醇异构酶基因的氨基酸序列同源
性介于 3219% ～6113%之间 , 与拟南芥 A tSI1 同源性最高 ( 6113% ) , 与人类 H sSI同源性最低
(3219% ) , 显示出该基因在物种间的分化处于早期阶段。
图 2　马铃薯 StS I与其他已知 C28, 7甾醇异构酶基因氨基酸序列相似性比较
采用 Clustalx软件进行相似性分析 , 并使用 BOXSHADE软件进行处理 ; 上述序列分别来自人类 H sSI (CAA86068) ,
拟南芥 A tSI (AAD03489) , 小鼠 MmSI (CAA66350) , 水稻 O sSI (NP 001041757) ,
酵母 ScSI (AAA34593) , 马铃薯 StSI ( EU103613)。
F ig. 2　A lignm en t of full am ino ac id sequences from StS I and others C28, 7 sterol isom era se
The alignment was made by Clustalx p rogram and viewed with BOXSHADE software. The references for the am ino acid sequences are:
Human, H sSI (CAA86068) ; A rabidopsis, A tSI (AAD03489) ; M us m usculus, MmSI (CAA66350) ;
R ice, O sSI (NP 001041757) ; Yeast, ScSI (AAA34593) ; Potato, StSI ( EU103613) .
212　S tS I1基因组织特异性表达
提取马铃薯不同组织来源的总 RNA, 以马铃
薯的 actin基因作为内参照 , 进行 RT2PCR分析。
结果 (图 3) 显示 , 在苗龄为 45 d的马铃薯的叶
片和茎 , 以及 20 ℃光照条件下贮藏 15 d的马铃
薯块茎的芽眼和表皮组织中均能检测到 S tS I1的
转录本 , 而在块茎内部组织中未见特异条带 , 表
明 S tS I1的表达具有较强的组织特异性。
进一步对不同贮藏条件下块茎的芽眼和表皮
图 3　马铃薯 S tS I1转录表达半定量 RT2PCR分析
ITT、Sk、St、E和 L分别代表块茎内部组织、表皮、茎、芽眼和叶。
F ig. 3　Expression of S tS I1 gene in var ious
pota to tissues by RT2PCR a ssay
ITT: Internal tissue of tuber; Sk: Skin; St: Stem; E: Eye; L: Leaf.
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　4期 牛洪斌等 : 马铃薯 C28, 7甾醇异构酶基因 (S tS I1) cDNA克隆及表达 　
组织中 S tS I1的转录表达水平检测结果 (图 4, 图 5) 显示 , 贮藏温度可以显著影响 S tS I1的转录表
达 , 在 20 ℃黑暗贮藏条件下马铃薯块茎的芽眼和表皮组织中 S tS I1的表达水平显著高于 4 ℃贮藏样品
( P < 0105) ; 光照条件可以显著促进 S tS I1的表达 , 芽眼和表皮组织中的表达量均显著高于黑暗贮藏
条件下的同类组织 ( P < 0105) ; 芽眼组织的表达量普遍高于块茎的表皮 , 并且在光照条件下表达差
异达显著水平 ( P < 0105)。
3　讨论
甾醇类生物碱 ( SGA s) 是马铃薯、西红柿和茄子等茄科类植物特有的次生代谢产物 , 该类化合
物的存在有助于提高茄科植物抗病、抗虫能力 ( Tingey, 1984; Keskitalo et al. , 1996)。然而 , SGA s
具有毒性 , 其含量过高时会对人体健康造成严重伤害 , 为此各国都先后对推广种植的马铃薯品种的
SGA s设定了一个指导性的含量标准 ( Keskitalo et al. , 1996)。马铃薯块茎中主要含有α -查茄碱 (α2
chaconine) 和α -龙葵碱 (α2solanine) , 其原始上游底物均来自异戊二烯化合物代谢途径产生的甾醇
类化合物 , 如豆甾醇等 , 体外饲喂豆甾醇可以有效地提高组织培养马铃薯叶片中的龙葵素含量 (Lee
et al. , 2007)。C28, 7甾醇异构酶是催化豆甾醇类生物碱合成所需前体物质的关键酶类 , 通过基因工
程手段阻断或降低该类前体物质的合成有望降低马铃薯块茎中龙葵素的含量。
本试验中根据已知 C28, 7甾醇异构酶同源序列采用生物信息学结合 RT2PCR法首次从马铃薯茎
芽部位克隆获得了 S tS I1基因的 cDNA序列 , 表达谱分析显示该基因转录水平表达受光、温和贮藏时
间的正向调节 , 并且在块茎芽眼部位表达水平最高。前人研究表明 , 马铃薯芽眼部位龙葵素含量最
高 , 并且随着贮藏时间的延长及茎芽的生长而迅速升高 , 这与 S tS I1转录表达趋势相吻合 , 进一步表
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明 S tS I1与马铃薯块茎中 SGA s形成密切相关。目前本实验室已构建好过量表达、RNA i干扰等形式的
植物转化载体 , 对 S tS I1进行正反转基因功能验证 , 以深入探索马铃薯甾醇类生物碱合成机制 , 为培
育低含量甾醇类生物碱马铃薯新品种提供理论指导。
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