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Studies on the Development of Microspores in Carrot Isolated Microspore Culture

胡萝卜游离小孢子培养及其发育过程研究



全 文 :园 艺 学 报 , ( ): – 2011 38 8 1539 1546 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期:2011–04–11;修回日期:2011–07–29
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2060302-2-09);公益性行业科研(农业)专项(200903016);北京市重点学
科建设项目;农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目
胡萝卜游离小孢子培养及其发育过程研究
李金荣,欧承刚,庄飞云*,赵志伟,胡 鸿,毛笈华
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京 100081)
摘 要:以 11 份不同基因型胡萝卜为试材进行游离小孢子培养研究,并对胚状体及愈伤组织形成过
程进行细胞学观察。诱导培养 92 d 后,有 5 份材料形成肉眼可见的胚状体或愈伤组织。其中 70198 和 80Q54
均诱导出胚状体和愈伤组织,胚状体产率分别为每皿 10.56 和 7.00 个,愈伤组织产率分别为每皿 3.56 和
8.38 个;90234 仅形成胚状体,产率为每皿 6.75 个;70Q78 和 80Q52 仅产生愈伤组织,产率分别为每皿
3.00 和 1.00 个。细胞学观察表明胚状体和愈伤组织形成过程具有完全不同的结构特征。发育成胚状体的
小孢子细胞壁变薄,膨大伸长,长度可至原来的 1.5 ~ 4.0 倍,有明显大液泡,初期细胞纵向分裂,成串
排列,细胞之间紧密连接,而发育成愈伤组织的小孢子膨大成球状,多次分裂后松散地连接在一起。通
过流式细胞仪鉴定 70198、70Q78 和 80Q54 获得的 137 株再生植株倍性,单倍体、二倍体及三倍体所占比
例分别为 68.6%、29.9%和 1.5%。
关键词:胡萝卜;游离小孢子;胚状体;愈伤组织;倍性
中图分类号:S 631.2 文献标识码:A 文章编号:0513-353X(2011)08-1539-08

Studies on the Development of Microspores in Carrot Isolated Microspore
Culture
LI Jin-rong,OU Cheng-gang,ZHUANG Fei-yun*,ZHAO Zhi-wei,HU Hong,and MAO Ji-hua
(Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)
Abstract:The differences about the development of embryoids and calli arising from microspores
were investigated in isolated microspore culture with eleven carrot accessions. After cultured about 92
days,five accessions began to form embryoids or calli. 70198 and 80Q54 produced both,the productions
of embryoids were 10.56 and 7.00 per dish,and the productions of calli were 3.56 and 8.38 per dish,
respectively. 90234 only produced embryoids,and the production was 6.75 per dish. 70Q78 and 80Q52
only formed calli,and the productions were 3.00 and 1.00 per dish,respectively. Microspores with thin
wall,size elongating 1.5–4.0 folds,and large vacuole would develop into embryoids. Firstly they latitude
split,arranged in series and connected tightly each other. While the microspores expanding like globe
shape,splitting and connecting loosely would grow up to calli. The ploidy level of 137 regenerated plants
from 70198,70Q78 and 80Q54 were detected using flow cytometry,and 68.6% were haploid,29.9%
double haploid,and 1.5% triploid.

* 通信作者 Author for correspondence(E-mail:fy_zhuang@caas.net.cn)
1540 园 艺 学 报 38 卷
Key words:carrot;isolated microspore;embryoid;calli;ploidy

游离小孢子培养是一种从单细胞水平上快速创制单倍体和纯合二倍体(DH)的现代生物技术手
段。Maluszynski 等(2003)在纯合二倍体生产手册中列出了 33 种重要作物以及 226 种其他植物的
文献报道,其中育种中取得较好进展的有芸薹属作物(大白菜、甘蓝、油菜等)、禾本科作物(小麦
和大麦)、亚麻等,而番茄、茄子、辣椒、黄瓜、萝卜、苹果等虽然只取得一些关键性技术的突破,
没有广泛应用于育种,但一直受到众多遗传学家和育种家的关注(连勇 等,2004;刘凡 等,2007;
Dunwell,2010;Ferrie & Caswell,2010)。
目前胡萝卜单倍体培养技术主要在花药培养方面取得一定进展(Tyukavin et al.,1999;Adamus
& Michalik,2003;Górecka et al.,2005,2009;Kowalska et al.,2008;庄飞云 等,2010),而有关
胡萝卜游离小孢子培养研究进展较为缓慢。Matsubara等(1995)首次在胡萝卜游离小孢子培养中诱
导出小愈伤组织,没有形成再生植株。Górecka等(2010)从胡萝卜品种‘Feria F1’的 5 株不同供
体植株中诱导出胚状体,获得 42 株再生植株,倍性鉴定全为二倍体。Ferrie等(2010)对胡萝卜、
茴香、芹菜、莳萝、防风等 20 种伞形花科作物进行游离小孢子培养,获得了 17 株胡萝卜再生植株。
作者基于前人工作基础,通过优化胡萝卜小孢子提取方法,以不同基因型胡萝卜材料开展相关研究,
并对小孢子形成胚状体和愈伤组织过程进行细胞学观察,为进一步完善胡萝卜小孢子培养技术提供
理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以 11 份不同基因型胡萝卜为试材,除 70198 和 90234 为自交系外,其它为采用人工去雄的方法
杂交获得的F1代(表 1)。HCM A.C.、Beta Ⅲ、2327 由美国威斯康星大学提供。时田 5 寸、黑田 5
寸、改良黑田 5 寸、早春红冠是从国内市场上购买的栽培品种。山西绛紫、两头齐、阿姆斯特丹、
丹佛斯和南特斯由中国农业科学院蔬菜花卉研究所国家种质资源中期库提供。各试材于 2008 年 7
月下旬播于中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验田,11 月初收获种根并贮藏于地窖中进行春化处
理,在翌年 3 月初将经过春化处理的种根种植于塑料大棚,每份材料 10 ~ 15 株,4 月底植株开始抽
薹开花。
表 1 用于游离小孢子培养的不同基因型胡萝卜材料
Table 1 Different carrot genotypes selected for isolated microspore culture
材料编号
Code
基因型
Genotype
类型
Type
70198 HCM A.C. 自交系 Inbred line
70Q78 山西绛紫 × 丹佛斯 Shanxi Jiangzi × Danvers F1
80Q48 HCM A.C. × 丹佛斯 HCM A.C. × Danvers F1
80Q49 HCM A.C. × 时田 5 寸 HCM A.C. × Shitian 5 Cun F1
80Q50 HCM A.C. × 改良黑田 5 寸 HCM A.C. × Gailiang Heitian 5 Cun F1
80Q51 HCM A.C. × 阿姆斯特丹 HCM A.C. × Amsterdam F1
80Q52 HCM A.C. × 2327 HCM A.C. × 2327 F1
80Q53 HCM A.C. × 南特斯 HCM A.C. × Nantes F1
80Q54 HCM A.C. × Beta Ⅲ HCM A.C. × Beta Ⅲ F1
80Q68 早春红冠 × 两头齐 Zaochunhongguan × Liangtouqi F1
90234 黑田 5 寸 Heitian 5 Cun 自交系 Inbred line
8 期 李金荣等:胡萝卜游离小孢子培养及其发育过程研究 1541
1.2 游离小孢子培养方法
胡萝卜游离小孢子培养程序参照Ferrie(2003)的方法进行改进。选取健康植株上小孢子处于单
核靠边期花序,清洗,在超净工作台上用 75%乙醇消毒 30 s,10%次氯酸钠消毒 15 min,无菌水冲
洗 3 次,每次 1 min。将无菌花序放入研钵,加入少量B5 提取液,用研棒轻轻挤压,使小孢子游离
到提取液中,经 300 目尼龙网过滤至 10 mL离心管,1 000 r · min-1,离心 4 min,弃上清液,加入B5
提取液悬浮小孢子。上述提取洗涤过程重复 2 次后,加入NLN液体培养基(含 0.1 mg · L-1 2,4-D
和 0.1 mg · L-1 NAA,13%蔗糖,pH 5.8)悬浮小孢子。调整小孢子密度为 1.5 × 105 ~ 2.5 × 105个 · mL-1,
每培养皿(60 mm × 15 mm)加 3 mL悬浮液,100 μL 1%活性炭。33 ℃热激处理 2 d,25 ℃暗培养。
培养后每隔 10 d观察统计各试材产生胚状体或愈伤组织皿数、胚状体数以及愈伤组织数,以培养 200
d后的累计总数分别计算胚状体和愈伤组织产率。因胡萝卜花蕾较小,培养时花蕾数量较多,故以平
均每皿产生胚状体数或愈伤组织数计算其产率。
1.3 小孢子发育过程观察及再生植株倍性鉴定
在小孢子培养期间,每隔 7 d 在显微镜下进行观察、照相,记录小孢子在培养皿中的状态及发
育过程。当观察到小孢子开始分裂时,吸取少量小孢子培养液置于玻片上,采用 DAPI 染色,在 ZEISS
Axio 40 荧光显微镜下观察、照相。
再生植株倍性的鉴定在北京市农林科学院蔬菜研究中心进行。参照刘凡等(2007)的方法,选
取再生植株嫩叶 2 cm2左右,以正常栽培胡萝卜二倍体为对照,通过流式细胞仪测定和倍性分析软
件(ModFit)确定样品DNA含量,从而确定再生植株的倍性。
2 结果与分析
2.1 基因型对胚状体和愈伤组织形成的影响
在参试的 11 份材料中,有 5 份材料形成胚状体或愈伤组织(表 2)。70198 和 80Q54 同时诱导
出胚状体和愈伤组织,90234 仅产生胚状体,70Q78 和 80Q52 仅产生愈伤组织。70198、80Q54 和
90234 诱导胚状体数分别为 95、56 和 27 个,胚状体产率分别为每皿 10.56、7.00 和 6.75 个。70198、

表 2 不同基因型胡萝卜产生胚状体和愈伤组织诱导率及培养时间
Table 2 The frequency and days of embryoids and calli inducing from different carrot genotypes
材料
编号
Code
培养皿数
Number of petri
dish cultured
形成胚状体或
愈伤组织皿数
Number of petri dish with
embryoids or calli
胚状体数
Number of
embryoids
胚状体产率
Production of
embryoids
胚状体诱
导天数/d
Days of forming
embryoids
愈伤组织数
Number of
calli
愈伤组织产率
Production
of calli
愈伤组织
诱导天数/d
Days of
forming calli
70198 70 9 95 10.56 109 32 3.56 109
70Q78 46 1 0 0 0 3 3.00 177
80Q48 9 0 0 0 0 0 0 0
80Q49 31 0 0 0 0 0 0 0
80Q50 35 0 0 0 0 0 0 0
80Q51 15 0 0 0 0 0 0 0
80Q52 35 1 0 0 0 1 1.00 182
80Q53 31 0 0 0 0 0 0 0
92 80Q54 41 8 56 7.00 92 67 8.38
80Q68 4 0 0 0 0
95 
0 0 0
90234 24 4 27 6.75 0 0 0


1542 园 艺 学 报 38 卷
70Q78、80Q52 和 80Q54 诱导愈伤组织数分别为 32、3、1 和 67 个,愈伤组织产率分别为每皿 3.56、
3.00、1.00 和 8.38 个。胚状体和愈伤组织诱导所需时间较长,不同基因型形成肉眼可见胚状体或愈
伤组织均在 92 d 以上,其中 80Q52 在培养 182 d 后才有愈伤组织形成。
2.2 胚状体形成过程观察
胡萝卜游离小孢子发育过程存在两种不同途径,分别是胚状体途径和愈伤组织途径。胡萝卜小
孢子初期为肾形,细胞壁较厚,大小 15 ~ 25 μm(图 1,A),培养过程中小孢子膨大延长,细胞壁
变薄,长度可达原来的 1.5 ~ 4 倍,几乎找不到萌发孔的痕迹,有明显大液泡(图 1,A)。细胞核

图 1 胚状体形成过程
A 和 A1. 小孢子膨大(1:未萌动小孢子;2:单核处于一端的膨大小孢子;3:核开始向小孢子中央移动;4:核位于小孢子中央;v:液
泡);B. 第 1 次细胞纵向分裂;C. 细胞多次分裂后成串排列;D. 细胞极性分化;E. 多细胞团;F、G. 球形胚;H. 心形胚;I. 鱼雷形胚;
J. 子叶胚;K. 连体胚;L. 各种形状胚状体;M. 培养皿中形成大量胚状体。
Fig. 1 The development of embryoids in carrot microspore culture
A,A1. Initiation of microspores expanding(1:Normal microspore;2:Nuclear lying on the side of swelled microspore;3:Nuclear moving to the
center of microspore;4:Nuclear locating at the center of microspore;v:Vacuole);B. The first division of microspore;C. Cells arranging in series;
D. Differentiation of cell;E. Multicellular mass;F,G. Globular embryo;H. Heart shape embryo;I. Torpedo shape embryo;
J. Embryo at cotyledonary stage;K. Polyembryo;L. Embryos with various shapes;M. Lots of embryos in petri dish.
8 期 李金荣等:胡萝卜游离小孢子培养及其发育过程研究 1543
先位于小孢子一端,然后逐渐向中央移动,并开始进行细胞分裂(图 1,A1),首先纵向分裂 2 ~ 3
次,形成一串细胞,紧密排列在一起(图 1,B、C),再经横向和纵向多次分裂后,形成长形多细
胞团(图 1,D、E),进一步发育成球形胚(图 1,F、G),心形胚(图 1,H),鱼雷形胚(图 1,I),
子叶胚(图 1,J),最后形成大量胚状体(图 1,M)。在培养过程中,也出现连体胚,簇生胚以及
畸形胚等(图 1,K、L)。
2.3 愈伤组织形成过程观察
与胚状体发生相比,形成愈伤组织的小孢子呈现不同的特征,肾形小孢子膨大成球形(图 2,A、

图 2 愈伤组织形成过程
A 和 A1. 初期膨大小孢子,v:液泡;B 和 B1. 膨大小孢子进行首次横向均等分裂,2 细胞;C 和 C1. 小孢子进行第 2 次分裂,4 细胞;
D 和 D1. 小孢子进行第 3 次分裂,8 细胞;E 和 E1. 多细胞团;F. 愈伤组织;G. 培养皿中形成大量愈伤组织。
Fig. 2 The development of calli in carrot microspore culture
A,A1. Swelled microspore;v:Vacuole;B,B1. The first symmetric division of microspore,2 cells;C,C1. The second symmetric division of
microspore,4 cells;D,D1. The third division of microspore,8 cells;E,E1. Multicellular mass;F. Calli;G. Lots of callus in petri dish.


1544 园 艺 学 报 38 卷
A1),含有大液泡,细胞质浓密,细胞器活跃。膨大小孢子首次分裂为均等横向分裂,形成 2 细胞,
有明显的细胞板和液泡(图 2,B、B1),2 细胞继续进行分裂形成 4 细胞(图 2,C、C1),8 细胞
(图 2,D;D1)以及多细胞团(图 2,E、E1),逐渐形成肉眼可见愈伤组织(图 2,F、G),这些
愈伤组织的细胞之间松散而无序的连接在一起。
2.4 再生植株倍性鉴定
对 3 个基因型 70198、70Q78 和 80Q54 产生的 137 株再生植株倍性进行鉴定,单倍体、二倍体
及三倍体的比例分别是 68.6%、29.9%和 1.5%;不同基因型之间再生植株倍性比例不同,70198
单倍体比例高达 81.4%,而 80Q54 只有 33.3%;在 70198 和 80Q54 中分别检测到 1 株三倍体(表
3)。

表 3 不同基因型胡萝卜游离小孢子培养获得再生植株倍性鉴定
Table 3 Ploidy analysis of plants regenerated from IMC of three carrot accessions
单倍体 Haploid plant 二倍体 Diploid plant 三倍体 Triploid plant 材料编号
Code
再生植株
Number of plants
株数
Number
比例/%
Ratio
株数
Number
比例/%
Ratio
株数
Number
比例/%
Ratio
70198 97 79 81.4 17 17.5 1 1.0
70Q78 7 4 57.1 3 42.9 - -
80Q54 33 11 33.3 21 63.6 1 3.0
总计 Total 137 94 68.6 41 29.9 2 1.5
3 讨论
目前有关胡萝卜游离小孢子培养的文献报道较少,仅从个别基因型中诱导出胚状体或愈伤组织
(Matsubara et al.,1995;Ferrie et al.,2010;Górecka et al.,2010)。
本研究中通过改善胡萝卜小孢子提取方法,从 5 份基因型材料中诱导产生胚状体或愈伤组织。
对 70198、70Q78 和 80Q54 的 137 株再生植株进行倍性鉴定,68.6%为单倍体植株,29.9%为二倍体
植株(表 3)。本试验诱导形成胚状体和愈伤组织的时间较长,最短的 80Q54 培养 92 d 后才有肉眼
可见愈伤组织和胚状体,80Q52 在 182 d 后仍有新的愈伤组织形成(表 2),这与本课题组之前胡萝
卜花药培养 60 d 后才产生小孢子愈伤组织或胚状体的结果(庄飞云 等,2010)较为相似。Górecka
等(2010)观察到胡萝卜游离小孢子在培养后 14 d 才出现第 1 次分裂。结球甘蓝游离小孢子在培养
3 d 后就可见到小孢子第 1 次分裂,13 d 肉眼可见胚状体(方淑桂 等,2006),紫菜薹小孢子的首
次分裂发生在热激诱导后 2 ~ 3 d(Wang et al.,2009)。胡萝卜孢子体发育启动时间较长,这可能是
阻碍胡萝卜游离小孢子培养技术发展的关键。通过离体或活体条件下的胁迫处理可以促进培养中的
小孢子或未成熟花粉粒由配子体发育途径转变为孢子体发育途径(Zoriniants et al.,2005)。除热激
处理外,目前普遍采用的胁迫处理有:饥饿、低温、秋水仙碱等。李光威等(2001)认为饥饿处理
对小麦游离小孢子胚胎诱导有促进作用,Gu 等(2004)试验表明 4 ℃低温预处理 2 ~ 4 d 可明显增
强低诱导率甘蓝型油菜小孢子的胚胎发生能力,但何种胁迫方式更有利于启动胡萝卜孢子体发育还
有待进一步研究。
对胡萝卜小孢子产生胚状体和愈伤组织的形成过程进行细胞学观察,发现两者存在完全不同的
结构特征。Zoriniants 等(2005)认为胚性小孢子的形成过程包括小孢子膨大、短暂的细胞周期停滞、
与 DNA 复制或有丝分裂有关信息的表达、小孢子核移向中央等,与本试验观察现象类似。首先胡
萝卜小孢子膨大延长至原来大小 1.5 ~ 4.0 倍,细胞核位于小孢子一端,随着小孢子发育,逐渐移向
8 期 李金荣等:胡萝卜游离小孢子培养及其发育过程研究 1545
中央(图 1,A、A1)。在胚状体形成初期,细胞即按一定规则进行排列,细胞之间连接紧密,而愈
伤组织只是松散地连接在一起,可以明显区分单个细胞。在玉米游离小孢子培养中也出现相似的结
构,分为类胚状体结构和类愈伤结构(Goralski et al.,1999;Matthys-Rochon,2002),类胚状体结
构形状规则,细胞质浓密,而类愈伤组织结构形状不规则且有大量空泡状细胞(Massonneau et al.,
2005)。胚状体发生和愈伤组织发生是单倍体培养获得再生植株的两种途径,但胚状体能直接形成再
生植株,而愈伤组织需要经过进一步分化诱导才能形成再生植株,这两种发生途径与基因型存在密
切关系(表 2)。相关发生机制还需进一步研究。

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