全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（6）：939–948
Acta Horticulturae Sinica
苹果属观赏海棠McANS基因克隆与不同叶色品
种间表达差异分析
田 佶，沈红香，张 杰，姚允聪*，宋婷婷，耿 慧
（北京农学院植物科学技术系，北京 102206）
摘 要：以苹果属观赏海棠品种‘王族’叶片总 RNA为模板，通过 RT-PCR与 RACE扩增，获得一
个 1 350 bp的花色素花青苷元合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）基因的 cDNA序列，其基因编码区
共 1 074 bp，编码 357个氨基酸，命名为 McANS（登录号 FJ817488）。基因组序列全长 1 268 bp，有 1个
内含子，内含子的剪切位点均符合真核生物“GT-AG”规则。使用实时荧光定量 PCR和紫外可见光分光
光度计法，对 3种不同叶色的观赏海棠品种‘火焰’（叶片绿色）、‘绚丽’（新叶红色）和‘王族’（叶片
紫色）幼叶和功能叶中的 McANS 表达量、花青苷和类黄酮含量进行测定分析，结果表明：McANS 在 3
个品种的幼叶和功能叶中均有表达，在幼叶中表达量显著高于功能叶，在‘绚丽’中表达量相差达到 23.82
倍。花青苷含量的变化与 McANS 相对表达量变化趋势具有一致性，而类黄酮含量的变化与 McANS 相对
表达量无明显相关。说明 McANS在苹果属观赏海棠叶片花青苷代谢及色泽形成过程中具有重要作用。
关键词：苹果属；观赏海棠；花青苷元合成酶；花青苷；类黄酮；实时荧光定量 PCR
中图分类号：S 685 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）06-0939-10

Cloning of McANS Gene in Malus Crabapple and Expression Analysis in
Different Cultivars
TIAN Ji，SHEN Hong-xiang，ZHANG Jie，YAO Yun-cong*，SONG Ting-ting，and GENG Hui*
（Department of Plant Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）
Abstract：Using the total RNA from the leaves of Malus crabapple‘Royalty’as the template，the full
cDNA of ANS（anthocyanidin synthase）gene（1 350 bp）was cloned by reverse transcription polymerase
chain reaction（RT-PCR）and rapid-amplification of cDNA ends（RACE）. The gene was named as McANS，
containing an open reading frame（1 074 bp）and encoding a protein of 357 amino acids. Corresponding
DNA sequence is 1 268 bp，containing one intron，and all the cleave sites obey with the GT-AG rule. The
expression of McANS and the content of anthocyanins and flavonoids was determined by real-time
quantitative PCR and spectrophotometer respectively in the mature and young leaves of M.‘Flame’（green
young and mature leaf），M.‘Radiant’（red young leaf and green mature leaf），M.‘Royalty’（purple young
and mature leaf）. The results showed that McANS was expressed in both mature leaves and young leaves of
the above three cultivars，and the expression level of McANS in young leaves is higher than in mature leaves，

收稿日期：2009–11–02；修回日期：2010–04–29
基金项目：北京市人才强教—拔尖创新人才计划项目（PXM2007_014207_044560）；北京市农业科技项目（20070101）；北京市科技新
星人才培养项目（2006B25）
﹡ 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yaoyc_20@126. com）
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23.82-fold difference in M. ‘Radiant’. The trends of anthocyanins content had significant consistency
with that of the relative expression of McANS gene. But flavonoids content had not relevance with relative
expression of McANS gene. It’s description that McANS have very close relationship with the metabolism
of anthocyanins and color of leaf.
Key words：Malus；ornamental crabapples；ANS；anthocyanin；flavonoid；real-time quantitative
PCR

苹果属观赏海棠（Malus ornamental crabapples）是一类极具经济栽培和观赏价值的果树砧木和
园林树木种质资源，包含绿色类、新叶有色类和常色紫叶类 3大叶色类型，在温带落叶果树区果树
生产和城乡绿化中应用广泛。花青苷元合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）是花青苷生物合成途
径中后期第 2 个关键酶，对植物的色彩形成至关重要。近年来，花青苷元合成酶基因（ANS）相继
从拟南芥（Arabidopsis thaliana，AT4G2288）、小麦（Triticum aestivum，AB247921）、金钟连翘（Forsythia
intermedia）等植物中克隆得到（Rosati et al.，1999）。在对彩叶草的研究中发现，ANS基因在红色
品种茎、叶、花有较强的表达，且强于绿色品种（祝钦泷，2004），表明 ANS 基因与植物色泽的形
成有着密切的联系。然而，在苹果属多色型观赏海棠中，不同叶色基因型色泽形成机理以及花青苷
元合成酶基因结构和功能及其品种间差异，至今未见相关报道。作者在克隆获得苹果属观赏海棠叶
片查耳酮合成酶基因（McCHS）、查耳酮异构酶基因（McCHI）和黄烷酮 3–羟化酶基因（McF3H）
（GenBank登录号分别为：FJ599763、FJ817485和 FJ817486），并对不同叶色品种基因表达差异研
究的基础上，拟从常色紫叶类品种‘王族’中克隆获得花青苷元合成酶基因，并对基因及其编码蛋
白序列进行分析；同时，采用实时荧光定量 PCR技术和分光光度计分别对不同叶色类型品种叶片中
花青苷元合成酶基因表达量、花青苷和类黄酮含量进行检测和分析，以期为苹果属观赏海棠叶色形
成的分子机理研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为苹果属观赏海棠 3个不同叶色类型品种的叶片，包括：常色紫叶类（叶片为紫色）
‘王族’（‘Royalty’）；新叶有色类（幼叶红色，功能叶绿色）品种‘绚丽’（‘Radiant’）和绿叶类
品种‘火焰’（‘Flame’）。
于 2008年春季 4月在北京农学院观赏海棠种质资源圃，选择树势和生长势相似的植株（每品
种各 3株），分别标记，在每株树树冠外围东、西、南、北 4个方向确定一个新梢，选取各品种新梢
上萌芽 7 d的幼叶和萌芽 50 d的功能叶 20片，液氮速冻后，–80 ℃条件下保存备用。
1.2 总 RNA和 DNA的提取及 cDNA第 1链的合成
用改良热硼酸法（陆旺金和蒋跃明，2003）提取‘王族’幼叶总 RNA。以提取的总 RNA为模
板，利用 Clontech SMARTTM Library试剂盒（购自 Clontech生物有限公司）合成 3′-RACE和 5′-RACE
cDNA第 1链。采用 CTAB法提取‘王族’叶片总 DNA（Williamson et al.，1994）。
1.3 观赏海棠McANS基因序列的克隆
以上述提取得到的‘王族’叶片 cDNA为模板，根据 GenBank上登录的近缘植物花青苷元合成
酶基因保守区段序列，设计 3′ 端引物 ANSP1：5′ -GGGAGGACTACTTCTTCCAC-3′，扩增 McANS
6期 田 佶等：苹果属观赏海棠McANS基因克隆与不同叶色品种间表达差异分析 941
基因的 3′ 端序列；设计 5′ 端引物 ANSP2：5′ -GGAACCATGTTGTGGAGGATG-3′，扩增 McANS
基因的 5′ 端序列。UPM（Universal Primer）通用引物由 RACE试剂盒提供，根据试剂盒说明，转
录产物的 3′ 末端和 5′ 末端分别用 ANSP1和 ANSP2与 UPM引物扩增，其 PCR反应条件为 94 ℃预
变性 5 min、94 ℃变性 1 min，分别于 55 ℃和 57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，30个循环；72 ℃
延伸 5 min。
PCR产物经回收、纯化，与 pMD19-T Vector（购自宝生物工程有限公司）连接，转化 DH5α感
受态细胞，蓝白斑筛选后测序（上海生工生物工程技术服务有限公司）。
用 DNAMAN5.2.2软件拼接以上序列得到苹果属观赏海棠叶片花青苷元合成酶基因全长 cDNA
序列。
1.4 观赏海棠McANS基因 cDNA和 DNA全长序列的获得
以上述提取得到的‘王族’叶片 cDNA和 DNA为模板，设计全长引物 ANSF1：5′-ATGGGTG
AGTCTGATTCAGTG-3′ 和 ANSR1：5′ -GCTTTGCTCCCCAAGTGA-3′，扩增花青苷元合成酶基因
的全长序列。
PCR反应条件为 94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 3 min，30个
循环，72 ℃延伸 5 min。PCR产物经回收、纯化，与 pMD19-T Vector连接，转化 DH5α感受态细胞，
蓝白斑筛选后测序。
1.5 实时荧光定量 PCR分析
分别提取‘王族’、‘火焰’、‘绚丽’3个品种的幼叶和功能叶 RNA（陆旺金和蒋跃明，2003），
使用M-MuLV First cDNA Synthesis Kit（购自 Promega公司）合成第 1链 cDNA备用。
按照 Real Master Mix（SYBR Green）PCR 试剂盒（购自天根生化科技有限公司）操作指导，
采用实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）的方法，检测基因的相对表达量。
扩增目标 McANS基因引物被设计为 ANS-F：5′ -AAGGAGAAGTATGCCAATGA-3′ 和 ANS-R：5′-
TTGAGGCCAAATAGACAAGT-3′ ，预测产物长度是 153 bp，适用于荧光定量 PCR；以 Malus ×
domestica 18S ribosomal RNA（苹果属 18S核糖体 RNA）基因 GenBank（序列号 DQ341382）作为
内参基因，其引物 18SR-F：5′ -ACACGGGGAGGTAGTGACAA-3′ 和 18SR-R：5′ -CCTCCAATGGATC
CTCGTTA-3′ 预测产物长度是 80 bp，适用于荧光定量 PCR。对反转录所得的 cDNA分别进行 5倍
梯度稀释（1、1/10、1/100、1/1 000、1/10 000），实时荧光定量反应，绘制相对标准曲线。反应程
序为：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 20 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，40个循环，每个循环第
3步进行荧光采集，最后 95 ℃变性 1 min，退火至 55 ℃（每隔 10 s上升 0.15 ℃），上升至 85 ℃后
保温 1 min，接着检测其荧光值，绘制熔点曲线。内参基因反应程序与 McANS基因的反应程序相同。
标准品 cDNA和待测样品均设置 3次重复。
1.6 花青苷和类黄酮含量测定
花青苷和类黄酮相对含量的提取根据何弈昆等（1995）和林河通等（2005）的方法略有改动。
称取 1.0 g叶片剪碎（2 ~ 3 mm），置于 50 mL离心管中，加入 10 mL 1%的盐酸甲醇，常温下浸泡
20 h。取上清液，以提取液作空白，采用 UNICO UV-2100型紫外可见分光光度计在 530 nm处和 325
nm处测定吸光度。
以每克叶片鲜质量的提取液的光密度变化值 OD530 = 0.1作为一个花青苷单位。类黄酮含量以每
克叶片鲜质量的提取液的光密度变化值 OD325 = 1作为一个类黄酮单位。

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2 结果与分析
2.1 McANS基因的克隆与序列比较
依据 GenBank公布的保守片段设计 5′ 和 3′ 末端的 RACE引物。对 UPM/ANSP2 进行 McANS
的 5′末端的扩增反应，在琼脂糖凝胶电泳中显现出 750 bp左右的目的条带（图 1，A），将其回收、
测序，获得到 1条 ANS的 5′ cDNA末端。用引物 UPM/ANSP1进行 McANS的 3′ 末端扩增，获得一
条约 900 bp的带（图 1，A），克隆入 T–载体，挑选 6个长度有代表性单克隆测序，获得到 1条 ANS
的 3′ cDNA末端。Blast确认上述片段与其它植物 ANS基因同源。根据 3′ RACE和 5′ RACE测序结
果拼读出苹果属观赏海棠花青苷元合成酶基因，全长序列为 1 350 bp，命名为 McANS（登录号
FJ817488）。
图 1 McANS基因的扩增结果
A. McANS基因的 5′ RACE和 3′ RACE PCR扩增结果；B. McANS基因 cDNA和 DNA全长 PCR扩增结果。
Fig. 1 The PCR results of McANS
A. The PCR results of 5′ RACE and 3′ RACE for McANS；B. The PCR results of cDNA and DNA full length for McANS.

基因组扩增得到约 1 300 bp的条带，拼接后得到全长序列为 1 268 bp（图 1，B）。分析发现，
McANS存在 1个内含子，结果与大多数物种一致（图 2）。将起始密码子 ATG定义为+1位，位于+508
bp ~ +699 bp（内含子 1）。内含子－外显子边界均符合“GT-AG”规则，与 GenBank中已经报道的
裂叶牵牛（Ipomoea hederacea，AY257210）、草莓（Fragaria × ananassa，AY695818）、金钟连翘
（Forsythia intermedia）（Rosati et al.，1999）、葡萄（Vitis vinifera，AB073018）（Kobayashi et al.，
2002）的基因结构和剪接位点一致。McANS 的内含子与苹果属 ANS 基因的内含子同源性较高，相
似度 98%，与李属植物的 ANS基因内含子同源性也较高。内含子中在 + 518 bp处含有一个直接重
复序列 TTAAAATT，在 + 518 bp、+ 571 bp处分别存在一个 8 bp的（TTAAAATT）和（AATTTTAA）
的反向重复序列等。
图 2 McANS基因的结构分析
Fig. 2 The structure analysis of McANS

6期 田 佶等：苹果属观赏海棠McANS基因克隆与不同叶色品种间表达差异分析 943
对该基因的序列进行分析表明，其含有一个编码 357个氨基酸的完整阅读框架，包括起始密码
子和终止密码子。利用 DNAMAN5.2.2 软件，对 McANS 基因编码的氨基酸序列分析，认为该基因
具有完整的 3′ 和 5′ 末端，是苹果属观赏海棠花青苷元合成酶基因的全长序列（图 3）。

1 CGCGCGTAATATACTAGCTGAGATAGTATATTGTCGAAAGCCAGCTCCAAATATGGTGAG
1 M V S
61 TTCTGATTCAGTGAATTCAAGGGTTGAGACCTTGGCCGGCAGTGGAATCTCAACCATCCC
4 S D S V N S R V E T L A G S G I S T I P
121 AAAAGAGTACATCAGACCTAAAGATGAGCTCGTAAACATTGGTGACATCTTCGAACAAGA
24 K E Y I R P K D E L V N I G D I F E Q E
181 GAAGAACAACGAAGGGCCTCAAGTTCCCACCATCGATTTGAAGGAGATAGAGTCTGATAA
44 K N N E G P Q V P T I D L K E I E S D N
241 CGAAAAAGTGAGAGCAAAATGCAGGGAGAAGTTGAAGAAGGCAGCTGTGGACTGGGGTGT
64 E K V R A K C R E K L K K A A V D W G V
301 CATGCACCTTGTGAACCATGGCATCTCCGACGAGCTCATGGACAAGGTCAGGAAGGCCGG
84 M H L V N H G I S D E L M D K V R K A G
361 TAAGGCCTTCTTTGACCTTCCCATTGAGCAGAAGGAGAAGTATGCCAATGACCAGGCCTC
104 K A F F D L P I E Q K E K Y A N D Q A S
421 TGGTAAGATTCAAGGCTATGGAAGCAAGCTTGCAAACAATGCATCTGGGCAGCTTGAGTG
124 G K I Q G Y G S K L A N N A S G Q L E W
481 GGAGGACTACTTCTTCCACTGTGTATACCCAGAGGACAAGCGTGACTTGTCTATTTGGCC
144 E D Y F F H C V Y P E D K R D L S I W P
541 TCAAACACCTGCTGATTACATTGAGGCAACCGCCGAGTATGCTAAGCAATTGAGGGAGTT
164 Q T P A D Y I E A T A E Y A K Q L R E L
601 AGCAACCAAGGTACTGAAAGTTCTGTCACTTGGCTTGGGATTGGATGAAGGGAGGCTGGA
184 A T K V L K V L S L G L G L D E G R L E
661 GAAAGAAGTTGGTGGACTTGAAGAGCTCCTCTTGCAAATGAAAATCAACTACTACCCAAA
204 K E V G G L E E L L L Q M K I N Y Y P K
721 ATGCCCTCAGCCGGAGCTTGCACTTGGTGTTGAAGCTCACACTGACGTGAGTGCACTCAC
224 C P Q P E L A L G V E A H T D V S A L T
781 CTTCATCCTCCACAACATGGTTCCTGGCCTGCAGCTTTTCTATGAAGGAAAGTGGGTCAC
244 F I L H N M V P G L Q L F Y E G K W V T
841 TGCCAAGTGCGTTCCAAATTCCATCGTCATGCACATTGGGGACACACTTGAGATTTTGAG
264 A K C V P N S I V M H I G D T L E I L S
901 CAATGGGAAGTACAAAAGTATACTCCACAGGGGCATGGTGAACAAGGAAAAGGTGAGGAT
284 N G K Y K S I L H R G M V N K E K V R I
961 TTCATGGGCTGTTTTCTGTGAGCCACCAAAGGAGAAGATCATCCTTAAGCCACTGCCGGA
304 S W A V F C E P P K E K I I L K P L P E
1021 GACCGTGTCTGAGGACGAGCCGGCAATGTTCCCACCACGAACTTTTGCTGAGCACATTCA
324 T V S E D E P A M F P P R T A E H I Q F
1081 GCACAAGTTGTTCAGGAAGAGCCAAGAGGCTTTGCTCCCCAAGTGAAGCGCGTTGTGCTA
344 H K L F R K S Q E A L L P K
1141 AATTATAATATTGTTGTGAACTATCGTCCTAATAAATCTGTTTATGGCATAGTTGGTATG
1201 ATATATCTTAGTTTCCATAGTATGTGGGTTTCCTTTTTGCACTTGGCTAAGCTACTCCTG
1261 TCCGCCTGCTTTGTTGAATAATATTGATTTTATGTCCTTGTACCTGTGATGAATGGCTAT
1321 TTTCAAGTCAAGATTTCAACAAAAAAAAAA

图 3 苹果属观赏海棠McANS基因 cDNA的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
起始密码子和终止密码子用下划线表示，阴影处是保守结构域。
Fig. 3 The complete cDNA sequence of McANS and its predicted amino acid sequence
The translation start codon and the stop codon are underlined；The functional domain are shadowed.

McANS main ORF 编码的 357个氨基酸（pI 5.82）的分子量约为 40.3 kD，其编码的蛋白具有典
型 ANS蛋白的保守结构域：2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶结构域（从 Leu212到 Pro311），这一结构域由 2–
酮戊二酸和 Fe(Ⅱ)–依赖的氧化酶超家族组成。这个家族包含的脯氨酰 4–羟化酶的 α 亚基的 C–
末端具有全酶活性，能够催化反应：前胶原 L–脯氨酸 + 2–酮戊二酸 + O2 = 前胶原反式–4–羟
基–L–脯氨酸 + 琥珀酸 + CO2。全酶由一个 α2β2 复合物组成，α 亚基是其主要的活性位点。这
个家族还包括赖氨酸水解酶，异青霉素合成酶和 AlkB。

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根据 NetPhos2.0 Server 的磷酸化位点预测显示，McANS 蛋白包括 9 个 Ser 磷酸化位点，4 个
Thr磷酸化位点和 4个 Tyr磷酸化位点。众多的磷酸化位点存在说明可逆磷酸化调控在实现McANS
蛋白的功能中起重要作用。
用 SOPMA对蛋白的二级结构预测表明，McANS蛋白与草莓和葡萄（SOPMA预测）之间的二
级结构十分相似。它们主要由 α 螺旋、随机卷曲、β 折叠和延伸链组成。在二级结构中，α 螺旋主
要集中在蛋白的前中部和 C–末端。McANS 蛋白由 34.45%的 α 螺旋（α helix）、17.65%的延伸链
（extended chain）、5.04%的 β折叠（β sheet）和 42.86%的随机卷曲（random coil）组成（图 4）。
图 4 McANS氨基酸结构
Fig. 4 The amino acids structure of McANS

以 AtANS（1gp6A）为模型，用 Swiss-Model 对 McANS 蛋白进行三级结构的同源建模，所得
到结果都与已知结构和功能的拟南芥 ANS蛋白的三级结构很类似（图 5）。McANS蛋白的结构符合
2OG-FeⅡ_Oxy 氧化酶的特征结构。二级结构预测的结果支持三级结构的预测，C–末端具有一个 α–
螺旋，N–末端及其中部的多个 α–螺旋组成“果冻”结构的重要骨架，而延伸链则主要位于内部，
组成缺口的表面。由结构的相似性可以推知McANS可能具有与 AtANS相同的生物学功能。

图 5 McANS蛋白三级结构和 AtANS蛋白结构
Fig. 5 The protein structure of McANS
6期 田 佶等：苹果属观赏海棠McANS基因克隆与不同叶色品种间表达差异分析 945
2.2 苹果属观赏海棠McANS的同源性及进化分析
利用 DNAMAN5.2.2 软件进行多重序列比对发现（图 6），McANS 含有与其他同源基因相似的
main ORF，显示了花青苷元合成酶进化的保守性。
图 6 苹果属观赏海棠McANS基因 main ORF推导的氨基酸序列的多重比对分析
Fig. 6 Alignment of the predicted amino acid sequences of McANS main ORF in Malus crabapples and those of several other plant

对 McANS与已知植物 ANS结构域蛋白进行进化树分析，可以看出 McANS编码的氨基酸序列
具有较高同源性。其与葡萄（EF192468）、草莓（AY695817）、梨（DQ230994）的同源性最高，其

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一致性分别为 80.11%、81.98%和 99.44%。基于氨基酸序列的系统进化树可以看出其氨基酸的进化
与植物的进化基本一致，同科植物在进化树上处于同一分支，其氨基酸的进化与植物的进化基本一
致，同科植物在进化树上处于同一分支。McANS与草莓（AY695817）、梨（DQ230994）的 ANS具
有更近的亲缘关系，但与银杏（EU600206）、水母雪莲（AY547342）亲缘关系较远（图 7）。

图 7 苹果属观赏海棠McANS氨基酸序列与不同来源 ANS氨基酸序列的系统进化树
Fig. 7 Phylogenetic tree of ANS from various species including McANS

2.3 McANS基因在不同叶色品种中的表达分析
由 iCycleriQTM自动测出的苹果属全属内参基因 18S rRNA 的回归方程、PCR扩增效率和相关系
数分别为：y = –3.409x + 35.857、96.5%和 0.997；测出的苹果属全属McANS的回归方程、PCR扩增
效率和相关系数分别为：y = –3.299x + 40.81、100.1%和 1.000。说明该试验具有良好的重复性和较
高扩增效率。熔点曲线分析出的 18S rRNA和McANS均只有 1个 Tm值，分别为 88 ℃和 84 ℃，表
明 18S rRNA和McANS所用引物具有高度特异性，其 PCR扩增产物均为目的片段，不含引物二聚体。
花青苷含量分布较为规律，在常色紫叶类‘王族’中含量最高，新叶有色类‘绚丽’中次之，
绿色叶‘火焰’最低。‘王族’和‘绚丽’幼叶中花青苷含量均高于功能叶中。3个品种功能叶中类
黄酮含量均低于幼叶，但在品种间的变化规律与花青苷含量的变化规律无明显对应关系（图 8）。
图 8 苹果属观赏海棠叶片中McANS基因相对表达量与花青苷、类黄酮含量的关系
Fig. 8 The relationship between relative expression levels of McANS and the content of anthocyanins and flavonoids
in the leaves of different Malus crabapples

以‘王族’幼叶的表达量定为“1”。按照相对定量公式 2-△△Ct作图。可以看出，McANS基因在
3个不同叶色类型的观赏海棠品种的幼叶和功能叶中均有表达。幼叶的 McANS表达量明显高于功能
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叶，在新叶有色类品种‘绚丽’中相差最大，幼叶表达量是功能叶表达量的 23.82 倍。幼叶和功能
叶中 McANS 表达量与幼叶、功能叶中花青苷含量的变化规律呈现明显的一致性，而与类黄酮含量
的变化规律无明显相关。从表观特性可以看出，颜色较深的叶片中花青苷含量较高；同时 McANS
的表达量也较高，这表明 ANS基因的表达与花青苷积累之间可能存在较为紧密的关系。
3 讨论
在植物花青素合成途径中，花青苷元合成酶（ANS）催化无色花青素苷元形成显色的花青苷元，
此中间产物进一步与 3-O-葡萄糖基转移酶（3GT）偶联并且被传送到液泡中，形成显色的 3-O-糖苷
化花青苷（Nakajima et al.，2001），在植物色泽形成中具有重要作用。ANS基因最初是利用转座子
标签技术从玉米的 A2 突变体中鉴定和克隆得到（Menssen et al.，1990），近年来在拟南芥
（AT4G2288）、小麦（T. aestivum，AB247921）、金钟连翘（F. intermedia）（Rosati et al.，1999）中
也已经得到其克隆。目前报道的大多数 ANS基因的结构均由 2个外显子和 1个内含子组成，且剪接
位点一致，如裂叶牵牛（Ipomoea hederacea）、草莓（Fragaria × ananassa）、金钟连翘（F. intermedia）
等，但小麦（T. aestivum，AB247921）和水稻（Oryza sativa）的 OsANS却没有内含子。Rupert等（2002）
在拟南芥中得到了 ANS的晶体结构，发现其活性位点是一个金属离子、共底物（cosubstrate）和两
分子的底物类似物（substrateanalog）共同构成的多复合体（multi-complex）。本研究从苹果属观赏
海棠常色紫叶类品种‘王族’中克隆得到了 McANS 的 cDNA 和 DNA 全长序列，其具有植物 ANS
典型的结构特点。McANS 存在 1 个内含子， 结果与大多数物种一致，内含子–外显子边界均符合
“GT-AG”规则，与 GenBank中已经报道的裂叶牵牛（AY257210）、草莓（AY695818）、金钟连翘
（Rosati et al.，1999）、葡萄（V. vinifera，AB073018）（Kobayashi et al.，2002）的基因结构和剪接
位点一致。McANS的内含子与苹果属 ANS基因的内含子同源性较高，相似度 98%。McANS基因编
码的蛋白具有典型 ANS蛋白的保守结构域：2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶结构域（从 Leu212到 Pro311），这
一结构域由 2–酮戊二酸和 Fe(Ⅱ)–依赖的氧化酶超家族组成，能够催化反应：前胶原 L–脯氨酸 +
2–酮戊二酸 + O2 = 前胶原反式–4–羟基–L–脯氨酸+琥珀酸 + CO2。全酶由一个 α2β2复合物组
成，α亚基是其主要的活性位点。对 McANS 进行二级结构预测发现，α 螺旋主要集中在蛋白的前
中部和 C–末端，与草莓和葡萄的二级结构类似。与其他已知的 ANS 蛋白相比，McANS 编码的氨
基酸具有较高的同源性，其与葡萄（EF192468）、草莓（AY695817）、梨（DQ230994）的同源性最
高，一致性分别为：80.11%、81.98%和 99.44%，所以推断 McANS与葡萄、草莓等物种中典型的花
青苷元合成酶基因的生物学功能类似。McANS 基因编码蛋白的三级结构建模表明，McANS 与已知
结构和功能的拟南芥 AtANS（1gp6A）蛋白的高级结构非常相似，故而推断McANS蛋白与 AtANS
蛋白在酶催化反应上功能相似，可能为花青苷代谢途径重要的代谢酶。这为进一步研究 McANS 的
遗传转化和揭示观赏海棠器官色泽形成的分子机理提供了基础，但是 McANS 的确切基因功能需要
进一步通过对其进行遗传转化和蛋白功能分析进行验证。
结合实时荧光定量 PCR数据、花青苷和类黄酮含量测定数据可以看出，在 3个不同叶色类型的
观赏海棠品种的幼叶和功能叶中 McANS 基因均有表达，且与幼叶和功能叶中花青苷含量的变化趋
势具有相似的增长特性。在常色紫叶类品种‘王族’中，其 McANS 的表达量始终较高，与其叶色
特征相对应；在其余两个品种中，这种对应关系也较明显：绿叶色类品种‘火焰’中，McANS的表
达量始终较低。在新叶有色类品种‘绚丽’中，幼叶紫色期其 McANS 的表达量也较高，功能叶变
为绿色后，表达量随之降低。这表明 McANS 基因对于苹果属观赏海棠叶片色泽形成过程可能起主
要作用，推断与其基因的催化功能吻合。Aharoni等（2001）在草莓上通过抑制 ANS基因的表达量，

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使花青苷的积累明显减少，花冠由粉红色变为白色，表明基因对从无色花青苷元到产生有色的花青
苷的催化过程是植物红色形成的重要因素之一。作者曾应用同样的方法研究过观赏海棠 McCHS 基
因在叶片发育过程中的变化及与花青苷积累的关系。通过比较发现，McCHS基因的表达量与 McANS
基因的表达量相互对应，变化规律一致（宋婷婷 等，2010）。Carlo等（2003）将 CHS和 ANS基因
同时转入美国金钟连翘获得了具有深橙黄色花朵的新品种，而分别转入这两种基因则不改变花色。
表明其为花青苷合成途径的主要结构基因，协同表达对于苹果属观赏海棠呈色的多样性非常重要。
在对类黄酮含量的数据分析中发现，‘火焰’和‘绚丽’幼叶中的类黄酮含量与 McANS基因的
表达并不形成对应关系，而在‘火焰’中，幼叶中类黄酮的含量高于功能叶，且类黄酮含量与 McANS
的相关性稍低于花青苷与 McANS 的相关性。这可能与类黄酮代谢支路的多样性及类黄酮的抗逆作
用有关，需对支路基因表达分析和代谢产物功能等进一步研究阐明。

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