全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (8) : 1221 - 1226
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 03 - 24; 修回日期 : 2009 - 06 - 23
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30871713) ; 河北省自然科学基金项目 (C2005000222) ; 河北农业大学将帅计划项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: shensx@ hebau1edu1cn)
结球甘蓝相对于大白菜的连锁群特异 SSR标记建
立
顾爱侠 , 王彦华 , 轩淑欣 , 陈雪平 , 申书兴 3
(河北农业大学园艺学院 , 河北保定 071000)
摘 　要 : 选用位于甘蓝 9个连锁群的 91对 SSR引物 , 对 8个结球甘蓝品种和 7个大白菜品种进行 PCR
扩增 , 筛选出 25对结球甘蓝相对大白菜的特异 SSR引物 , 涉及甘蓝的 9个连锁群 , 其中位于 O1连锁群 3
对 , O2连锁群 4对 , O3连锁群 2对 , O4连锁群 3对 , O5连锁群 2对 , O6连锁群 2对 , O7连锁群 4对 ,
O8连锁群 2对 , O9连锁群 3对。为利用 SSR标记鉴定大白菜 —结球甘蓝异附加系中附加的结球甘蓝染色
体奠定了基础。
关键词 : 大白菜 ; 结球甘蓝 ; SSR; 连锁群特异标记
中图分类号 : S 63511; S 63411　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0821221206
Establishm en t of Spec if ic SSR from D ifferen t L inkage Groups of Cabbage
Com pared w ith Ch inese Cabbage
GU A i2xia, WANG Yan2hua, XUAN Shu2xin, CHEN Xue2p ing, and SHEN Shu2xing3
(College of Horticulture, A gricultural U niversity of Hebei, B aod ing, Hebei 071001, Ch ina)
Abstract: N inety2one p rimers from 9 cabbage linkage group s were amp lified on 8 cabbage cultivars and
7 Chinese cabbage cultivars, 25 of them were specific on cabbage compared with Chinese cabbage. These
p rimers assigned 9 linkage group s of cabbage, 3 of them were assigned linkage group O1, 4 of them were as2
signed linkage group O2, 2 of them were assigned linkage group O3, 3 of them were assigned linkage group
O4, 2 of them were assigned linkage group O5, 2 of them were assigned linkage group O6, 4 of them were as2
signed linkage group O7, 2 of them were assigned linkage group O8, and 3 of them were assigned linkage
group O9. It laid a foundation to further identify the introduced chromosome of cabbage in Chinese cabbage
alien addition lines.
Key words: Chinese cabbage; cabbage; SSR; linkage group2specific marker
异附加系是利用外源基因进行基因组研究和品种改良的重要材料 , 被广泛用来转导近缘种或野生
种中各种有用性状 ( Peterka et al. , 2004)。创建大白菜 —结球甘蓝异附加系 , 不仅能够将结球甘蓝
优良基因向大白菜基因组转移 , 也能够将这些基因定位并确定其遗传模式 , 为研究大白菜与结球甘蓝
亲缘关系 , 解剖结球甘蓝基因组提供新的途径。但由于芸薹属染色体小 , 形态相近 , 使得在大白菜背
景下区分结球甘蓝染色体的细胞学研究十分困难 ( Snowdon, 2007)。Cheng等 (1995) 采用核型分析
鉴定出了 4号芸薹 —芥蓝单体异附加系 , 但同时也阐明了在芸薹背景下区分芥蓝的 2号和 3号 , 5号
和 6号染色体是非常困难的。
GISH是鉴定异染色体系常用高效的方法 , 魏文辉等 (2006) 利用 GISH分析获得了白芥与甘蓝
单体异附加系 , 但 GISH不能区分芸薹属 A、C基因组染色体 ( Snowdon et al. , 1997; 李宗芸 等 ,
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
2003)。Hasterok等 (2005) 采用荧光原位杂交 ( F ISH) 技术 , 以 5S rDNA、25S rDNA为探针 , 也仅
鉴定出了 5、8、9号芸薹 —芥蓝单体异附加系。目前尚未见精确区分大白菜 (AA ) 与结球甘蓝
(CC) 每条染色体的方法。
在芸薹属中 , RFLP和 RAPD被广泛应用于系统发育和遗传图谱研究 , 但 RAPD为显性标记 , 稳
定性较差 , RFLP多态性较低 , 且操作复杂。SSR ( simp le sequence repeats) 几乎遍布所有真核生物基
因组 (D ib et al. , 1996; D ietrich et al. , 1996) , 在染色体除着丝粒及端粒区域外 , 其他区域均广泛
分布有 SSR位点 , 具有多态性高 (W eber & May, 1989; Hancock, 1995 )、稳定性强、操作简便、
DNA用量少、表现为共显性的孟德尔遗传 (Morgante & O livieri, 1993; Thomas & Scott, 1993) 等特
点 , 近些年广泛用于植物遗传图谱构建 , 系统发育关系分析 , 种质资源分类鉴定 , 杂种鉴定 , 分子标
记辅助育种选择 ( Gup ta & Varshney, 2000; Suwabe et al. , 2002; Piquemal et al. , 2005; 殷兆晴 等 ,
2006) 等诸多方面。
本研究中利用 91对甘蓝 SSR引物 , 筛选并建立结球甘蓝每个连锁群相对于大白菜的特异引物 ,
为大白菜 —结球甘蓝异附加系的鉴定开辟新途径。
1　材料与方法
试材为结球甘蓝 (B rassica oleracea L. var. capita ta L. ) : 春季早熟品种 ‘中甘 11’、‘8312’和
‘极早甘蓝’, 春季中熟品种 ‘京丰一号 ’, 春秋兼用早熟品种 ‘中甘 17’和 ‘中甘 18’, 秋季中熟
品种 ‘中甘 19’, 秋季晚熟品种 ‘晚丰甘蓝 ’; 大白菜 [ B rassica cam pestris L. ssp. pekinensis (Lour)
O lsson ] 抗抽薹炮弹型品种 ‘强丰春白菜 ’和 ‘高抗王 ’, 中晚熟直筒合抱品种 ‘多抗 75’, 极早熟
叠抱品种 ‘超级夏阳 ’和 ‘早熟五号 ’, 早熟高桩直筒品种 ‘秋绿 55’, 中熟矮桩叠抱品种 ‘新乡小
包 23’。
以上品种均为生产商用品种。于 2008年 3月在河北农业大学细胞生物实验室内播种于穴盘 , 2～
3片时剪取真叶 , CTAB法提取基因组 DNA。
引物来源于 http: / / brassica1 info, 共选取了分布于甘蓝 9个连锁群的 91对 SSR引物 (表 1) , 引
物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
每个反应体系为 20μL, 含模板 DNA 50 ng, 115 mmol·L - 1 Mg2 + , 1 ×buffer , 200μmol·L - 1
dNTP, 1U Taq酶 , 正反向引物各 012μmol·L - 1。
PCR扩增程序为 94 ℃预变性 2 m in; 94 ℃变性 1 m in, 55～60 ℃复性 30 s, 72 ℃延伸 45 s, 35个
循环 ; 72 ℃延伸 5 m in, 4 ℃保存。
扩增产物在 6%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离 , 采用银染法检测 , 并照相。
2　结果与分析
211　大白菜、结球甘蓝多态性
在选用的 91对 SSR引物中 , 对于大白菜 , 每个 SSR引物位点检测到的等位基因数为 0～4个 ,
检测到 2个等位基因的频率最高 , 为 45% ; 检测到 3个和 4个等位基因频率均为 17% ; 1个等位基因
频率为 11% ; 10%的引物在大白菜上没有扩增产物。
在结球甘蓝中 , 每个 SSR引物位点检测到的等位基因数为 1～6个 , 检测到 2个等位基因的频率
最高 , 为 40% ; 检测到 1个等位基因的频率为 5% ; 3个等位基因的频率为 17% ; 4个等位基因的频
率为 20% ; 5个和 6个等位基因的频率分别为 13%和 5%。
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　8期 顾爱侠等 : 结球甘蓝相对于大白菜的连锁群特异 SSR标记建立 　
212　多态性引物在连锁群上的分布
筛选结球甘蓝每个染色体相对于大白菜具有差异引物的标准是 : 在结球甘蓝上有扩增产物而在大
白菜上没有扩增产物的引物 ; 或是两者都有扩增产物 , 但扩增产物大小存在差异的引物。
在选用的 91对 SSR引物中 , 25对能够在结球甘蓝、大白菜扩增出清晰有差异的片段 , 片段长度
在 40～430 bp, 其中 7对引物在结球甘蓝品种上有扩增产物 , 而大白菜品种上没有扩增产物。
这 25对引物涉及了甘蓝的 9个连锁群 (表 1) , 其中 O1连锁群 3对 (图 1, A～C) , O2连锁群
4对 (图 1, D～G) , O3连锁群 2对 (图 1, H、 I) , O4连锁群 3对 (图 1, J～L ) , O5连锁群 2对
(图 1, M、N ) , O6连锁群 2对 (图 1, O、P) , O7连锁群 4对 (图 1, Q～T) , O8连锁群 2对 (图
1, U、V ) , O9连锁群 3对 (图 1, W～Y)。
表 1　甘蓝连锁群特异引物
Table 1　L inkage group2spec if ic pr im ers of cabbage
连锁群
L inkage group
SSR引物
SSR p rimers
特异 SSR引物
Specific SSR
p rimers
特异引物扩增产物的
片段大小 / bp
Size range of p roducts
from specific p rimers
特异引物重复类型
Repeat type of
specific p rimer
O1 Na10H03, Na10H06, Na12C08 , Na12H04 , Na10H03 90～128 ( GGC) 6
nga248, N i4B10 , O l10A11, O l10F11
N i4B10 165～185 (CT) 20
Na12C08 140～404 (CT) 50
O2 Na12C03, Na12H09, N i2C12, O l09A03a, O l09A06a, O l13G05 100～130 (CCG) 5
O l13E08b, O l13G05, sORA26, sORA43 sORA43 100～198 ( GGC) 7
Na12C03 123～250 ( GA) 30
Na12H09 108～162 ( GA) 24
O3 BN12A, CALSSR, Na10E02d, Na10G10, Na12F12, O l11G11 100～163 (CCG) 5
Na14E02, N i4G04, O l10A05a, O l10B04, O l11B05, BN12A 147～350 ( GA) 11 (AAG) 4
O l11G11, O l13A10, O l13C12b, O l13H09, Ra2E11b
O4 Na10B04a, Na10F06, Na12E05, Na14E08, Na14E11, Na12E05 110～165 (CA) 10
N i2D08b, N i4F08, O l10A09, O l10F12, O l10G08a, O l10F12 95～130 (CT) 64
O l11H02b, O l11H08, O l12B05a, O l12F07, O l13D02Aa O l11H08 76～160 (AG) 24
O5 Na10D11, Na10A08A, Na10B08, Na10G08A, Na10D11 123～220 ( GA) 27
Na12D10, Na12E06Ab, N i2F02b, N i4C11, Ra2A04b 40～67 ( GA) 58
O l10G09, O l12F02a, Ra2A04b, sORA21b
O6 Ap1a5p r, ca72,MB4, Na10C06, Na12A02b, Ap1a5p r 187～217 %
Na14F11, nga111, N i2A11, O110H07b, O l10F09, Ra2A05 Na14F11 137～430 ( GT) 7
O7 BN72a, Na12F03, O l10B01, O l10H04, O l11C02, Ra3C04a O l10B01 116～201 ( GA) 20
BN72a 140～309 ( TAA) 5 ( GA) 9
Na12F03 147～309 ( GA) 35
O l10H04 120～201 (CT) 29
O8 N i2F11A, N i4D09, O l12D05, O l12G04b O l12D05 103～140 (CT) 32
O l12G04b 90～135 ( TC) 24
O9 BN83b1, N i2B01, O l10D08, O l11B03a, O l11H06, O l12A04, O l12D09 95～135 (CGG) 4
O l12D09, O l13C03, Ra1F03, Ra2E01c, Ra2E03b Ra1F03 97～145 ( TCCVGCC) 18
O l12A04 95～160 (CT) 17
　　注 : “%”表示尚不清楚。
Note: “%”rep resented unknown.
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图 1　连锁群特异引物在结球甘蓝品种和大白菜品种中的扩增结果
1: 极早甘蓝 ; 2: 晚丰甘蓝 ; 3: 中甘 17; 4: 京丰一号 ; 5: 中甘 18; 6: 中甘 11; 7: 中甘 19; 8: 8312; 9: 秋绿 55;
10: 超级夏阳 ; 11: 新乡小包 23; 12: 多抗 75; 13: 早熟五号 ; 14: 高抗王 ; 15: 强丰春白菜。
F ig. 1　Am plif ica tion results of linkage group2spec if ic pr im ers on var ieties of Ch inese cabbage and cabbage
1: J izao cabbage; 2: W anfeng cabbage; 3: Zhonggan 17; 4: J ingfeng 1; 5: Zhonggan 18; 6: Zhonggan 11;
7: Zhonggan 19; 8: 8312; 9: Q iulü55; 10: Chaoji Xiayang; 11: Xinxiang Xiaobao 23; 12: Duokang 75;
13: Zaoshu 5; 14: Gaokangwang; 15: Q iangfeng Sp ring Chinese cabbage.
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3　讨论
本研究选用 91对 SSR引物检测结球甘蓝与大白菜间的多态性 , 结果显示 2715% ( 25对 ) 引物
在结球甘蓝和大白菜种间表现多态性 , 分析多态性比率偏低的原因是大白菜 A基因组与结球甘蓝 C
基因组具有较强同源性所致。McGrath和 Quiros ( 1990) 通过芸薹和甘蓝的分子连锁图谱比较研究 ,
发现被保留的连锁重排的许多区域 , 也发现两者在碱基序列和基因拷贝数上存在很高的相似性。Song
和 O sborn (1992) 通过芸薹和甘蓝线粒体和叶绿体 RFLP图谱比较发现 , 两者的酶切图谱变化很小 ,
说明芸薹和甘蓝间具有较强的亲缘关系。
前人研究表明 , 甘蓝型油菜 ( Szewc2McFadden et al. , 1996; Uzunova & Ecke, 1999 ) 、水稻
(W u & Tanksley, 1993)、苹果 ( Guilford et al. , 1997)、大麦 ( Struss & Plieske, 1998) 基因组中含
有高频率的 GA重复序列 , 小麦中重复序列数量与等位基因数量存在较弱的相关关系 ( Plaschke et
al. , 1995) , 而大麦中存在很强的相关关系 ( Saghai et al. , 1994)。本研究发现 , 大白菜与结球甘蓝
基因组中含有高频率的 GA与 CT重复序列 , 重复序列数与等位基因数量不存在相关关系。 Szewc2
McFadden等 (1996) 与 Plieske和 Struss (2001) 在研究甘蓝型油菜时也发现有高频率的 GA重复 , 且
重复数量与等位基因数量不存在相关关系。
本研究建立了甘蓝连锁群相对于大白菜特异的 SSR引物 , 不仅可用于大白菜与结球甘蓝杂交种
的鉴定 , 还可以用于异附加系等的鉴定 , 并能够确定附加的外源连锁群。许多学者在芸薹 —芥蓝
(Chen et al. , 1992) , 甘蓝型油菜 —黑芥 (Quiros et al. , 1991) , 芸薹 —甘蓝 (Quiros et al. , 1987;
M itchell et al. , 1990) 单体异附加系鉴定研究上借助酶、RFLP、RAPD技术 , 筛选单体异附加系的特
异标记 , 但这种标记是种间范围内的 , 不能作为某连锁群或染色体的特异标记 , 使得鉴定的异附加系
在各实验室之间交流性差。利用本研究中建立的甘蓝连锁群相对于大白菜的特异 SSR标记鉴定大白
菜 %结球甘蓝异附加系 , 能够确定附加的外源染色体的连锁群 , 增强了异附加系在不同实验室间的相
互交流性 , 且可结合对附加染色体的鉴定 , 最终建立甘蓝连锁群与染色体的对应关系。结球甘蓝相对
于大白菜特异 SSR引物的建立 , 也为异代换系和易位系的鉴定奠定了基础。
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