全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (8) : 1227 - 1232
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 04 - 15; 修回日期 : 2009 - 06 - 26
基金项目 : 国家留学基金委资助项目 ; 国家科技支撑计划项目 (2006BAD01A723205) ; 国家公益性行业 (农业 ) 科研专项 ( ny2
hyzx072007) ; 辽宁省自然科学基金项目 (20082129)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: haitao57@ sohu1com; qingdaozou@hotmail1com)
致谢 : 感谢亚蔬中心王添成博士惠赠试材 , 中国农业科学院蔬菜花卉研究所冯兰香研究员指导接种技术。
番茄抗晚疫病基因 Ph23的 RAPD标记
邱夷鹏 1, 2 , 李海涛 23 , 张子君 2 , 邹庆道 23
(1 沈阳农业大学园艺学院 , 沈阳 110161; 2 辽宁省农业科学院蔬菜研究所 , 沈阳 110161)
摘 　要 : 以番茄抗晚疫病材料 CLN2037和感病材料 T2203杂交的 F2分离群体的 147个单株为试材 , 通
过抗病性鉴定 , 选择高抗单株和高感单株分别建抗、感病池。采用 BSA法筛选了 230条 RAPD引物 , 其中
引物 CCPB272203 (序列为 GGTCGATCTG) 在抗、感病池扩增出多态性片段 CCPB272203740 , 通过 F2单株验
证后证明 CCPB272203740与抗晚疫病基因 Ph23紧密连锁 , 遗传距离为 518 cM。
关键词 : 番茄 ; 晚疫病 ; RAPD标记 ; Ph23基因
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0821227206
RAPD M arker of the Resistan t Gene Ph23 for Toma to La te Blight
Q IU Yi2peng1, 2 , L I Hai2tao23 , ZHANG Zi2jun2 , and ZOU Q ing2dao23
(1 Horticulture College, Shenyang A gricu ltura l U niversity, Shenyang 110161, Ch ina; 2 V egetable Research Institu te, L iaon ing
A cadem y of A gricultural Sciences, Shenyang 110161, China)
Abstract: The objective of this study was to identify RAPD marker for resistance to late blight in tomato.
BSA (Bulked Segregant Analysis) was used to search for RAPD markers linked to late blight resistant gene
Ph23, using F2 segregating population (147 individuals) derived from a cross of CLN2037 ( resistant) and
T2203 ( suscep tible ). Two hundred and thirty decamer p rimers with arbitrary sequences are chosen for
polymerase chain reaction amp lication. One RAPD marker CCPB272203740 ( the sequence of the p rimer is
GGTCGATCTG) was tightly linked to the resistant gene Ph23 and it was 518 cM from the resistant gene.
Key words: tomato; late blight; RAPD marker; gene Ph23
番茄晚疫病是由致病疫霉菌 [ Phy toph thora infestans (Mont. ) de Bary ] 侵染所致 , 是露地和设施
番茄的重要病害之一 , 病菌可侵染植株的果实、叶、茎等部位 , 造成产量损失 , 发病严重时可导致绝
收。目前 , 由于生产上缺乏抗病品种 , 对晚疫病的防治主要采用药剂防治及生态防治的方法 , 存在防
治效果不理想、农药污染等问题 , 选育抗病品种是防治该病害经济有效的措施。
番茄的抗晚疫病性状由两类不同的基因控制 : 一类是单显性基因 Ph控制 , Ph21为完全显性基
因 , Ph22和 Ph23为不完全显性基因 ; 另一类是多基因控制 , 属于数量遗传 ( Thurston, 1971; Ne2
sm ith, 1998; Rebecca & Garbner, 2001)。设在台湾的亚蔬中心利用感病品种 Moneymaker作为第一回
交亲本与抗病品种 L3708杂交、回交得到 BC1 F1 , BC1 F1再与第二回交亲本 CLN657杂交、回交得到
BC3 F1 , 然后经过 6代自交 , 选育出了抗晚疫病自交系 CLN2037, CLN2037含有番茄抗晚疫病基因
Ph23 , 表现为不完全显性 (W ang, 2003)。
本研究主要以抗病材料 CLN2037为试材 , 利用 M ichelmore等 ( 1991) 提出的混合分组分析法
(Bulked segregant analysis, BSA ) , 寻找与番茄抗晚疫病基因 Ph23紧密连锁的 RAPD标记 , 为抗晚疫
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病分子标记辅助选择育种 (MAS) 奠定良好的基础。
1　材料与方法
试材为设在台湾亚蔬中心提供的抗病试材 CLN2037, 感病品种为辽宁省农业科学院蔬菜研究所提
供的 T2203及其建立的 F1、F2群体。2008年春季在辽宁省农业科学院蔬菜研究所基地种植亲本、F1
代和部分 F2代植株。
病原菌由辽宁省农业科学院蔬菜研究所提供。RAPD随机引物、 dNTP、 TaqDNA聚合酶均购自
TaKaRa公司。
抗病鉴定及病害分级标准参照 W ang (2003) 的方法。将纯化后的晚疫病病菌大量扩繁 , 当在 20
℃下培养两周左右产生大量孢子囊时 , 用无菌水洗成孢子囊悬浮液 , 接种孢子囊浓度为 5 ×104个 ·
mL - 1。
接种幼苗要长势一致并健壮 , 7～10片叶为适宜接种时期 , 采用喷雾法接种。接种后 24 h内 , 保
持室温 20 ℃左右 , 黑暗并且相对湿度 100% , 24 h以后保持室温 20 ℃, 相对湿度 75% ～95% , 每天
光照 14 h。
接种后第 7天调查单株叶面积的被害率。单株发病程度共分 7级 , 发病程度在 0～3级之间的单
株为抗病单株 , 在 4～6级的单株为感病单株。根据接种结果确定 F2分离单株的抗病性 , 然后选用最
抗病的单株和最感病的单株为试材 , 寻找与 Ph23基因紧密连锁的 RAPD标记。抗、感亲本及 F1群体
的发病程度按群体分级标准调查 (田苗英 等 , 2000; 张子君 等 , 2007)。
单株病害分级标准如下 :
0级 : 无病症 ;
1级 : 病斑细小 , 叶面积被害率 ≤5% ;
2级 : 限制性病斑 , 5% <叶面积被害率 ≤15% ;
3级 : 叶部有病斑 , 茎部无病斑 , 15% <叶面积被害率 ≤30% ;
4级 : 茎部病斑少量 , 30% <叶面积被害率 ≤60% ;
5级 : 茎部有较大病斑 , 茎部病斑扩展型 , 60% <叶面积被害率 ≤90% ;
6级 : 茎部严重受害 , 叶面积被害率 > 90% , 甚至植株死亡。
番茄晚疫病群体分级方法如下 :
调查每株的发病级数 , 按如下公式计算出群体 (品种 ) 的病级指数。将群体 (品种 ) 划分成免
疫、抗病和感病 3个不同的反应类型 ———免疫 ( I) : 病级指数 = 0; 抗病 (R ) : 0 <病级指数 ≤410;
感病 ( S) : 410 <病级指数 ≤610。
病级指数 = ∑ (发病株数 ×相应发病级数 ) /调查总株数。
DNA提取及检测采用改良的 CTAB法。取新鲜幼嫩番茄叶片 015 g, 在液氮中研磨成粉末状 , 移
入 115 mL离心管中 , 加入 500μL CTAB提取液 (2% CTAB; 100 mmol·L - 1 Tris2HCl, pH 810; 20
mmol·L - 1 EDTA , pH 810; 114 mol·L - 1 NaCl; 使用前加入 1%β - 巯基乙醇 ) , 65 ℃水浴 60 m in,
期间颠倒几次 , 加入等体积的氯仿 ∶异戊醇 (24 ∶1) 抽提两次。加入 2倍体积冰的无水丙醇 , - 20
℃放置 30 m in, 离心 , 弃上清液 , 用 80%冷的乙醇清洗沉淀两次 , 放置超净工作台吹干 30 m in。溶
于 40μL TE, 再加入 1μL RNase (10 ng·μL - 1 ) , 轻轻混匀后在 37 ℃水浴 1 h。 - 20 ℃保存备用。
从 F2代单株中选择 10株病害级别为 0的单株建抗病池 , 8株病害级别为 6的单株建感病池。
RAPD分析的 PCR反应体系为 : 在 25μL反应体系中包括 210μL dNTP, 210μL Mg2 + , 0125μL
Taq酶 , 5μL DNA (5 ng·μL - 1 ) , 215μL Primer ( 2 nmol·mL - 1 ) , 215μL 10 ×Buffer, 10175μL
水 , 上覆 10μL矿物油。PCR扩增程序为 : 94 ℃预变性 5 m in, 94 ℃变性 1 m in, 32 ℃复性 1 m in,
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72 ℃延伸 115 m in, 45个循环 , 72 ℃延伸 10 m in。扩增产物于 115%的琼脂糖凝胶中电泳检测 (孟凡
娟 等 , 2005; 高永利 等 , 2007)。
通过抗病鉴定与电泳检测结果的比较 , 利用 MAPMAKER310软件分析得出连锁距离。
‘
2　结果与分析
211　抗病鉴定结果
抗病亲本材料 CLN2037病级指数为 011, 表现高抗 , 感病亲本材料 T2203病级指数为 610, 表现
高感。F1材料的病级指数为 211, 表现高抗。 F2代单株 220株 , 抗病单株为 154株 , 感病单株为 66
株。经适合性检验 , X2C = 2139 < X20105 = 3184, 抗病与感病植株分离符合 3 ∶1的比例。
212　D NA提取及多态性引物的筛选
提取得到的 DNA经凝胶电泳检测 , 带型整齐一致 , 无降解现象 , 大多数浓度在 20～100 ng·
μL - 1 , 表明可以满足 RAPD反应的需要。
利用父、母本 , 抗、感病池对 230条 RAPD随机引物进行筛选 , 结果发现 , 有 206条引物能在
父、母本中扩增出清晰的谱带 , 引物有效率达到 89156% , 有 19条引物在父、母本中有多态性 , 而
用 F2代抗、感病池检验只有 2条引物在抗、感池间表现出多态性 , 其中只有 1条引物 CCPB272203
(序列为 GGTCGATCTG) 在抗病池中扩增出清晰谱带 , 而不出现在感病池中 , 经过多次重复后能稳定
出现。引物 CCPB272203在抗病亲本、感病亲本、抗池、感池以及在部分抗感单株中扩增出的 740 bp
的谱带见图 1和图 2。
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213　番茄抗晚疫病基因与 RAPD标记的连锁分析
为了确定特异片段与抗病基因之间的遗传距离 , 用引物 CCPB272203对 F2代分离群体的单株进行
扩增 , 以此来分析 CCPB272203740的分布。为提高试验的准确性 , 减少误差 , 从 F2分离群体的 220个
单株中 , 选出 147个单株进行检测 , 其中高抗单株 98株 , 高感单株 49株。
结果发现 , 在 98株抗病株中 , 有 95株有特异带 , 3株无特异带 , 在 49株感病株中 , 有 44株无
特异带 , 5株有特异带。
147个分离单株有带 100株 , 无带 47株 , PCR结果不符合 3 ∶1的理论分离比例 , 这是因为进行
检测的 147个单株是从 F2群体中选出的 98株高抗单株和 49株高感单株 , 而不是对所有的 220个单株
进行检测。
共有 8株发生了重组 , 其中 5株感病植株有特异带 , 3株抗病植株无特异带 , 重组个体占总个体
的比例即重组率为 5144%。
把抗病鉴定结果与 PCR电泳检测结果相比较 , 经过 MAPMAKER310软件分析得出 , RAPD标记
CCPB272203740与抗晚疫病基因紧密连锁 , 其交换值为 5144% , 遗传距离为 518 cM。
引物 CCPB272203在亲本 , 抗感池及部分 F2单株中的扩增图谱带见图 3。
图 3　引物 CCPB272203在亲本、抗、感病池及 F2单株中扩增谱带
M: Marker (DL2000) ; 1: 抗病亲本 ; 2: 感病亲本 ; 3: 抗病池 ; 4: 感病池 ;
5 - 10: 抗病单株 ; 11 - 16: 感病单株。
F ig. 3　PCR am plif ica tion w ith pr im er CCPB272203 in paren ts, resistan t
and susceptible bulks and F2 popula tion s
M: Marker (DL2000) ; 1: Resistant parent; 2: Suscep tible parent; 3: Resistant bulk;
4: Suscep tible bulk; 5 - 10: Resistant individual;
11 - 16: Suscep tible individual.
3　讨论
有关晚疫病抗病基因的标记研究 , 国外的资料并不多 , 国内涉及这方面的研究也较少。李君明
(2005) 以 LA1777的 93个渐渗系为材料 , 鉴定出 : 位于番茄染色体 1, 与 TG301连锁 , 抗小种 T1,
2的 LB12R3位点 ; 位于染色体 9, 介于 TG2542CT74, 抗小种 T1, 2的位点 LB12R2; 位于染色体 11,
均介于 TG5572CT102, 抗小种 T1和 T1, 2的位点 LB1R1与 LB12R2; 同时还鉴定出分别位于染色体
2、3、4、5、8, 对 T1小种感病的 6个位点 ; 分别位于染色体 4、8, 对 T1, 2小种感病的 3个位点 ;
分别位于 12条染色体上对 T1, 2, 4感病的 22个位点。Moreau等 (1998) 以 Haeaii7996与 W va700杂
交的 F2代为群体 , 把晚疫病抗病基因定位在标记 CP105和 TG233之间 , 位于第 10条染色体的长臂
上 , 并且找到了与 Ph22 紧密连锁的 AFLP标记 , 还构建了 Ph22 区域的遗传图谱。Chunwongse等
(2002) 利用番茄感病品种 CLN657和番茄抗病品种 L3708杂交的 F2群体找到了与 Ph21和 Ph22不同
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的抗病基因 , 即 Ph23基因 , 并对基因 Ph23进行了标记 , 找到了一个 RFLP标记 TG591和两个 AFLP
标记。上述标记均为 AFLP标记或 RFLP标记 , 操作繁琐 , 不适于用作标记辅助育种。
RAPD分子标记技术操作简便 , 检测的结果不受环境条件的影响 , 不仅被用于番茄杂种纯度的检
测 (栾雨时 等 , 1998; 朱海山 等 , 2003) , 还被应用于茄子 , 白菜等植物抗病分子标记的研究 (朱
华武 等 , 2005; 冷月强 等 , 2007)。本研究首次对 Ph23基因进行了 RAPD标记研究 , 找到了一个与
Ph23基因遗传距离为 518 cM的标记 CCPB272203740 , 为分子育种奠定了良好的基础。但是 RAPD标记
存在一定的不稳定性 , 还有待于将其转化为更稳定的 SCAR标记或 CAPs, 以应用于抗病材料的筛选
和鉴定。
本试验的目的是为了寻找与 Ph23基因紧密连锁的 RAPD标记 , 对 F2群体的单株选择有一定的改
进。本试验中共对 220株 F2单株进行了抗病鉴定 , 由于试验误差或环境条件的影响 , 有些单株的抗
病性介于抗、感之间 , 给最后的统计分析带来一定的难度。为了提高准确性 , 本试验中从 F2代单株
中选择高抗单株与高感单株 147株进行检测 , 然后进行遗传距离分析 , 这样更能保证试验的准确性。
但是 , 本试验缺少 F1代和 F2代抗、感中间类型植株带型的研究 , 有待于在今后的研究中进一步加以
验证。
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