全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (4) : 513 - 520
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 22; 修回日期 : 2009 - 03 - 19
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2007AA10Z100) ; 河南农业大学博士启动基金项目 (30400247)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: L ijw555@ sohu1com)
甜瓜 EST2SSR位点信息及标记开发
胡建斌 , 李建吾 3
(河南农业大学园艺学院 , 郑州 450002)
摘 　要 : 对 GenBank中 35 547条甜瓜 EST进行净化处理 , 得到总长度为 215 ×107 bp的无冗余 EST
34 408条。从这些序列中发现 2 877个 SSR, 分布于 2 119条 EST中 , 出现频率为 8136% , 分布密度为
1 /8172 kb。单碱基、二碱基和三碱基重复是主导重复类型 , 分别占 EST2SSR总数的 16161%、22149%和
46109%。A /T、AG/CT和 AAG/CTT分别是单碱基、二碱基和三碱基的优势重复基元 , 分别占 15188%、
16102%和 28161%。在所有的 EST2SSR中 , 69110%的重复次数为 4～10次 , 51134%的长度为 12～20 bp。
设计了 30对 EST2SSR引物 , 分别对 33份甜瓜自交系进行了 PCR扩增 , 24对引物能够扩增出期望长度的条
带 , 22对引物产物表现多态性 , 平均每对引物能检测到 2173个等位基因。这些引物能比较准确地将甜瓜
材料聚为不同类别。24对引物中 , 有 19对、16对和 15对分别在黄瓜、西瓜和葫芦中通用。以上结果说
明 , 从甜瓜 EST中开发 SSR标记是一条简便、可行的途径。
关键词 : 甜瓜 ; EST2SSR; 信息 ; 标记
中图分类号 : S 652　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0420513208
Informa tion on EST2SSR L oc i in M elon ( C ucum is m elo L . ) and M arker
Explo ita tion
HU J ian2bin and L I J ian2wu3
(College of Horticulture, Henan A gricultural U niversity, Zhengzhou 450002, China)
Abstract: A total of 35 547 melon ESTs were downloaded from GenBank (http: ∥www1ncbi1nlm1nih1gov)
and cleaned resulting in p roduction of 34 408 non2redundant ESTs with a total length of 215 ×107 bp. From
these sequences, 2 877 SSR s were sought out, distributing in 2 119 ESTs. The frequency of the EST2SSR s
was 8136% and mean distance was 8172 kb in 34 408 ESTs. Mononucleotide, dinucleotide and trinucleotide
repeats were major types, respectively accounting for 16161% , 22149% and 46109%. A /T, AG/CT and
AAG/CTT were most frequent motifs in mononucleotide, dinucleotide and trinucleotide, accounting for
15188% , 16102% and 28161% , respectively. The frequency of the EST2SSR s with a repeat number of 4 -
10 was 69110% and 51134% of them had a length of 12 - 20 bp. Thirty p rimer pairswere designed for partial
EST2SSR s and used for PCR amp lification of 33 melon inbred lines. Among the p rimer pairs, 24 pairs gave
distinct bands with expected length and 22 pairs generated polymorphic bands with 2173 alleles per p rimer
pair. W ith the p rimers, melon materials could be exactly divided into different group s, which accorded with
the actual situation of the materials. Among the 24 p rimer pairs, 19 pairs could be transferable to cucumber
and 16 pairs to watermelon and 15 pairs to gourd. A ll these results indicated that exp loitation of SSR markers
from melon ESTs was convenient and p racticable.
Key words: melon; Cucum is m elo L. ; EST2SSR; information; marker
随着植物基因组学研究的不断深入和 cDNA大规模测序的展开 , 产生了数量庞大的 EST ( exp res2
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sion sequence tag, EST) (骆蒙和贾继增 , 2001) , 增强了基于 EST的 SSR ( simp le sequence repeat) 标
记开发能力 , 为 SSR标记的开发提供了一条经济、便捷的途径。EST2SSR标记除了具有多等位性、共
显性、高稳定性等特点外 , 还可以在近缘种甚至远缘种间通用 (Varshney et al. , 2005; Zhang et al. ,
2005) , 这不仅节约合成引物的成本 , 还使物种间比较谱图的绘制和图谱的整合更为便捷。目前 , 在
小麦、水稻、油菜、棉花等许多作物中 , 大量的 EST2SSR标记已被成功开发 , 并广泛用于遗传图谱
的构建、基因发掘、品种鉴定、遗传进化及比较基因组等研究 (李永强 等 , 2004; 张波 等 , 2008)。
甜瓜属葫芦科 (Cucurbitaceae) 黄瓜属 (Cucum is) 甜瓜亚属 ( subgen. M elo) , 当前 , 甜瓜基因组
研究进展较快 , 现已构建了 12张遗传图谱 , 一部分控制重要经济性状和抗病性的基因 /QTL已定位在
图谱上 (苏芳 等 , 2007) , 现已发表的甜瓜遗传图谱主要由同工酶、RAPD、RFLP、AFLP以及少量
SSR标记构成 , 与小麦、水稻、棉花等农作物的图谱相比 , 甜瓜图谱所包含的 SSR标记较少。如 Za2
lapa等 (2007) 最近发表的一张覆盖 1 116 cM遗传距离的甜瓜遗传图谱只包含了 43个 SSR标记。
作为国际葫芦科基因组计划的重要组成部分 , 甜瓜基因组计划已全面展开 , 目前已测序 3万多条
EST, 已公布于国际葫芦科基因组计划网站 ( http: ∥www1 icugi1org) , 同时也已提交给 GenBank数据
库。但是 , 甜瓜 EST2SSR s标记数量十分有限。作者从 GenBank公布的甜瓜 EST中查找 SSR, 分析这
些 EST2SSR在甜瓜转录组中特点和分布规律 , 并对其多态性和通用性进行评价 , 旨在为甜瓜及其近
缘种的遗传图谱构建、重要经济性状的分子标记和基因克隆等遗传研究提供实用、高效的研究工具。
1　材料与方法
111　材料
33份甜瓜自交系 ( 18份厚皮甜瓜、14份薄
皮甜瓜和 1份野生种 ) 由国家西瓜甜瓜种质中期
库提供 (中国农业科学院郑州果树研究所 ) (表
1) , 用于对所设计的引物进行筛选和可用性评
价。此外 , 黄瓜、西瓜和葫芦 (分别包含 8份、6
份和 3份自交系 ) (由本课题组收集保存 ) 共 17
份材料用于引物通用性研究。
112　甜瓜 EST获得及 EST2SSR的发掘
2008年 5月 20日从 GenBank /dbEST (http: ∥
www1ncbi1nlm1nih1gov/entrez) 以 FASTA格式下载
35 547条 EST序列 , 它们主要来自甜瓜果实、叶片
和根等组织。采用 EST2trimmer ( http: ∥pgrc1 ipk2
gatersleben1de /m isa /download /est _ trimmer1p l ) 和
cross2match ( http: ∥www1phrap1org) 等网络软件
除去重复、p loyA /T“尾巴 ”和载体等赝象序列。
利用 M ISA ( http: ∥pgrc1 ipk2gatersleben1de /m isa /
m isa1htm l) 对无冗余 EST进行 SSR搜寻 , 并结合
手工查寻。搜索条件为 : 含有单核苷酸、二核苷酸
表 1　甜瓜材料及其来源
Table 1　M elon accession s and the ir or ig in s
编号
Code
类型
Ecotype
来源
O rigin
编号
Code
类型
Ecotype
来源
O rigin
ch001 CH 美国 USA ch018 CH 中国 China
ch002 CH 前苏联 cb003 CB 日本 Japan
Soviet Union
ch003 CH 中国 China cb004 CB 中国 China
ch004 CH 美国 USA cb005 CB 日本 Japan
ch005 CH 中国 China cb006 CB 中国 China
ch006 CH 美国 USA cb007 CB 中国 China
ch007 CH 美国 USA cb008 CB 中国 China
ch008 CH 美国 USA cb009 CB 日本 Japan
ch009 CH 中国 China cb010 CB 中国 China
ch010 CH 前苏联 cb011 CB 加拿大
Soviet Union Canada
ch011 CH 中国 China cb012 CB 美国 USA
ch012 CH 美国 USA cb013 CB 中国 China
ch013 CH 中国 China cb014 CB 日本 Japan
ch014 CH 美国 USA cb015 CB 中国 China
ch015 CH 中国 China cb016 CB 美国 USA
ch016 CH 中国 China c024 野生种 中国 China
ch017 CH 中国 China W ild relative
species
　　注 : CH: 厚皮甜瓜 ; CB: 薄皮甜瓜。
Note: CH: Thick2peel melon; CB: Thin2peel melon.
和三核苷酸基元的最小重复数分别为 20、6和 5, 四核苷酸或四核苷酸以上的 SSR最小重复数均为 4。
113　EST2SSR的引物设计
利用 Primer 310 ( http: ∥ frodo1wi1m it1edu /cgi2bin /p rimer3 /p rimer3 _www1cgi) 对包含有 SSR 的
EST设计引物 , SSR序列的开始和结束位置分别距 5′和 3′端应不少于 20 bp。引物设计的主要参数为 :
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　4期 胡建斌等 : 甜瓜 EST2SSR位点信息及标记开发 　
引物长 18～24 bp, 最适 20 bp; 引物退火温度 Tm值 50～65 ℃, 上游和下游引物的 Tm值不大于 5 ℃;
GC含量 40% ～70% , 最适 50% ; PCR预期产物长 100～350 bp; 尽量避免引物二级结构的出现。
114　D NA提取
采用 CTAB法 (Doyle & Doyle, 1990) 提取所有材料的基因组 DNA。
115　PCR扩增、电泳及和聚类分析
PCR反应体系 20 μL, 其中包括 : 1 ×buffer, 30 ng DNA 模板 , 210 mmol·L - 1 MgCl2 , 200
μmol·L - 1 dNTPs, 015μmol·L - 1引物 , 1 U Taq酶。扩增反应在 B iotech公司的 T1型 PCR扩增仪上
进行。反应程序为 : 94 ℃预变性 5 m in; 94 ℃变性 1 m in, 50～65 ℃复性 45 s, 72 ℃延伸 1 m in, 35
个循环 ; 72 ℃延伸 5 m in。扩增产物用含有 50μg·mL - 1溴化乙锭的 210%琼脂糖胶凝胶电泳。利用
NTSYSpc 2110对电泳数据进行分析 , 用 UPGMA对 33份甜瓜自交系进行聚类作图。
2　结果与分析
211　甜瓜 EST2SSR的频率和分布密度
从 NCB I网站下载的 35 547条 EST主要来源于甜瓜的根 ( 13 853条 )、果实 (10 079条 )、子叶
(5 664条 )、叶片 (3 012条 ) 和韧皮部 (1 800条 ) , 另外还有少量来自悬浮细胞和愈伤组织。经过
净化处理后共获得 34 408条无冗余 EST, 序列总长度为 215 ×107 bp。按照查找标准 , 共发现 2 119条
至少含有 1个 SSR的 EST序列 , 占无冗余 EST总数的 6116% , 表明甜瓜 EST2SSR含量丰富。这些
EST中有 1 503条含有一个 SSR, 剩余 616条 EST含有 2个或 2个以上的 SSR, 其中 73条序列出现两
个 SSR串联。共检出 2 877个精确重复的 SSR, 占无冗余 EST的 8136% , 即甜瓜基因组中 EST2SSR的
频率。
　　甜瓜 EST2SSR的优势重复单元为单核苷酸、
二核苷酸和三核苷酸 , 三者共占 EST2SSR总数的
85119% , 其中又以三碱基重复所占的比例最大
(46109% ) , 二碱基重复 ( 22149% ) 和单碱基重
复 (16161% ) 次之。基元长度大于或等于 4的重
复所占的比例较小 , 共计 14181%。从 SSR的分
布密度来看 , 甜瓜 EST中平均每 8172 kb就出现 1
个 SSR。不同重复类型的平均距离不一致 , EST2
SSR的出现频率越高 , 其平均距离越小 (表 2)。
此外 , 甜瓜不同组织中 SSR 的分布密度不尽相
同 , 韧皮部中 SSR密度最大 ( 1 /6103 kb) , 子叶
次之 (1 /8130 kb) , 果实中最少 (1 /10139 kb)。 表 2　甜瓜中 EST2SSR的数量、比例和平均距离Table 2　Num ber, percen tage and m ean d istance ofEST2SSRs in m elon重复类型Repeat types 数量Number所占比例 /%Percentage 出现频率 /%Frequency 平均距离 / kbMean distanceMononucleotide 478 16161 1139 52147D inucleotide 647 22149 1188 38176Trinucleotide 1 326 46109 3185 18191Tetranucleotide 115 　4100 0133 218109Pentanucleotide 180 　6126 0152 139133Hexanucleotide 131 　4155 0138 191145总计 Total 2 877 100100 8136 　8172　　注 : 出现频率 =检出的 SSR数 /无冗余 EST总数 ; 平均距离=无冗余 EST总长度 /SSR数量。Note: Frequency = Total SSR numbers sought out/Total numbers ofnon2redundant ESTs; Mean distance = Total length of non2redundant
ESTs/SSR numbers.
212　甜瓜 EST2SSR中基元类型及频率
在甜瓜 EST2SSR中共观察到 57种重复基元 , 一核苷酸至六核苷酸重复分别有 2、3、10、15、15
和 12种。从分布频率来看 , 在 2 877 个 EST2SSR 中出现最多的基元是 AAG/CTT ( 823 个 , 占
28161% ) , 其次是 AG/CT (461个 , 占 16102% ) 和 A /T (457个 , 占 15188% ) (表 3)。单碱基中
A /T占绝对优势 , C /G极少 (18个 , 占 0156% ) ; 二碱基中 AG/CT频率最高 , AT次之 (114个 , 占
3196% ) , AC /GT较少 (71个 , 占 2147% ) , CG则没有出现 ; 三碱基中 AAG/CTT出现频率最高 , 除
CCG/CGG (15个 , 占 0152% ) 外 , 其他各类重复基元的频率均在 1% ～ 4%之间 ; 四核苷酸中出现
频率最高的是 AAAG/CTTT (53个 , 占 1184% ) ; 五核苷酸中 AAAAG/CTTTT出现频率最高 (60个 ,
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占 2109% ) ; 六核苷酸中 AAAAAG/CTTTTT频率
为 0163% (18个 ) , 其他各类重复基元的频率均
在 015%以下。
213　甜瓜 EST2SSR重复次数和基元长度
基序重复次数的变异引起位点长度的变化是
产生 EST2SSR 多态性的主要原因。对 2 877 个
EST2SSR进行分析的结果表明 , 随着重复次数的
增加 , SSR数量迅速减少 (图 1)。甜瓜 EST2SSR
数量分布可分为 3个区间 : 即 4～10次重复为第
一区间 , 共有 1 988 个重复基元 , 占全部 EST2
SSR总数的 69110% ; 11～20次重复为第二区间 ,
包含 437个 SSR, 约占总数的 15119% , 主要是二
碱基和三碱基重复 ; 20次重复以上为第三区间 ,
有 452个 SSR, 主要是单碱基和三碱基重复 , 占
15171%。
甜瓜 EST2SSR基序长度分布情况见图 2。由
于搜索标准严格 , 部分 SSR被过滤掉 (特别是基
序长度较短的单核苷酸 ) ,因此 EST2SSR基序长 表 3　甜瓜 EST中主要重复基元及其比例Table 3　The ma jor m otifs and the ir percen tages in m elon ESTs重复类型Type of repeat 重复基元Motifs 数量Number 比例 /%PercentageMononucleotide A /T 457 15188D inucleotide AG/CT 461 16102AT/AT 114 3196AC /GT 71 2147Trinucleotide AAG/CTT 823 28161AGG/CCT 108 3175AAC /GTT 100 3148AGC /CGT 69 2140AGT/ATC 53 1184ACC /GGT 42 1146AAT/ATT 39 1136ACT/ATG 38 1132ACG/CTG 37 1129Tetranucleotide AAAG/CTTTT 53 1184AAAT/ATTTT 36 1125Pentanucleotide AAAAG/CTTTT 60 2109Hexanucleotide AAAAAG/CTTTTT 18 0163　　注 : 比例小于 015%的基元未列出。Note: The repeat motifs with percentage less than 015% were notlisted here.
度分布是不连续的 , 如长度为 13、17和 19 bp的 SSR没有出现。大部分甜瓜 EST2SSR基序长度集中
在 12～20 bp范围内 (1 477个 SSR, 占 51134% ) , 其次是 21～30 bp (920个 SSR, 占 31198% ) , 30
bp以上的 SSR数量较少 (480个 SSR, 占 16168% )。
图 1　甜瓜 EST2SSR基序重复次数分布
F ig. 1　D istr ibution of repea t num ber of EST2SSRs in m elon 图 2　甜瓜 EST2SSR基序长度分布F ig. 2　D istr ibution of m otif length of EST2SSRs in m elon
214　甜瓜 EST2SSR引物的开发
利用 Primer 310软件对随机挑选的 100条含有 SSR的 EST序列进行引物设计 , 由于 SSR侧翼序
列过短 , GC含量偏高或偏低等原因 , 只获得 74对引物 , 从中随机选取 30对用于对 33份甜瓜自交系
进行 PCR扩增。结果发现 , 22对引物检测到多态性率为 7313% , 所检测到的多态性差异明显。每对
引物能检测到 2～4个等位基因 , 平均每对引物能检测到 2173个等位基因 , 扩增片段在 100～400 bp
之间 , 基本符合预期片段大小。图 3为引物 EM02在 33份甜瓜材料中的扩增带谱。
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　　此外 , 2对引物扩增出同一带谱 , 6对引物没有扩增产物。具有扩增产物的 EST2SSR引物的序
列、产物大小、退火温度和所检测到的等位基因数见表 4。
图 3　引物 EM 02在 33份甜瓜自交系中的扩增带谱
M: 分子标量 ; 1～16, 18: 厚皮甜瓜 ; 19～33: 薄皮甜瓜 ; 17、34: 野生种 (马泡 )。
F ig. 3　Band pa ttern genera ted by pr im er pa irs EM 02 in 33 m elon inbred lines
M: Marker (100 bp ladder) ; 1 - 16, 18: Thick2peel melon; 19 - 33: Thin2peel melon;
17, 34: W ild relative species (Mapao) .
表 4　在甜瓜中有扩增的 24对 EST2SSR引物
Table 4　Twen ty four EST2SSR pr im ers hav ing am plif ied fragm en ts in m elon
引物编号
Primer code
重复基元
Repeat motifs
左引物 (5′- 3′)
Forward p rimer (5′- 3′)
右引物 (5′- 3′)
Reverse p rimer (5′- 3′)
退火温度 /
℃ Tm
产物大小 / bp
Product size
等位基因数
Number of alleles
EM01 ( GAA) 20 TCTACAGCGAAGAAGCGGAA CACAAACCCATCGTGAACCA 60 219 4
EM02 ( TTC) 8 AGCCTGCTGGTATGGGTG TCGTCGTCTCGCTTCCTC 56 213 4
EM03 (AT) 15 AGGAGGTGGAGTAGCAAGG CATCAAGCAAAGGCAAATC 55 234 3
EM04 ( TA) 11 CTTCTTCCCTTCTTACTCAACT TGCAGCAGCTTCATCATTTA 53 127 3
EM05 ( GAA) 11 TTGAAGAGAGTTGGAGGAAAG TCGGGTGTCTATCAGGGAA 55 134 2
EM06 ( GGT) 9 TCCAGACACGGCACTCAAC CCTTGCTGGTCTCATCTACG 56 301 2
EM07 ( TCA) 9 TCTTCCAATCACCGCCTCT TCGCAAAAGGGTAGGATGA 56 152 3
EM08 ( GAA) 6 TTGGAGGAGACAAAGGATC TGCTTCAACCTCTTCTTCTGG 57 136 2
EM09 (CTC) 10 CCCCACCTCAATCCTTCA GCTCCAACGCCTCATAGA 55 285 4
EM10 ( TCTT) 6 GAAAGGAGAAAAGTGGAGGA GAAGAAATAAATGAAGGGGTA 52 229 2
EM11 (ATG) 14 GGCGATGTTTTCTTTCAGT CCTTTTGGAGTTTGTGGTT 53 134 4
EM12 ( GA) 11 AATCGAAATCCATCTCACTG GCTCTAAGCCACGACATCA 53 172 3
EM13 ( TA) 9 TGGGCATAAGATAAAGGAGGA AACCCAAACAAAGCCAAAAG 57 214 3
EM14 (CTT) 10 GGAGTGCCGATCAATGAGAT TCCAGTGCTCAAGCAGAATAA 55 275 2
EM15 ( TC) 10 CTACACCGGCGGACATTACT AGAAGTGGAGGGAGGTTTGG 57 180 2
EM16 ( TTC) 13 ATTGCTCAAATCCACCCTT TTAACTCTACCCTCGGCG 54 160 3
EM17 ( TA) 9 GATTTAGTGGATGGATTCCGATG GCAAATACGACCCGCATACATA 60 252 2
EM18 ( TTTC) 4 GTTGATAAGCATAAGAAGCA AATAATGAACAAGTGGGGT 50 150 2
EM19 (CTT) 8 TCCTCCCTCTATTTATCCGTAC TTGCGGATTAGGTCTTCCAG 56 168 1
EM20 (CT) 9 ACCCAACACGGGGAAACTTA ACGACGAAACAGGCAGAAAT 58 163 3
EM21 ( TTCT) 8 TCTAATCTCAGGAAAAGGTCA GGAAATAGGGTATGGTTGG 52 136 2
EM22 ( TTTC) 12 GACTGGAGGGCTTCCTGTGTAA GGGTTATTTGACTCCCTTTTGG 60 354 2
EM23 (AGG) 6 TCTTCGCTCTGTTCTTTCG TTCCTGATTCCGCCTTTA 54 264 1
EM24 (AC) 11 ATACGGCATTACTTAAAGAACC AGGAATTGTGGGATGGAGA 54 208 2
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215　甜瓜材料的聚类分析和 EST2SSR引物通用性
采用 UPGMA算法对 33份自交系的 PCR扩增
结果 (24对 EST2SSR引物的扩增带谱 ) 进行分析
聚类 , 获得聚类图 (图 4) , 以评价引物的可用
性。33份甜瓜材料在相似系数为 0159的水平上
可聚为两类 , 10 份厚皮甜瓜和 2 份薄皮甜瓜
( cb006和 cb013) 聚为一类 (Ⅰ类 ) , 剩余的 8份
厚皮甜瓜、12份薄皮甜瓜和 1份野生种 (马泡 )
聚为一类 (Ⅱ类 )。Ⅰ类中的薄皮甜瓜 cb006和
cb013具有厚皮甜瓜的血统 , 与厚皮甜瓜聚在一
起符合事实。马泡是在黄淮流域发现的野生甜瓜 ,
它与 ‘cb015’ (香瓜 ) 关系密切 , 说明它很可能
是中原地区香瓜的起源种。18份厚皮甜瓜分为不
同的两类 , 说明他们可能有不同的地理起源 , 符
合厚皮甜瓜的两个次级起源中心学说 (林德佩 ,
1989)。薄皮甜瓜主要聚在 Ⅱ类 , 说明薄皮甜瓜
种质的遗传背景比厚皮甜瓜种质狭窄。通过对不
同类型的甜瓜资源分析可知 , EST2SSR标记能较
为准确地将不同地理起源的种质分开 , 说明从甜
瓜 EST数据库中开发的 SSR标记具有很好的实用
性与可信度。
以具有扩增产物的 EST2SSR引物对其他 3种
葫芦科作物进行 PCR扩增 , 以研究引物在近缘种
中的通用性。不同引物的扩增结果见表 5。在所
检测的 24对引物中 , 有 9对引物在所有材料均有
扩增产物 , 占所有引物 3715%。在黄瓜中 , 具有
扩增产物的引物对数最多 , 达 19对 , 通用率为
图 4　基于 EST2SSR标记的 33份甜瓜自交系的聚类图
ch001～ch018: 厚皮甜瓜 ; cb001～cb014: 薄皮甜瓜 ;
c024: 近缘野生种。
F ig. 4　D endrogram of 33 m elon inbred lines ba sed on
EST2SSR markers
c h001 - ch018: Thick2peel melon; cb001 - cb014: Thin2peel melon;
c024: W ild relative species.
7912% , 多态性引物 13对 ; 在西瓜中可通用的引物有 16对 , 通用率为 6617% , 多态性引物有 9对 ;
葫芦中具有扩增产物的引物有 15对 , 通用率为 6215% , 多态性引物有 7对。仅有一对引物 ( EM24)
在 3种葫芦科植物中均没有扩增产物。由此可见 , 甜瓜 EST2SSR引物具有很好的种间通用性。
表 5　EST2SSR引物在黄瓜、西瓜和葫芦的通用性
Table 5　Tran sferab ility of EST2SSR pr im ers in cucum ber, wa term elon and gourd
编号
Code
黄瓜
Cucumber
西瓜
W atermelon
葫芦
Gourd
编号
Code
黄瓜
Cucumber
西瓜
W atermelon
葫芦
Gourd
编号
Code
黄瓜
Cucumber
西瓜
W atermelon
葫芦
Gourd
EM01 P (2) P (3) P (2) EM09 P (2) P (3) P (3) EM17 N NP (1) NP (1)
EM02 P (3) P (3) P (2) EM10 NP (1) P (2) N EM18 N P (2) N
EM03 P (2) P (2) NP (1) EM11 P (3) P (4) P (2) EM19 P (2) NP (1) N
EM04 P (3) P (2) P (2) EM12 P (2) NP (1) N EM20 NP (1) N NP (1)
EM05 NP (1) N NP (1) EM13 NP (1) N NP (1) EM21 P (2) P (2) NP (1)
EM06 NP (2) NP (1) N EM14 N P (3) NP (1) EM22 P (2) N N
EM07 P (3) NP (2) P (2) EM15 NP (2) N N EM23 N N P (2)
EM08 P (2) N N EM16 P (2) NP (1) NP (1) EM24 N N N
　　注 : N. 无扩增 ; P. 有多态性 ; NP. 有扩增但无多态性 ; 括号内数字为等位基因数。
Note: N means no amp lification; P means polymorphism; NP means amp lification with monomorphism. The number of alleleswas bracketed.
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　4期 胡建斌等 : 甜瓜 EST2SSR位点信息及标记开发 　
3　讨论
311　EST2SSR作为分子标记的优缺点
与基因组 SSR相比 , EST2SSR有以下优点 : (1) 是 “绝对 ”遗传标记。EST代表了基因表达信
息 , 如果一个 EST标记与一个有意义的遗传性状有关 , 则该 EST所代表的基因就有可能直接影响该
性状 ( Eujayl et al. , 2001; V igouroux et al. , 2002) , 使得对决定重要表型性状的基因进行直接鉴定成
为可能。 (2) 物种间通用。EST2SSR的侧翼序列高度保守 , 因而能在不同物种间通用 , EST2SSR遗传
作图将使物种之间连锁信息的转换更快 , 实现多个图谱整合 (Lan et al. , 2000; Varshney et al. ,
2005)。 (3) 成本低。省去了基因组 SSR引物开发中的构建文库等工作 , 充分利用已有的测序数据 ,
是一条近乎 “免费 ”的途径。由于 EST序列相对保守 , 因而与基因组 SSR相比 , EST2SSR标记多态
性相对较低。但因 EST数目巨大 , 所开发的 EST2SSR标记数目众多 , 在一定程度上可弥补其多态性
偏低的不足。
312　甜瓜 EST2SSR的分布特征与多态性潜能
目前 , GenBank中的甜瓜 EST数目已超过 35 000条 (至 2008年 5月 20日 ) , 但已报道的 EST2
SSR引物仅为 22对 ( Kong et al. , 2007) , 这与 EST数量极不相配 , 因而 EST2SSR标记还有很大的挖
掘潜力。明确甜瓜基因组中 EST2SSR的分布规律是开发新的 SSR标记的前提。
本研究发现 , 甜瓜 EST2SSR基元类型丰富 , 频率高 , 密度大 (平均距离 8172 kb) , 高于拟南芥
(1419 kb)、小麦 (1516 kb)、棉花 (2010 kb) 等作物 (李永强 等 , 2004) , 说明甜瓜 EST2SSR标记
开发潜力较大。甜瓜 EST中 , 三核苷酸出现频率最高 , 其中又以 AAG/CTT基元最多 , 这与柑橘
(J iang et al. , 2006)、棉花和拟南芥 (Cardle et al. , 2000) 相似 , 验证了 Gao等 (2003) 认为 AAG/
TTC是双子叶植物的优势重复基元的观点。甜瓜 EST中 AAG/TTC高频率使用可能与其编码相应蛋白
质时的使用频率较高有关。
SSR位点多态性主要是因基元重复数和基元碱基数不同所产生的序列长度多态性。一般认为 ,
SSR的变异频率与基元重复数存在一定的正相关 , 即重复数越多 SSR 发生变异的可能性越大
( SchlÊtterer, 2000)。而 Xu等 (2000) 认为重复序列长度存在一个阈值 , 长度在阈值以下的 SSR倾向
扩张 , 而长度在阈值以上的 SSR倾向收缩。甜瓜约有一半的 EST2SSR在 20 bp以内 , 这些位点因未达
到阈值长度而倾向于扩张 , 而位点长度在 30 bp以上、重复次数在 20以上的 EST2SSR约占 15% , 这
些位点倾向于收缩。因此 , 根据 Xu等 (2003) 观点 , 本研究中所发掘的甜瓜 EST2SSR位点大部分具
有多态性潜能。
313　甜瓜 EST2SSR标记可用性与通用性
在设计的 30对引物中 , 有效扩增率高达 80% , 多态性率为 7313% , 对甜瓜材料的聚类结果与实
际情况完全一致 , 充分说明从甜瓜 EST序列中开发 SSR标记是可行的且实用性好。从多态性角度考
虑 , 本研究所开发的 EST2SSR标记平均能检测到 2173个等位基因 , 低于 Danin2Poleg等 (2001) 开发
的基因组 SSR标记 (平均 315个等位基因数 ) 和 Kong等 (2007) 开发的 EST2SSR标记 (平均 219个
等位基因数 ) , 而高于 Chiba等 (2003) 开发的甜瓜基因组 SSR标记 (平均 215个等位基因数 ) , 这可
能与本试验采用的材料类型和数量不同有关。
SSR侧翼序列的保守程度决定着 EST2SSR的通用率。本研究中发现甜瓜 EST2SSR引物在 3种葫
芦科作物中具有较好的种间通用性 , 说明所选取的 EST2SSR侧翼序列的保守性较好 , 因而 , 也可用
于其他葫芦科作物的资源分类、辅助育种、遗传作图等研究。
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
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