全 文 :园 艺 学 报 2011,38(3):563–570 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期:2010–08–11;修回日期:2011–01–11
基金项目:农业部行业科技项目(200903020)
* 通信作者 Author for correspondence(E-mail:ymfang@cau.edu.cn)
唐菖蒲茉莉酸生物合成关键酶基因 LOX1 的克
隆及表达分析
连青龙,辛海波,张自由,钟雄辉,罗 弦,义鸣放*
(中国农业大学观赏园艺与园林系,北京 100193)
摘 要:以唐菖蒲(Gladiolus hybridus)品种‘Rose Supreme’的球茎为试材,通过 RT-PCR 和 RACE
技术克隆到了一个全长为 2 797 bp 的茉莉酸(Jasmonic acid,JA)生物合成关键酶 LOX 基因的 cDNA 序
列,命名为 GhLOX1,属于 9-LOX。该序列含有一个 2 541 bp 的开放阅读框(ORF),编码 846 个氨基酸,
推导的蛋白质分子量为 94.90 kD。RT-PCR 表达分析表明,该基因在唐菖蒲叶、花、根、匍匐茎、新球茎
和籽球上都表达,而在叶和匍匐茎中表达量最高,在花和籽球中表达量较低;离体条件下,经过 0、0.1、
0.5、1.0、2.0 mmol · L-1的不同浓度梯度的水杨酸(SA)处理后,其表达水平随着浓度的升高而降低,当
SA 浓度达到 2.0 mmol · L-1 时没有表达。
关键词:唐菖蒲;LOX;JA;克隆;表达
中图分类号:S 682.2 文献标识码:A 文章编号:0513-353X(2011)03-0563-08
Cloning and Expression Analysis of Lipoxygenase-1 Gene Encoding a Key
Enzyme of the Biosynthesis of Jasmonic Acid from Gladiolus hybridus
LIAN Qing-long,XIN Hai-bo,ZHANG Zi-you,ZHONG Xiong-hui,LUO Xian,and YI Ming-fang*
(Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture,China Agricultural University,Beijing 100193,
China)
Abstract:A full length cDNA named GhLOX1 belonging to 9-LOX was cloned in Gladiolus hybridus
‘Rose Supreme’corms by RT-PCR and RACE. The open reading frame encompassed 2 541 bp encoding
a polypeptide of 846 amino acids with calculated protein molecular mass of 94.90 kD. RT-PCR analysis
showed that GhLOX1 gene was expressed in leaf,flower,root,stolon,corm,cormel,and higher in the
leaf and stolon. In vitro,with the different concentration of salicylic acid(SA)0,0.1,0.5,1.0,2.0
mmol · L-1 treatment respectively,the expression level decreased as the concentration increased. LOX1
wasn’t expressed after treating 2.0 mmol · L-1 SA.
Key words:Gladiolus hybridus;lipoxygenase;jasmonic acid;cloning;expression
茉莉酸及其茉莉酸类化合物(JAs)是由脂氧合酶途径,经过 LOX 和 AOS 等一系列的酶促反
应形成的。LOX 作为茉莉酸类化合物(茉莉酸及其衍生物)生物合成途径中的关键酶,在 JAs 生物
合成途径中起着重要作用,故可通过调控 LOX 活性来控制 JAs 的生物合成,从而调节植物的许多
生理过程(Feussner et al.,2001)。
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JAs 对离体马铃薯、薯蓣、菊芋的块茎形成和甘薯的块根以及大蒜、洋葱的鳞茎形成具有显著
的促进效应,已经从这些材料的叶片中分离出 JA(甘立军 等,2001)。而 LOX 作为 JAs 生物合成
的关键酶,可能同样参与了植物地下变态器官的形成过程(Fujino et al.,1995;Feussner et al.,2001)。
LOX 在植物体中主要以 LOX1,LOX2 和 LOX3 等 3 种同工酶的类型存在,其中 LOX1 在块茎
和根中特异性表达(Royo et al.,1996;Kolomiets et al.,2001)。Kolomiets 等(2001)发现 LOX 的
转录与匍匐茎的形成以及块茎的发生、发展等密切相关。LOX 活性被抑制可能导致块茎体积变小、
形成受阻以及产量减少。POTLX-1 是马铃薯中具有块茎专一性表达的 LOX 基因,其编码产物具有
9-LOX 的活性,原位杂交也证实其主要在发育的块茎中表达,而转反义基因的马铃薯植株,其块茎
的体积和质量都明显下降,形状也发生了畸形的变化(Feussner et al.,2001)。
本课题组前期的研究发现,在离体条件下,经过 MJ 处理后唐菖蒲的结球率、球茎鲜样质量和
直径明显升高,促进了球茎的形成和膨大,并且显著提高了 JA 生物合成关键酶 LOX 的活性;而经
LOX 抑制剂水杨苷异羟肟酸(Salicylhydroxamic acid,SHAM)处理后,其结球时间明显推迟,结
球率、球茎鲜质量和直径等指标明显下调,并且 LOX1 活性和 MJ 含量也显著降低(何秀丽,2008a,
2008b;He et al.,2008)。作为唐菖蒲茉莉酸生物合成的关键酶——LOX 催化茉莉酸生物合成途径
中的反应底物亚油酸和亚麻酸,对茉莉酸及其化合物的合成起到了促进的作用。本研究中克隆了唐
菖蒲茉莉酸生物合成关键酶基因 LOX1 的全长 cDNA 序列,并对其表达状况进行了初步的分析,旨
在为该基因调控唐菖蒲茉莉酸及其化合物的生物合成,进而探讨 LOX1 在唐菖蒲球茎形成过程中的
生理功能提供依据,并为进一步深入研究 LOX1 基因的功能及其调控提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
唐菖蒲‘Rose Supreme’品种的种球购自辽宁省金城园艺试验场,周径为 10 ~ 12 cm,2009 年
4 月初种植在中国农业大学科学园。组培球茎是以 2008 年大田收获的籽球为外植体培养而成,收获
的籽球在 4 ℃冰箱中贮存。LOX1 基因的分离是以组培球茎为材料,RT-PCR 表达分析用的叶、根、
新球为组培苗,花为 2009 年 7 月中旬在大田中采得,匍匐茎和籽球为 2009 年 8 月中旬在大田中采得。
1.2 RNA 的提取及逆转录反应
唐菖蒲新球和籽球 RNA 的分离采用 MyLab 通用型 RNA 快速提取试剂盒;叶片、花和根采用
百泰克 RNAPure 高纯总 RNA 快速提取试剂盒;匍匐茎采用北京强欣博瑞生物技术有限公司生产的
EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒。DEPC 水溶解 RNA,用分光光度计测定 OD260 和 OD280 数值,
根据 OD260/OD280 值判断 RNA 的质量,用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性。
cDNA 反转录按照 Promega 的 M-MLV Reverse Transcriptase 说明书进行。LOX1 5′端 cDNA 合成
按照 TaKaRa 公司的 5′-Full RACE Kit 试剂盒说明书进行。
1.3 唐菖蒲 LOX1 保守片段的克隆
根据 GenBank 核酸数据库中报道的拟南芥(NM_104376.2)、烟草(X84040.1)、山茶
(EU195885.2)、马铃薯(X79107.1)、棉花(AF361893.4)等 LOX1 基因的 mRNA 序列,通过 DNAman
软件进行同源比对并设计保守区兼并引物,并根据已获得的片段序列设计特异引物,引物序列见表
1。片段 A1 由引物 PF1 和 PR1 扩增得到,反应程序为:94 ℃,4 min;94 ℃,45 s;50 ℃,45 s;
72 ℃,60 s;5 个循环;94 ℃,45 s;52 ℃,45 s;72 ℃,60 s;30 个循环;72 ℃,10 min。片
3 期 连青龙等:唐菖蒲茉莉酸生物合成关键酶基因 LOX1 的克隆及表达分析 565
段 A2 由引物 PF2 和 PR2 扩增得到,反应程序为:94 ℃,4 min;94 ℃,45 s;47 ℃,45 s;72 ℃,
90 s;5 个循环;94 ℃,45 s;50 ℃,45 s;72 ℃,90 s;30 个循环;72 ℃,10 min。片段 A3
由引物 PF3 和 PR3 扩增得到,反应程序为:94 ℃,4 min;94 ℃,45 s;50 ℃,45 s;72 ℃,60 s;
5 个循环;94 ℃,45 s;52 ℃,45 s;72 ℃,60 s ,30 个循环;72 ℃,10 min。片段 A4 由引物
PF3 和 PR4 扩增得到,反应程序为:94 ℃,4 min;94 ℃,45 s;47 ℃,45 s;72 ℃,90 s;5 个
循环;94 ℃,45 s;50 ℃,45 s;72 ℃,90 s;30 个循环;72℃,10 min。
表 1 逆转录和 PCR 引物
Table 1 Primers applied in the reverse transcription and PCR
引物
Primers
序列 Sequence 引物
Primers
序列 Sequence
PF1 GAACAGGCACAAAGCAACAA PR5 GCAACGGAAACTTGAGGAG
PF2 TGGGAYAGDGTHTATGACTATG PR6 ATTGATGGGAGGAGTCATGG
PF3 CATTCGTGATGCAACAAACC PR7 AGTAGGGAGTGCCTGTTCCATA
PF4 GCTTCGCCTACTGATCAAGG PR8 CGCGTCGACGACCAGGGCTTTAGTTTAGATGG
PF5 AGACCAATCCGGACAAAGTG AP1 CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC
PF6 TGCTTGGAAGACAGATGAAGAA AP2 CCAGTGAGCAGAGTGACG
PF7 AATCCCGGGGGTAAAATGGGAGAGGGAGATGT AP3 GAGGACTCGAGCTCAAGC
PR1 GTYTGCADYAADGGCCACCA actin For GCT ATT CTT CGT ATC GAC CTT G
PR2 TATTGGATTACCACGACGC actin Rev AAC ATT GTG CTC AGC GGT GG
PR3 TCHTCVACNGCHAYNCCTCT 5′RACE CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
PR4 GGTTTGTTGCATCACGAATG 5′RACE CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
1.4 唐菖蒲 LOX1 基因 3′端与 5′端的克隆
对于基因 3′端序列克隆,根据已克隆的唐菖蒲 LOX1 保守片段设计两条 3′ RACE 上游引物 PF4
和 PF5,以 AP1 为逆转录引物进行反转录,然后以反转录的 cDNA 为模板进行巢式 PCR 扩增。第 1
轮 PCR 反应引物用 PF4 和接头引物 AP2,94 ℃,4 min;94 ℃,45 s;52 ℃,45 s;72 ℃,70 s;
35 个循环 ;72 ℃,10 min。取第 1 轮产物 1 μL 进行第 1 轮反应,引物为 PF5 和接头引物 AP3。94
℃,4 min;94 ℃,45 s;52 ℃,45 s;72 ℃,1 min;35 个循环;72 ℃,10 min。
对于基因 5′ 序列信息的获取按照 TaKaRa 公司的 5′-Full RACE Kit 试剂盒说明书进行,采用
Random 9 mers 引物进行反转录,然后以反转录的 cDNA 为模板进行巢式 PCR 扩增。第 1 轮 PCR
反应引物用 5′RACE Outer primer 和特异引物 PR5,94 ℃,3 min;94 ℃,30 s;52 ℃,30 s;72 ℃,
70 s;35 个循环;72℃,10 min。取第 1 轮产物 1 μL 进行第 2 轮反应,引物为 5′ RACE Inner primer
和特异引物 PR6。94 ℃,3 min;94 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,70 s;35 个循环;72 ℃,10 min。
1.5 唐菖蒲 LOX1 基因全长的克隆及序列测定
应用 DNAman 对 LOX1 基因的 3′ 端和 5′ 端序列进行拼接,并在 NCBI 网站上预测其 ORF。根
据 ORF 两端序列设计特异引物 PF7 和 PR8 扩增该基因的编码区序列(CDs),并在上游引物 5′ 端
和下游引物 3′ 端分别设计 SmaⅠ和 SalⅠ限制性内切酶酶切位点。PCR 反应程序为:94 ℃,4 min;
94 ℃,45 s;55 ℃,45 s;72 ℃,3 min;35 个循环;72 ℃,10 min。将所有 PCR 产物凝胶电泳后
回收目的片段,与 PMD18-T 载体连接并转化 DH5α,重组质粒鉴定后送北京华大基因公司进行测序。
1.6 RT-PCR 的表达分析
采用半定量 RT-PCR 方法研究 LOX1 在叶、花、根、匍匐茎、新球茎和籽球不同组织器官的表
达模式,以及组培新球茎在 0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol · L-1 水杨酸(SA)溶液处理后的表达情况。
566 园 艺 学 报 38 卷
以 actin 基因作为内参,调整不同处理的模板用量,使模板用量尽可能一致。用基因特异引物 PF6
和 PR7,在固定模板量的情况下进行 PCR 反应,检测基因的相对表达量。actin 退火温度 55 ℃,25
个循环,LOX1 退火温度 55 ℃,30 个循环。每组处理重复 3 次,用凝胶成像软件量化图片中 PCR
产物,文中显示具有代表性的一组电泳图片。
2 结果与分析
2.1 唐菖蒲脂氧合酶 LOX1 基因全长 cDNA 序列的克隆
以唐菖蒲组培球茎提取 RNA 逆转录的 cDNA 为模板,相应的引物和程序进行保守区 PCR 扩增,
得到 4 个 LOX1 基因片段,其核苷酸序列大小分别为 827、704、773 和 1 011 bp(图 1,A1 ~ A4)。
利用两条 3′ RACE 上游引物 PF4 和 PF5 进行两轮 PCR 扩增,测序结果表明该 3′ RACE 产物为
541 bp(图 1,B)。结合保守区片段设计两条下游引物,采用 Random 9 mers 引物进行逆转录,PR5
和 PR6 分别进行 5′ 端第 1 轮和第 2 轮 PCR 扩增,经测序该 5′ 端核苷酸序列为 985 bp(图 1,C)。
使用 DNAman 把中间片段序列、3′端以及 5′端序列进行拼接,得到全长 2 797 bp 的全长 LOX1
基因序列,预测其 ORF,并设计上下游引物 PF7 和 PR8 PCR 扩增该基因的编码区序列,得到 LOX1
基因的 CDS 2 541 bp(图 1,D)。
图 1 PCR 产物检测
A1 ~ A4:中间片段产物;B:3′ RACE 产物;C:5′ RACE 产物;D:CDS 产物;M:DL2000(plus)marker。
Fig. 1 Agrose gel electrophoresis of PCR products
A1–A4,B,C and D show fragment,3′,5′ and CDS product respectively. M:DL2000(plus)marker.
2.2 唐菖蒲 LOX1 序列分析
对唐菖蒲 LOX1 基因的全长序列进行分析得知,该基因全长 2 797 bp,包含一个编码 846 个氨
基酸的开放阅读框 2 541 bp,3′ utr 和 5′ utr 分别为 70 bp 和 186 bp。将编码区核苷酸序列提交 NCBI
在线比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),将同源性较高和研究相对较多的项目序列下载,
3 期 连青龙等:唐菖蒲茉莉酸生物合成关键酶基因 LOX1 的克隆及表达分析 567
使用 DNAman 将唐菖蒲 LOX1 核酸序列与这些序列进行比对。结果表明唐菖蒲 LOX1 与山茶 LOX1
的同源性最高,达到 63.8%,其次为棉花和拟南芥,分别为 63.6%和 63.0%,与研究较多的烟草和马
铃薯分别为 62.3%和 60.1%。
从系统进化树(图 2)与氨基酸序列同源性比较图谱(图 3)可以看出,推定的唐菖蒲与山茶的
LOX1 同源性最高为 62.6%,其次为棉花和烟草,分别为 61.9%和 61.1%;而与拟南芥和马铃薯的分别
为 60.7%和 60.1%。推导的 LOX1 氨基酸序列中(图 3),‘I、II、III’区是 LOX 的重要特征区域(Siedow,
1991);‘+’是 3 个区域中完全保守的氨基酸;‘▼’是 5 个植物 LOX 高度保守的组氨酸(Steczko et al.,
1992);‘0’是结合铁离子所需的组氨酸;II 区中决定 9-LOX 属性的缬氨酸位于第 564 位。
经过 NCBI blast 比对发现,该基因序列与具有 9-LOX 活性的 LOX1 同源性较高。系统进化树分
析也表明,该基因与山茶、棉花、烟草、拟南芥和烟草的 LOX1 亲缘关系较近。结合核酸序列比对
结果,本试验中克隆到的基因序列确定为唐菖蒲 LOX1 基因序列,将其命名为 GhLOX1。利用
ExPASyD 分析唐菖蒲 GhLOX1 基因,推导的蛋白质分子量为 94.90 kD,等电点 4.87。
2.3 唐菖蒲 LOX1 在不同组织的 RT-PCR 表达分析
采用 RT-PCR 法,对唐菖蒲的叶、花、根、匍匐茎、新球茎、籽球进行相对定量表达分析。从图
4 可以看出,在内参 actin 扩增产物比较一致的情况下,LOX1 在叶、花、根、匍匐茎、新球茎、籽球
组织里都有表达,其中在匍匐茎和叶中的表达量最高,而在花和籽球中表达量较低。
2.4 唐菖蒲 LOX1 在不同水杨酸浓度处理下组培球茎的 RT-PCR 表达分析
从图 5 可以看出,在不同浓度的 SA 后,随着 SA 处理浓度的增加,LOX1 在唐菖蒲组培球茎的
表达量随之减少,在不经过 SA 处理的唐菖蒲组培球茎中 LOX1 的表达量最高,而经过浓度为 0.1
mmol · L-1 的 SA 处理后 LOX1 的表达量最低,当 SA 浓度达到 2.0 mmol · L-1 时 LOX1 基本不在球茎
中表达。
图 2 LOX1 与几种植物蛋白氨基酸同源序列的聚类分析
Fig. 2 Clustering of the deduced amino acid sequences of LOX1 with homologous
amino acid sequences among Gladiolus hybridus and other plants
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图 3 唐菖蒲与几种植物 LOX1 蛋白氨基酸序列同源性比较
A:唐菖蒲 LOX1;B:棉花 LOX1;C:拟南芥 LOX1;D:烟草 LOX1;E:马铃薯 LOX1。
Fig. 3 Homology comparison of amino acid sequences aligment of Gladiolus hybridus LOX1 with other plants
A:Gladiolus hybridus LOX1;B:Gossypium hirsutum LOX1;C:Arabidopsis thaliana LOX1;
D:Nicotiana attenuata LOX1;E:Solanum tuberosum LOX1.
3 期 连青龙等:唐菖蒲茉莉酸生物合成关键酶基因 LOX1 的克隆及表达分析 569
3 讨论
通过 GhLOX1 与 4 个植物物种的 LOX1 氨基酸序列同源比对分析,发现 GhLOX1 包含植物 LOX
的保守区域,并且在 GhLOX1 第 501 ~ 538 位置上氨基酸的区域发现了 5 个高度保守的组氨酸(图 3,
I)。另外还发现,在 GhLOX1 的 501,511 和 698 氨基酸的位置上具有结合铁离子所需的组氨酸(图
3,I、II)(Steczko et al.,1992),并且在 GhLOX1 的 C 末端氨基酸与其他植物 LOX 具有极高的相
似性(图 3,III)。黄瓜 LOX 多序列比对和互作结构模型表明,特定位置上的缬氨酸在酶与底物的
互作关系上起到了决定性的作用,这是 9-LOX 的显著特征(Hornung et al.,1999),在棉花的研究
上也得到了相同的结果(Philippe et al.,2007)。本研究通过唐菖蒲和棉花等其他植物的 LOX1 的比
对分析,发现在第 564 位的缬氨酸起到类似的作用,表明 GhLOX1 也属于 9-LOX。
已有研究显示 9-LOX 在植物器官发育和果实成熟进程中起作用(Porta & Rocha-Sosa,2002),
但是许多功能仍不明确;13-LOX 参与生物与非生物胁迫条件下的防御反应,并在醛类和醇类物质
合成中起作用(Feussner & Wasternack,2002;Porta & Rocha-Sosa,2002;Chehab et al.,2007)。9-LOX
和 13-LOX 在序列上有长度的差异,13-LOX 在 N 端含有额外约 60 个氨基酸残基,这些序列可能是
LOX 的信号肽区域(张波,2007),通过 LOX 家族氨基酸比对,结合在 NCBI blast 在线比对表明,
本研究中得到的 GhLOX1 具有 9-LOX 活性。系统进化树和氨基酸序列比对表明唐菖蒲与马铃薯和
拟南芥 LOX1 同源性较高(60.7%,60.1%),其编码的酶缺少一段叶绿体运输肽。在马铃薯的 3 个
LOX 基因家族成员中,PotLX1(StLOX1)是调控马铃薯块茎发育的关键基因(Kolomiets et al.,2001),
所以,GhLOX1 极有可能与唐菖蒲球茎的形成具有密切的关系,有待进一步研究与验证。
LOX 广泛存在于植物根、茎、叶、芽、花、子房、果实和种子等器官中,且具有不同的表达丰
度(Porta & Rocha-Sosa,2002)。唐菖蒲 LOX1 在叶、花、根、匍匐茎、新球、籽球组织里都有表
达,其中在匍匐茎和叶中的表达量最高,而在花和籽球中较低。马铃薯的 LOX1 在根、匍匐茎与块
茎中表达,其中在即将膨大的匍匐茎顶端高效表达(Feussner et al.,2001)。本研究的结果与马铃薯
的表达状况不太一致,这可能与 LOX1 表达的时空局限性有关。近年研究表明,LOX 具有多样的亚
细胞定位(Feussner & Wasternack,2002;Porta & Rocha-Sosa,2002),其存在部位的不同可能意味
着功能的差异。定位于脂球体上的 LOX 参与了大豆等种子的萌发(Feussner et al.,2001),而存在
于细胞质的 LOX 调控了马铃薯块茎发育和拟南芥侧根形成(Kolomiets et al.,2001;Vellosillo et al.,
2007)。本研究将进一步通过亚细胞定位的方法确定唐菖蒲 LOX1 具体存在于哪些细胞器中,以分析
唐菖蒲 LOX1 的基因功能。
以前的研究发现,SHAM 作为 LOX 的抑制剂,通过抑制 LOX 的活性而影响了 JA 生物合成及
其化合物的合成,并且抑制唐菖蒲球茎的形成。施加 MJ 得到了相反的结果(何秀丽,2008a,2008b;
He et al.,2008)。而 SA 作为途径信号干扰 JA 和乙烯信号在防御反应中的作用,表现在抑制 JA 和
乙烯的响应基因(Thomma et al.,2001;Kunkel & Brooks,2002)。本研究中发现,对组培唐菖蒲施
图 4 唐菖蒲 LOX1 在不同组织的表达
Fig. 4 Gladiolus hybridus LOX1 expression
in various tissues
图 5 唐菖蒲球茎在不同 SA 浓度处理下 LOX1 的表达
Fig. 5 LOX1 expression in the cormes of Gladiolus hybridus with
different concentration of SA
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以 SA 处理,随着 SA 浓度的增加,LOX1 在球茎的表达量减少,表明 SA 具有类似于 SHAM 的作用,
抑制了 JA 响应基因 LOX1 的表达,但关于 SA 对 JA 生物合成的影响以及对唐菖蒲球茎形成的作用
还有待于进一步研究。LOX 与其它物质,尤其是与植物地下变态器官形成的关联及其相关因子的关
系仍需要在更广的范围内进行研究。
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