全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（8）：1279–1286
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–05–13；修回日期：2010–07–19
基金项目：国家科技支撑计划项目（2007BAD79B04，2006BAD07B01，2009BADA4B04）
﹡ 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hechaoxing@126.com）
甜瓜抗旱性相关基因 MeP5CS 的克隆、序列分
析及表达
黄 志 1,2，邹志荣 1，黄焕焕 2，贺超兴 2,*，张志斌 2，王怀松 2，李建明 1
（1西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100；2中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：用 GenBank 登录的抗旱相关基因序列进行比对，在保守区域设计一对引物，利用 RT-PCR
获得了一个甜瓜抗旱相关基因，命名为 MeP5CS。生物信息学分析表明，该基因全长 1 000 bp，开放阅读
框（ORF）753 bp，编码 250个氨基酸；MeP5CS蛋白大小约 82.18 kD，理论 pI值为 4.90；MeP5CS编码
蛋白与桐花树、猕猴桃和葡萄同源性较高，分别为 94%、81%和 73%。该蛋白含约 40.2%的 α–螺旋，25.2%
的 β–转角，34.6%的不规则卷曲，在第 19 ~ 20氨基酸之间存在信号肽的剪切位点；MeP5CS编码蛋白是
疏水性蛋白，有 2个跨膜螺旋结构和 13 个磷酸化位点。半定量 RT-PCR表明，MeP5CS在甜瓜根系中表
达最高，茎中次之，叶片中表达较低。MeP5CS 基因在甜瓜组织中的表达受丛枝菌根真菌（AMF）和水
分胁迫双重诱导，与甜瓜的组织特异性和水分胁迫处理时间有关。水分胁迫条件下，接种 AMF可以显著
增加甜瓜幼苗脯氨酸的积累量，菌根甜瓜幼苗的脯氨酸积累与 MeP5CS基因的表达呈正相关。
关键词：甜瓜；MeP5CS；序列分析；表达；丛枝菌根真菌；水分胁迫
中图分类号：S 652 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）08-1279-08

Cloning，Analysis and Expression of a Drought-related Gene MeP5CS from
Melon
HUANG Zhi1,2，ZOU Zhi-rong1，HUANG Huan-huan2，HE Chao-xing2,*，ZHANG Zhi-bin2，WANG
Huai-song2，and LI Jian-ming1
（1College of Horticulture，Northwest A & F University，Yangling，Shaanxi 712100，China；2Institute of Vegetables and
Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：Using designed primers based on the conserved amino acid sequences of known
drought-related genes to amplify cDNA fragments from melon（Cucumis melo L.）by RT-PCR，a
drought-related gene named MeP5CS was obtained. Bioinformatics analysis indicated that the full-length
of cDNA sequence was 1 000 bp，which contained an open reading frame of 753 bp and encoded a protein
of 250 amino acid residues with a calculated molecular weight of 82.18 kD and isoelectric point of 4.90.
The MeP5CS protein showed 94%，81% and 73% similarity to the P5CS from Aegiceras corniculatum，
Actinidia deliciosa and Vitis vinifera. The protein include α-helix（40.2%），β-turn（25.2%），random coil
（34.6%）and a cleavage site between nineteen and twenty amino acid residues. The protein is a
hydrophobic protein and there is two transmembrane helix and thirteen phosphorylation sites. The result of

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RT-PCR analysis indicated that MeP5CS expression levels were different in roots，stems and leaves，and it
was the highest in roots and middle in stems，lower in leaves. The results showed that the AMF can induce
expression of MeP5CS gene in melon under water stress，and enhance the drought resistance of melon；
Expression differences in tissues were related to different tissues and the duration of water stress. Under
water deficit，AMF could increase Pro accumulation in melon leaves，gene expression and proline
accumulation were positively correlated.
Key words：melon；MeP5CS；sequence analysis；expression；AMF；water stress

干旱胁迫被认为是影响作物生长及产量的最重要的非生物因素之一（Kramer & Boyer，1995），
特别是在许多干旱和半干旱地区，水分亏缺严重影响了植物的正常生理代谢，由水分亏缺造成的植
物生长减少和作物减产超过了其他逆境影响的总和（Maggio et al.，2000）。丛枝菌根真菌（Arbuscular
Mycorrhizal Fungi，简称 AMF）是分布最广泛的一类内生真菌，能够改善宿主植物的水分代谢，增
强宿主的抗旱性（Muthukumar & Udaiyan，2002）。众多研究表明 AMF可以影响植物对干旱的响应，
通过调节植物体内渗透物质含量，改善植物的矿质营养，提高气孔导度和净光合速率方法来增加植
株的生物量，提高植物的抗旱性（Azcón et al.，1996；Auge，2001；贺忠群 等，2008）。在诸多调
节物质中分布最广的是脯氨酸（Proline，Pro）（Delauney & Verma，2002）。大多数研究表明，吡咯
啉–5–羧酸合成酶（P5CS）是渗透胁迫时植株体内合成脯氨酸（Pro）的关键酶（Szoke et al.，1992；
Verbruggen et al.，1993；Yoshiba et al.，2002）。
本试验中采用半定量 RT-PCR 法对甜瓜接种 AMF 后在水分胁迫下的甜瓜 P5CS 基因进行了克
隆，并对其序列进行生物信息学分析和诱导表达，为 AMF 增强甜瓜抗逆性的应用提供理论依据，
并为进一步研究该基因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试验设计
甜瓜材料为‘中蜜 3 号’，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育并提供。供试丛枝菌根真菌
（AMF）菌剂为匈牙利科学院土壤科学与农业化学研究所 Tunde Takacs 博士提供的摩西球囊霉菌
Glomus mosseae 2（GM）。
甜瓜于 2009年 10月 15日播种于育苗钵后在光照培养箱中培养，光照培养箱的光周期为 12 h，
光照强度约为 400 µmol · m-2 · s-1，昼温 30 ℃，夜温 22 ℃。试验采用 2 × 2设计，根据 Hsiao的方法
选择两个水分处理级别，一是水分适合（Well-watered，记为WW），即控制基质含水量在田间持水
量的 80% ~ 90%，作为对照；二是水分亏缺（Water deficit，记为WD），即控制基质含水量在田间
持水量的 35% ~ 45%。每个基质含水量设接种 GM（G）和不接种（N）两水平，共 4个处理。每个
处理 8株重复，共 32钵。接种处理的每钵接入 10 g菌剂（约含 720个孢子）。孢子的接种采用“二
层接种法”，即首先在试验盆中装入 1/3的灭菌基质，然后均匀地撒上一层接种体，用量大约是每钵
接入量的 3/5，之后又撒上一层基质至盆高的 3/4处，将剩余的菌根接种体全部施入，覆上一层基质。
将甜瓜种子播于其上，再覆上一层细的基质。盆的规格是：上口内径 10 cm，盆底内径 7 cm，盆高
8.5 cm。采用蛭石作为试验基质，每盆装试验基质约 100 g，基质预先经过 0.11 MPa，121 ℃高压蒸
气灭菌 2 h。
整个试验过程使用 1/2 浓度的 Hoagland营养液浇灌，经过 30 d的侵染后幼苗达到两叶一心时
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开始水分处理，5 d和 10 d后取各处理甜瓜幼苗的根系、茎和叶片，液氮冷却后，–80 ℃保存。
1.2 RNA的提取和 cDNA第一链合成
所有甜瓜组织材料采用异硫氰酸胍法（程华 等，2005）提取 RNA。参照 TIANScriptRT Kit说明
书合成 cDNA第一链。
1.3 目的基因的克隆和测序
参照 GenBank 登录的水稻、小麦、拟南芥等物种中已发表的抗旱相关基因序列进行比对，在
保守区域设计一对引物 P1和 P2（P1：5′-TTGTAAATCTCCGCATCG-3′；P2：5′-TCAGCACCCAGA
CCAAAT-3′）。分别以水分处理5 d后各甜瓜幼苗根系反转录产物为模板进行PCR扩增：94 ℃ 4 min；
94 ℃ 40 s；50 ℃或 54 ℃ 30 s；72 ℃ 2 min，共 35个循环；72 ℃延伸 7 min。反应产物用 2%的琼脂
糖凝胶检测，差异片段用天根生化科技（北京）有限公司的琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收，回
收纯化产物克隆至 pMD-18T（TaKaRa）载体，转化 E.coli TOP10（TaKaRa），菌液 PCR鉴定后由北
京三博远志生物有限公司测序。
1.4 生物信息学分析
用 BLAST对克隆序列进行同源检索后，确认为抗旱相关基因的同源序列；用 DNAStar分析克
隆基因序列；在 NCBI 网站上用 ORFFinder 寻找最大开放阅读框，用 BioXM 对克隆序列进行氨基
酸组成、等电点分析；用 SOPMA在线软件工具，预测编码蛋白质的二级结构，用 CBS服务器上的
SingalP程序和 NetPhos程序对编码蛋白质序列的信号肽和磷酸化位点进行预测分析；氨基酸序列的
疏水性和跨膜区分别用 protscale程序和 TMpred软件进行预测。
1.5 甜瓜MeP5CS基因的组织表达分析
提取不同组织来源的 RNA，以甜瓜看家基因（GenBank 登录号：AY292386）设计内参引物，
作为内参。PCR反应的扩增条件为 94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；
72 ℃延伸 5 min。通过 2%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。
1.6 甜瓜叶片脯氨酸含量的测定
脯氨酸含量的测定采用酸性茚三酮染色法。取 0.3 g 甜瓜叶片鲜样测定，重复 3 次，数据采用
DPS软件（7.05版本）进行单因素方差分析处理间差异显著性，用 Duncan’s新复极差法进行平均数
间的多重比较。
2 结果与分析
2.1 目的基因的扩增与克隆
所有甜瓜材料 RNA经电泳均检测到 3条清晰可区分的条带，表明 RNA未降解。经紫外分光光
度计检测，RNA样品 A260/A280的比值介于 1.8 ~ 2.0之间，说明抽提的 RNA质量和纯度符合反转
录和 PCR的要求。
以引物 P1和 P2对水分处理 5 d后各甜瓜幼苗根系反转录产物进行 PCR扩增。扩增产物经 2%
琼脂糖凝胶电泳检测，表明只有在水分胁迫下的接菌甜瓜根系具有 1 000 bp的特异性片段（图 1），
说明 AMF 在水分胁迫下可以诱导甜瓜抗旱基因的特异表达。回收此条带，经克隆测序后将序列用
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BLAST检索，发现此片段与多种植物的 P5CS基因同源性较高，因此推断为甜瓜 P5CS基因，并命
名为 MeP5CS。
图 1 甜瓜幼苗根系抗旱基因的 PCR扩增
NA：未接菌株；AM：接菌株；WW：正常水分；WD：水分亏缺；M：Marker。
Fig. 1 Amplified products with primers P1 and P2 in melon seedling roots
NA：Non-AM plant；AM：Mycorrhizal plant；WW：Well-watered；WD：Water deficit；M：Marker.
2.2 MeP5CS基因的生物信息学分析
MeP5CS的 cDNA序列及其推导氨基酸组成如图 2所示，利用 DNAStar、ORFFinder和 BioXM
软件分析，MeP5CS基因全长 1 000 bp，包含 73 bp的 5′非编码序列、174 bp的 3′非编码序列和 753 bp
的开放阅读框，编码 250 个氨基酸，起始密码子为 ATG，终止密码子为 TGA（图 2）。MeP5CS 编
码的蛋白质分子量为 82.18 kD，理论等电点为 4.90。
图 2 MeP5CS基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
起始密码子为 ATG，终止密码子（TGA）用星号表示。
Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the MeP5CS cDNA
The start codon is ATG and the stop codon（TGA）is marked with asterisk.

8期 黄 志等：甜瓜抗旱性相关基因MeP5CS的克隆、序列分析及表达 1283

高等植物 P5CS蛋白质具有 6个主要功能域：ATP结合位点，两个亮氨酸结构域，NADPH结合
位点，谷氨酰激酶（GK）结构域和谷氨酸半醛（GSA）结构域（Zhu et al.，1998）。通过序列比对，
MeP5CS编码氨基酸序列与已知植物桐花树（ABG74923）、猕猴桃（AAC14481）和葡萄（CBI31612）
的 P5CS基因同源性较高，分别为 94%、81%和 73%（图 3），表明MeP5CS具有高等植物 P5CS蛋
白质的两个功能域：亮氨酸结构域（1 ~ 20氨基酸）和谷氨酰激酶（GK）结构域（46 ~ 70氨基酸）。
由于本试验只是获得甜瓜 P5CS 基因的部分 cDNA 序列，尚未克隆到全长，所以 P5CS 的其他功能
域在 MeP5CS中未找到。
图 3 MeP5CS与其他植物的同源性比对
图中的蛋白质序列在 GenBank中的登录号：猕猴桃（AAC14481），桐花树（ABG74923），葡萄（CBI31612）。
Fig. 3 Alignment of the deduced MeP5CS protein and P5CS from other plants
The protein sequences shown in these diagrams are listed in the GenBank database under the following accession numbers：
Actinidia deliciosa（AAC14481），Aegiceras corniculatum（ABG74923），Vitis vinifera（CBI31612）.

依据 SOPMA 在线软件工具预测甜瓜 MeP5CS 基因编码蛋白质的二级结构，表明该蛋白约含
40.2%的 α–螺旋，25.2%的 β–转角和 34.6%的不规则卷曲。
在 CBS服务器上利用 SingalP程序的神经网络模型（NN）和隐马尔克夫模型（HMM）进行预
测，在 N 端含有 19 个由氨基酸残基组成的信号肽，信号肽酶剪切位点介于 S19 ~ G20之间，表明
MeP5CS编码的蛋白质是分泌蛋白质；利用 NetPhos程序预测得出该蛋白有 10个丝氨酸（Ser）、两
个苏氨酸（Thr）和 1 个酪氨酸（Tyr）可能成为蛋白激酶磷酸化的位点，表明在 P5CS 的生物合成
过程中需要翻译后加工修饰才能成为特定功能的成熟多肽，同时磷酸化和去磷酸也是细胞内信号转
导的重要方式。
用 protscale程序预测编码蛋白质序列亲水/疏水性，结果表明多肽链的第 224位的亮氨酸（Leu）
具有最高的分值 2.878，第 24位的精氨酸（Asp）具有最低的分值–1.967，第 224位的 Leu疏水性
最强，第 24 位的 Asp 亲水性最强，就多肽链整体来看，疏水性氨基酸占多肽链大部分，整体偏于
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正值以上，表明 MeP5CS 编码蛋白是疏水性蛋白。此外用 TMpred 软件预测，该基因编码蛋白有 2
个跨膜螺旋结构（63 ~ 83，234 ~ 250），表明该蛋白属于膜结合蛋白。
2.3 甜瓜MeP5CS基因的组织表达分析
以半定量 RT-PCR法分析 MeP5CS基因在菌根甜瓜不同组织部位的表达，当正常水分处理时，
在接种 AMF和未接种 AMF的甜瓜组织中 MeP5CS基因都没有表达；当在水分胁迫处理时，只有在
接种 AMF 的甜瓜组织中 MeP5CS 基因才表达，而且在根系中表达最强，其次是茎部，叶片中表达
最弱（图 4）；水分胁迫处理 5 d和 10 d时相比较，同一甜瓜组织的 MeP5CS基因在 10 d后的表达
明显比 5 d后的高。表明 MeP5CS基因在甜瓜组织中的表达受 AMF和水分胁迫的影响，并且与甜瓜
的组织特异性和水分胁迫处理的时间有关。
图 4 接种 AMF的甜瓜组织中MeP5CS基因的表达分析
Fig. 4 Expression and analysis of MeP5CS in melon by AMF under water stress
2.4 甜瓜幼苗处理后脯氨酸积累与MeP5CS基因表达的相关分析
如图 5所示，在正常水分条件下，两个处理甜瓜幼苗的脯氨酸含量在整个试验处理中相对稳定，
接菌处理（WWG）和未接菌处理（WWN）的脯氨酸含量无显著差异；在水分胁迫下，接菌处理（WDG）
的脯氨酸含量在第 5天和第 10天分别是未接菌处理（WDN）的 172.5%和 139.6%，接菌处理（WDG）
的脯氨酸含量均显著高于未接菌处理（WDN），表明在水分胁迫下，接种 AMF 可以显著增加甜瓜
幼苗脯氨酸的积累量，且积累量随胁迫时间的延长而增加，且与 MeP5CS基因在甜瓜幼苗中的表达
呈正相关。
图 5 丛枝菌根真菌对不同水分处理下甜瓜幼苗脯氨酸含量的影响
WWG：正常水分接菌；WWN：正常水分未接菌；WDG：水分亏缺接菌；WDN：水分亏缺未接菌。
Fig. 5 Effects of Arbuscular mycorrhizal fungi on changes of proline content under different water treatments
WWG：AMF + well-watered；WWN：Well-watered；WDG：AMF + water deficit；WDN：Water deficit.
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3 讨论
本研究中对水分胁迫下接菌和未接菌甜瓜 MeP5CS基因表达的结果表明，该基因的表达受 AMF
和水分胁迫的双重诱导，是菌根在逆境下增强抗性的重要分子基础。正常水分处理时，AMF不能诱
导甜瓜 MeP5CS 基因的表达，水分胁迫下，MeP5CS 基因只有在接种 AMF 甜瓜中被诱导表达，并
且在根系中表达最强，其次是在茎部，叶片中表达最弱，结果还显示水分胁迫处理 10 d后，各个组
织中的表达分别较 5 d后的要强，这说明本试验中只有当水分胁迫时 AMF才能诱导 MeP5CS基因在
甜瓜材料中进行表达，并且 AMF 的诱导作用因部位而不同，同时与水分胁迫时间也有关。关于在
接种 AMF与水分胁迫双重因素下 P5CS基因的表达研究尚无文献报道。本试验通过半定量 RT-PCR
对甜瓜组织表达的差异分析证明了菌根增强植物抗逆性有特异表达，为进一步通过实时定量 PCR深
入开展研究打下了基础。
脯氨酸合成酶 P5CS 是脯氨酸合成代谢中的关键酶，决定着脯氨酸合成的速度。目前，编码该
酶的基因已经从很多植物中克隆出来。第一个编码 P5CS基因是从豇豆 cDNA文库中分离得到（Hu
et al.，1992），基因序列全长为 2 417 bp，含有一个开放阅读框，编码蛋白质约 73.2 kD，其中含有
一个亮氨酸结构域，而亮氨酸结构域有利于蛋白分子之间或分子内的相互作用，维持蛋白质结构的
稳定，也可能与同型二聚体和异型二聚体的形成有关；另外该编码蛋白质序列还具有磷酸化位点，
并证明在脯氨酸合成水平上具有反馈调节作用。在苜蓿中发现两个 P5CS基因（Ginzberg et al.，1998；
Armengaud et al.，2004），试验表明 P5CS基因的表达水平受不同发育时期与环境特异的影响。拟南
芥中也克隆出两个 P5CS基因（Savouré et al.，1995；Strizhov et al.，1997），在干旱胁迫下，P5CS
基因的诱导表达和脯氨酸的积累之间存在着明显的相关性（Savouré et al.，1995），本试验结果与其
一致。
采用生物信息学方法对本试验获得的 MeP5CS基因进行序列分析，其 cDNA全长 1 000 bp，ORF
为 753 bp，编码 250个氨基酸。同源序列比对发现，甜瓜的 MeP5CS基因的序列与猕猴桃、桐花树
和葡萄的 P5CS基因的序列同源性较高，因此推断获得的 cDNA序列是甜瓜的 P5CS基因。MeP5CS
编码蛋白是一种疏水跨膜蛋白，并且存在磷酸化位点，与已报道的桐花树 P5CS 编码蛋白疏水区域
十分相似，因此推测他们之间的关系有可能是同一种功能蛋白的不同变构体；此外在 1 ~ 20和 46 ~
70氨基酸之间分别具有亮氨酸结构域和谷氨酰激酶（GK）结构域，但是并未找到 P5CS的其他功能
域，可能是由于本试验仅获得甜瓜 P5CS基因的部分 cDNA序列，尚未克隆到 P5CS基因的全长。
通过对不同处理下与 MeP5CS密切相关的植株脯氨酸积累分析，表明在水分胁迫下，接种 AMF
可以显著增加甜瓜幼苗脯氨酸的积累量，且积累量随胁迫时间的延长而增加，这些均与 MeP5CS基
因在甜瓜幼苗中的表达呈正相关，从而进一步验证了菌根增抗对植物体内渗透物含量的调节是通过
诱导基因表达的变化完成的，下一步拟通过 RACE技术获得 MeP5CS基因的全长，对其功能作进一
步的深入分析。

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