全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (8) : 1169 - 1176
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 01 - 16; 修回日期 : 2009 - 06 - 01
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30471179)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: SHL1606@ cau1edu1cn)
芹菜与 CM S胡萝卜原生质体非对称性融合的初步
研究
谭　芳 , 沈火林 3 , 王　帅 , 周　晶 , 郭　爽
(中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京 100193)
摘 　要 : 以芹菜和胡萝卜瓣化型细胞质不育系为试材 , 研究了碘乙酰胺 ( IOA ) 和紫外线对两种原生
质体的钝化作用 , 以及融合温度、聚乙二醇 6000 ( PEG6000) 和 Ca2 +浓度对融合效果的影响 , 并对融合再
生植株进行了鉴定。结果表明 , 6 mmol·L - 1 IOA处理 7 m in以上可钝化芹菜原生质体细胞质 , 强度约为 20
μmol·m - 2 ·s- 1的紫外线持续辐射 9 m in可使胡萝卜原生质体活力趋于 0; 适当低温 (5 ℃) 可提高聚合率
约 20% ; PEG6000浓度为 40% , 高 pH液中 Ca2 +浓度为 011 mmol·L - 1时最适宜两种原生质体融合 ; 融合
产物液体浅层培养 40 d后产生的可见细胞团在不添加植物生长调节剂的 MS0培养基上再生出了完整植株。
用 AFLP分子标记对 12株再生株总 DNA的鉴定结果表明 , 再生株多不同程度地发生了芹菜和胡萝卜基因
的非对称性融合。用 STS分子标记鉴定再生株的细胞质基因 , 瓣化型雄性不育特异引物 STS 4的扩增结果
显示 , 除 1号单株外其余 11株均成功转入了胡萝卜瓣化型雄性不育基因。
关键词 : 芹菜 ; 胡萝卜 ; 瓣化型细胞质不育 ; 非对称性体细胞融合
中图分类号 : S 63613; S 63112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0821169208
Prelim inary Study of A symm etr ic Protopla st Fusion Between Celery ( A pium
graveolens L . ) and CM S Carrot ( D aucus ca rota L . )
TAN Fang, SHEN Huo2lin3 , WANG Shuai, ZHOU J ing, and GUO Shuang
(College of A gronom y and B iotechnology, China A gricultural U niversity, B eijing 100193, China)
Abstract: Cytop lasm ic male sterility ( CMS) celery is useful for hybrid seed p roduction. A symmetric
p rotop last fusion of fertile celery and petaloid CMS carrot was carried out by polyethylene glycol ( PEG) 6000
treatment in order to introduce CMS from carrot to celery. Protop lasts of celery were treated with 6 mmol·L - 1
iodoacetam ide for 7 m in to passivate cytop lasm, and those of carrot were continuously irradiated with UV rays
(20μmol·m - 2 ·s- 1 ) for 9 m in to kill the nucleus. Low temperature (5 ℃) increased aggregation rates by
20% , and 40% PEG 6000 and 011 mmol·L - 1 Ca2 + in high Ca2 + high pH solution were the best for fusion of
two p rotop lasts. Twelve somatic hybrids were obtained and p lants were regenerated on MS0 medium. AFLP
analysis indicated that all of them were somewhat asymmetrically fused. STS marker analysis suggested that
petaloid CMS were successfully introduced into 11 regenerated p lants.
Key words: celery; carrot; petaloid cytop lasm ic male sterile; asymmetric somatic hybridization
芹菜 (A pium graveolens L. ) 为伞形花科 (Umbelliferae) 二年生草本植物 , 复伞形花序 , 花小 ,
两性花 , 异花授粉 , 所以 , 利用雄性不育是生产芹菜杂交种的理想途径。O rton ( 1982) 在野生芹菜
P1229526上首先发现了雄性不育株 , Quiros等 (1986) 对其细胞学和遗传学特性进行了研究 , 高国
训等 (2006) 在芹菜自交系 0123采种田中发现自然突变的雄性不育株 , 并利用雄性不育两用系培育
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出芹菜杂交种。但利用核遗传的雄性不育采用两用系制种时要拔除 50%的可育株 , 由于缺乏标记性
状 , 利用价值不高。选育出细胞质遗传的 100%雄性不育类型对促进芹菜品种的一代杂种化更具实用
意义。
Carson等 (1972) 在烟草上成功获得第一个体细胞杂种后 , 原生质体融合相继在多个物种中得
到应用 , 而原生质体非对称性融合在茄科的马铃薯和番茄以及十字花科作物上应用最广 (L iu et al. ,
2005) , 在伞形花科作物上的应用多以胡萝卜为受体 ( Ichikawa et al. , 1988; Suenaga et al. , 1988;
Kisaka et al. , 1994; Yamamoto et al. , 2000; 司家钢 等 , 2002) , 鲜见以芹菜为受体的报道。王辅 !
等 (1989) 以普通栽培种胡萝卜的肉质根和芹菜的叶肉原生质体为试验材料 , 进行对称性融合 , 获
得 3株细胞杂种。
与对称性融合相比 , 非对称性融合因为引入的外源基因较少而降低了融合杂种不亲和的发生频
率 , 获得目标性状的可能性更大。本研究旨在探索芹菜与胡萝卜非对称性融合时不同预处理条件对两
种悬浮培养来源的原生质体的钝化作用 , 以及融合过程中诸多因素对融合效果的影响 , 并对再生植株
进行分子鉴定 , 为原生质体融合创造芹菜雄性不育新种质奠定基础。
1　材料与方法
111　材料
芹菜为 ‘上海春芹 ’, 胡萝卜为瓣化型细胞质雄性不育系 ‘新黑田五寸 ’。试验于 2006年 7月—
2008年 12月在中国农业大学蔬菜遗传育种实验室进行。
将芹菜和胡萝卜的种子消毒后分别接种于添加 110 mg·L - 1 GA3的 MS培养基和无植物生长调节
剂的 MS培养基上 , 获得无菌苗并分别提取原生质体 (韩清霞 , 2006)。用 evans2blue染色液检测原
生质体活力 (未染上蓝色的原生质体数占总数的比例 )。
112　原生质体钝化处理
将芹菜原生质体 (受体 ) 置于离心管中 , 用碘乙酰胺 ( IOA ) 钝化其细胞质。首先将 15 mmol·
L - 1 IOA加入 2 - (N - 吗啡 ) 乙基磺酸 (MES) 液 ( 11%甘露醇 + 015% CaCl2 ·2H2 O + 011%
MES; pH 516) 中配制成 IOA母液 , 过滤灭菌后再用 MES液稀释至所需浓度。原生质体用 MES液调
密度为 3 ×105个 · mL - 1。细胞质的钝化试验分两次进行 , 第 1次用不同浓度的 IOA液 ( 0、3、6、
9、12 mmol·L - 1 ) 处理 15 m in; 第 2次用第 1次试验得到的最适浓度处理不同时间 (0、5、7、9、
11、13、15 m in)。处理后依次用 MES液和 KDG液体培养基 (MS + 0125 mg·L - 1 KT + 110 mg·
L - 1 2, 42D + 3%甘露醇 + 3%蔗糖 ) 各洗 2次 , 悬浮于 KDG液体培养基中进行液体浅层培养 , 原
生质体培养密度为 115 ×105个 ·mL - 1 , 2 mL·皿 - 1。
胡萝卜原生质体 (供体 ) 置于培养皿中 , 用紫外线钝化其细胞核。用 KDG液体培养基调原生质
体密度为 115 ×105个 ·mL - 1 , 取 2 mL平铺于去盖的 6 cm培养皿中 , 分别处理 0、1、3、5、7、9、
11、13 m in, 3次重复。辐射源为超净工作台上的紫外灯 , 强度 20μmol·m - 2 ·s- 1。处理后直接培
养。
两种原生质体钝化处理结束 3 d后检测活力 , 40 d后观察能否形成肉眼可见的细胞团。
113　原生质体融合
融合方法采用经典的 PEG -高 Ca2 +高 pH法 ( Kao et al. , 1974) , 对其进行改良 , 并研究了融合
过程中诸多因素的影响。PEG液 ( PEG6000 + 011 mol·L - 1 CaCl2 ·2H2 O + 011 g·L - 1 KH2 PO4 +
1811 g·L - 1葡萄糖 ; pH 710) 中 PEG6000的浓度设 30%、40%、50% ; 高 Ca2 +高 pH液 (CaCl2 ·
2H2 O + 318 g·L - 1甘氨酸 + 72187 g·L - 1甘露醇 ; pH 1010) 中 Ca2 +的浓度设 0105、011、012 mol·
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　8期 谭 　芳等 : 芹菜与 CMS胡萝卜原生质体非对称性融合的初步研究 　
L - 1。处理后分别观测聚合率 (发生聚合的原生质体数占总原生质体数的百分比 )、多聚率 (发生 3
个或 3个以上细胞聚合的原生质体数占总原生质体数的百分比 ) , 培养 40 d后检测肉眼可见的细胞团
以及形成的细胞团再生出植株等。
改良的具体步骤为 : 两种原生质体钝化处理后 , 各用 MES液调密度为 3 ×105个 ·mL - 1 , 1 ∶1混
合。在 10 mL离心管中依次加入 1 mL原生质体混合液 , 静置 10 m in; 1 mL PEG液 , 静置 15 m in; 1
mL高 Ca2 +高 pH液 , 静置 10 m in; 2 mL高 Ca2 +高 pH液 , 静置 10 m in; 2 mL高 Ca2 +高 pH液 , 静置
10 m in。800 r·m in - 1 , 6 m in使融合原生质体沉淀 , 先后用 MES液和 KDG液体培养基各洗 2次后 ,
悬浮于 KDG液体培养基中进行液体浅层培养 , 原生质体培养密度为 115 ×105个 ·mL - 1 , 2 mL ·
皿 - 1。同时分别培养钝化处理过的及未经任何处理的芹菜和胡萝卜原生质体作为对照。
为了观测温度对原生质体死亡率的影响 , 避免预处理导致原生质体活力下降 , 用未经钝化处理的
两种原生质体进行融合。融合过程控制温度分别为 5、15、25、35和 45 ℃, 以 25 ℃ (常温 ) 为对
照 , 3次重复。加入 PEG液 10～15 m in后于显微镜下观察聚合率、多聚率和死亡率。
114　植株再生与鉴定
融合原生质体培养约 40 d后 , 将长出的胚性愈伤组织转到培养基 (MS + 0、0125、015、110
mg·L - 1 KT + 500 mg·L - 1水解酪蛋白 CH ) 上再生培养。再生单株总 DNA用改良 CTAB法提取 ,
并用 AFLP分子标记鉴定 (Vos et al. , 1995)。
用 5对 M + 3 /E + 3引物进行扩增 , 分别为 M48 /E46 (M 2CAC /E2ATT) , M59 /E39 (M 2CTA /E2
AGA ) , M61 /E39 (M 2CTG/E2AGA) , M62 /E39 (M 2CTT/E2AGA ) , M62 /E46 (M 2CTT/E2ATT)。扩增
产物用 610%聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显色。
细胞质基因用 STS分子标记鉴定。以总 DNA为模板 , 用 Nakajuma等 (1999) 报道的瓣化型细胞
质雄性不育特异引物 STS1和 STS4进行扩增。引物序列为 STS12F (ACATATAGGATACACCGGTGC) ,
STS12R ( TGAGTCGAGCCTACTCGATT) ; STS42F ( AGAGGAATGGGAACGAAACA ) , STS42R (ATATAT2
GCCCCACAAGCTAA)。扩增体系及程序皆参照 Nakajuma等 (1999) 的方法。产物用 210%琼脂糖电
泳 (4 V·cm - 1 ) , EB染色后于凝胶成像仪下拍照。
2　结果与分析
211　原生质体前处理效果
21111　 IOA处理芹菜原生质体 　
IOA钝化芹菜原生质体细胞质的效果随浓度和时间不同有显著区别。处理相同时间 ( 15 m in)
时 , IOA浓度为 3 mmol·L - 1时 , 原生质体活力为 50119% , 当浓度升至 6～12 mmol·L - 1时原生质体
活力降至 0～10166%。处理完的原生质体培养 40 d后 , 只有对照和 3 mmol·L - 1的处理出现了肉眼可
见的细胞团。而 6 mmol·L - 1的处理是培养 3 d后原生质体活力为 0、培养 40 d后不出现肉眼可见细
胞团的最低浓度。
用 6 mmol·L - 1 IOA处理不同时间的结果显示 : 处理 5 m in原生质体的活力就下降了约 35% , 而
从 5 m in增至 15 m in活力只下降了不到 10% (表 1)。处理过的原生质体培养 40 d后 , 只有对照长出
了肉眼可见的细胞团。据上述结果认为以 6 mmol·L - 1 IOA处理大于 7 m in可以使原生质体培养 3 d后
活力降为 0, 培养 40 d后未出现肉眼可见细胞团。
21112　紫外线处理胡萝卜原生质体 　
紫外线强度相同时 , 随处理时间增加胡萝卜原生质体活力下降。当时间增至 9 m in时 , 原生质体
的成活率已降至约 10% , 且与活力为 0无显著差异 (图 1)。培养 40 d后 , 大于 7 m in的处理均无肉
眼可见细胞团产生。
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表 1　6 mm ol·L - 1 IOA处理不同时间对芹菜
原生质体活力的影响
Table 1　The effects of 6 mm ol·L - 1 IOA trea tm en t d ifferen t
tim e on celery protopla sts v iab ility
时间 /m in Time 活力 /% V iability
0 48109 ±0106 a
5 14160 ±0117 b
7 13178 ±0107 b
9 4160 ±0103 c
11 7150 ±0105 bc
13 1173 ±0102 c
15 5115 ±0104 c
　　注 : 不同小写字母为 0105水平差异显著。
Note: The small letters show significant difference at 5% level.
图 1　紫外线连续处理时间对胡萝卜
原生质体活力的影响
F ig. 1　The effects of UV on carrot
protopla sts v iab ility
212　不同温度处理效果
由表 2可知原生质体聚合率以 5 ℃时最高。5 ℃和 45 ℃时死亡率显著高于与常温接近的温度 ,
但是最高也未超过 15% , 对后面的培养不会造成大的影响。故适当降低温度对原生质体融合有利。
表 2　温度对融合效果的影响
Table 2　The effects of tem pera ture on fusion
温度 /℃
Temperature
聚合率 /%
Aggregation rate
多聚率 /%
Multi2aggregation rate 死亡率 /%Mortality
5 73116 ±0112 a 34168 ±0124 a 10187 ±0107a
15 52194 ±0128 ab 21182 ±0126 a 3164 ±0103b
25 49198 ±0116 ab 23159 ±0130 a 3115 ±0104b
35 42153 ±0132 b 14138 ±0124 a 3164 ±0103b
45 47102 ±0113 ab 16189 ±0113 a 14160 ±0104a
　　注 : 不同小写字母为 0105水平差异显著。
Note: The small letters show significant difference at 5% level.
213　不同浓度的 PEG6000和高 Ca2 +高 pH液处理效果
原生质体聚合率在 PEG6000的浓度为 40%和 50%时显著高于 30%时 , 而多聚率和死亡率都无显
著差异。因为 PEG溶液需要过滤灭菌 , 其浓度越高过滤越难 , 所以选择浓度为 40%较好 (表 3)。
表 3　PEG浓度对融合效果的影响
Table 3　The effects of PEG concen tra tion on fusion
PEG浓度 /%
Concentration of PEG
聚合率 /%
Aggregation rate
多聚率 /%
Multi2aggregation rate 死亡率 /%Mortality
30 34112 ±0128 b 10176 ±0122 a 1187 ±0103 a
40 60109 ±0112 a 20121 ±0113 a 3126 ±0103 a
50 65150 ±0117 a 28153 ±0123 a 2131 ±0106 a
　　注 : 不同小写字母为 0105水平差异显著。
Note: The small letters show significant difference at 5% level.
原生质体经 PEG液处理后 , 用高 Ca2 +高 pH液清洗可以提高融合频率并促使原生质体恢复圆球
形。当 Ca2 +浓度为 011和 0105 mmol·L - 1时原生质体活力分别为 25169%和 21189% , 显著高于浓度
为 012 mmol·L - 1时的 16158% , 但 40 d后只有 011 mmol·L - 1的处理长出了肉眼可见的细胞团。
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　8期 谭 　芳等 : 芹菜与 CMS胡萝卜原生质体非对称性融合的初步研究 　
214　原生质体的融合、培养与植株再生
依前面试验的结果 , 芹菜原生质体用 6 mmol·L - 1 IOA处理 8 m in, 胡萝卜原生质体用紫外线辐
射 9 m in, 向 1 ∶1混合的原生质体中加入 40%的 PEG液后 5～10 m in, 在显微镜下观察到两种原生质
体发生融合 (图版 , a)。依次用高 Ca2 +高 pH液、MES液和 KDG液体培养基清洗后 , 培养 40 d发现
只有融合的处理长出肉眼可见的细胞团 , 而钝化处理过的芹菜和胡萝卜原生质体都没有长出愈伤
(图版 , b)。细胞团在 KDG培养基上继代培养 2次后转入分化培养基 , 光下 25 ℃培养 , 诸多分化培
养基中只有在未添加植物生长调节剂的 MS0分化再生出了植株 (图版 , c) , 再生株在培养室开盖驯化
3 d后移栽至营养钵中 (图版 , d) , 保温保湿 , 待其长大后移入温室培养。
图版说明 : a. 融合原生质体 ; b. 培养 40 d后的融合产物及分别钝化处理过的芹菜和胡萝卜原生质体 (对照 ) ; c、d. 再生植株 ; e.
胞质杂种与融合亲本的叶形比较 (左为芹菜 ; 中为胞质杂种 ; 右为胡萝卜 )。
Explana tion of pla tes: a. Fusing p rotop last; b. IOA treated celery without fusion, UV treated carrrot without fusion and fusion p roducts after cul2
turing for 40 days; c, d. Regenerated p lantlets; e. Leaf shape comparison of hybrid (m iddle) and fusion parents.
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215　再生植株的鉴定结果
21511　总 DNA的 AFLP鉴定 　
5对引物中有 4对能在芹菜和胡萝卜上扩增出差异条带 , 只有引物 M61 /E39在两者上的扩增条带
无差异。表 4显示了总的扩增结果 , 各单株至少在一个引物上表现出既有芹菜的又有胡萝卜的特征
带。虽然芹菜和胡萝卜在引物 M61 /E39上扩增的谱带相同 , 但是 1号和 4号单株发生了特征带的缺
失。由图 2可以看出每个单株在引物 M62 /E46上都既有芹菜又有胡萝卜的特征带 , 2、3、8号单株出
现了新的特征带 , 而 3、6、12号单株缺失了芹菜和胡萝卜共有的特征带。由此可见融合处理会造成
基因重组或丢失。
表 4　5对引物在 12株再生株上的扩增结果
Table 4　F ive pr im erspiam plica tion results of 12 regenera ted plan ts
引物 Primer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
M48 /E46 + + + + + +
M59 /E32 + + + +
M61 /E39 3 3
M62 /E39 + + + + + +
M62 /E46 + + + + + + + + + + + +
　　注 : + 表示既有芹菜的特征带又有胡萝卜的特征带 ; 3 表示有芹菜和胡萝卜共同特征带的缺失。
Note: + Indicates having specific bands of both celery and carrot; 3 Indicates specific band deletion.
图 2　引物 M 62 /E46的 AFL P鉴定
ce: 芹菜 ; ca: 胡萝卜 ; 1～12: 再生植株 ; M: Marker; 箭头表示有新特征带出现 ;
三角表示有共同特征带的缺失。
F ig. 2　AFL P am plica tion of M 62 /E46
ce: Celery; ca: Carrot; 1 - 12: 12 regenerated p lants; M: Marker;
A rrow: New specific bands; Triangle: Common specific band deletion.
21512　细胞质基因的 STS鉴定 　
图 3表明 , 引物 STS 1在芹菜和胡萝卜上的扩增结果无差异。引物 STS 4能在胡萝卜上扩增出条
带而在芹菜上不能扩增出条带 , 融合再生植株除 1号单株外均与胡萝卜有相同的特异条带 , 说明 12
株再生株中有 11株已成功转入了瓣化型雄性不育基因。DNA检测和引物 STS 1的扩增结果都说明提
取的芹菜和 1号单株的 DNA浓度足够用于 STS扩增 , 因此可以判定 1号单株的细胞质内不含瓣化型
雄性不育基因 , 其细胞质基因可能与芹菜相同。
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　8期 谭 　芳等 : 芹菜与 CMS胡萝卜原生质体非对称性融合的初步研究 　
图 3　引物 STS 1和 STS 4的扩增
ce: 芹菜 ; ca: 胡萝卜 ; 1～12: 再生植株 ; M: Marker。
F ig. 3　STS am plica tion results
ce: Celery; ca: Carrot; 1 - 12: 12 regenerated p lants; M: Marker.
3　讨论
本研究分别用 IOA和紫外线钝化处理芹菜和胡萝卜原生质体后 , 用 PEG -高 Ca2 +高 pH法融合获
得 12株再生植株 , 分别用 AFLP和 STS分子标记鉴定其总 DNA和细胞质基因 , 发现各再生株都不同
程度地发生了非对称性融合 , 其中有 11株的细胞质成功转入了胡萝卜瓣化型雄性不育基因 , 且初步
的形态学鉴定发现胞质杂种的叶形介于芹菜和胡萝卜两者之间 (图版 , e)。
但研究中发现 , 用 AFLP等分子标记鉴定再生株时 , 除 1号和 7号单株以芹菜的特征带为主外 ,
其余 10株单株的特征带均以胡萝卜为主。一方面 , 这可能因为鉴定时提取的 DNA为总 DNA (即细
胞核 DNA和细胞质 DNA) , 鉴定时所用的引物有可能可以在细胞质 DNA上扩增出特异条带 , 而由
STS的鉴定结果可知再生株的细胞质 DNA与胡萝卜相同 , 鉴于此再生株的特征带以胡萝卜为主也是
有可能的 ; 另一方面 Forsberg等 (1998) 认为紫外线不能消除供体全部的核染色体 , 只能造成染色体
的断裂和部分消除 , 因此 , 虽然用紫外线处理后的胡萝卜原生质体不能正常分裂产生可见愈伤组织 ,
但是融合体中存在胡萝卜基因的可能性还较大。而王辅德等 (1989) 用胡萝卜和芹菜进行原生质体
对称性融合试验 , 在 MS0培养基上分化出植株 , 所获再生植株中 90%以上皆为胡萝卜 , 其认为胡萝
卜在 MS0培养基上较芹菜更易分化。本研究尝试了多种分化培养基 , 最后也只在 MS0培养基上分化出
了植株 , 所以可能以胡萝卜基因为主的融合体优先分化。
总的来说研究所获的 12株再生株都既有芹菜的基因又有胡萝卜的基因 , 它们与芹菜杂交的亲和
性应该比胡萝卜直接与芹菜杂交的亲和性有所提高 , 且有 11株再生株的细胞质中已成功转入胡萝卜
瓣化型雄性不育基因。其中 , 7号单株的细胞核以芹菜的基因为主 , 细胞质则与瓣化型雄性不育胡萝
卜相同 , 有望能直接与芹菜杂交获得胞质不育类型的芹菜新品种。1号单株的细胞核和细胞质都以芹
菜的基因为主 , 其与普通芹菜杂交虽然不能转入雄性不育基因 , 但有可能创造芹菜与胡萝卜中间类型
的新种质。而如果能够克服亲和性问题 , 其余 10株成功转入了瓣化型雄性不育基因的胞质杂种可以
作为母本与芹菜多次回交 , 逐渐将细胞核置换成与芹菜相同而细胞质保持不育 , 从而育成胞质不育类
型的芹菜新种质。
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