全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（2）：263–268
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–03–16；修回日期：2010–01–22
基金项目：国家科技支撑计划项目（2009BADB8B04）；高等学校博士学科点专项科研基金课题（20050022015）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail: gxjia@bjfu.edu.cn)）
新铁炮百合单倍体植株的诱导
韩秀丽，田晓明，贾桂霞*
(北京林业大学园林学院，国家花卉工程技术研究中心，北京 100083)
摘 要：在新铁炮百合‘雷山 1 号’减数分裂和小孢子发育进程研究的基础上，确定了与小孢子不同发
育时期相对应的花蕾长度和花药颜色等外部形态特征；筛选出‘雷山 1 号’诱导愈伤组织适宜的培养基： 基
本培养基为 MS 改良培养基，添加 2,4-D 0.5 mg · L-1、KT 4.0 mg · L-1，蔗糖浓度 30 ~ 90 g · L-1。对不同发育
阶段花药诱导培养的结果显示：最佳诱导时期为小孢子发育的早、中期，即花蕾长度为 24 ~ 25 mm 时，诱
导率达 44%。将花药愈伤组织转移至 MS 添加 2.0 mg · L-1NAA，可诱导分化形成花粉植株，分化率达 100％，
其中单倍体达 43%。
关键词：新铁炮百合；小孢子；单倍体
中图分类号：S 682.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X(2010)02-0263-06

Induction of Haploid Plantlets for Lilium × formolongi
HAN Xiu-li，TIAN Xiao-ming，and JIA Gui-xia*
(College of Landscape Architecture, Beijing National Engineering Research Center for Floriculture, Beijing Forestry University,
Beijing 100083, China)
Abstract: Based on the meiosis and microspore development of Lilium × formolongi ‘Raizan 1’, the
length of flower bud and the colors of anther relative to the development stages were determined. The suitable
media was selected for haploid callus induction of the ‘Raizan 1’, that was improved MS supplemented with
2,4-dichlunruphenoxyacetic（2,4-D）0.5 mg · L-1 and kinetin（KT）4.0 mg · L-1. The results showed the effects
of sucrose concentration in the 30–90 g · L-1 were not significant on the microspore callus induction.
Microspores at early and mid-stage were more suitable for culture. Induction percentage of haploid calli were
44%, as bud length were 24–25 mm. Plantlet was obtained when haploid calli was transferred to the MS
medium supplemented with 2.0 mg · L-1 naphthaleneacctic acid（NAA）. The induction rate of plantlets were
100%，there into，plantlets of haploid were 43%.
Key words：Lilium × formolongi；microspore；haploid

新铁炮百合（Lilium × formolongi Hort.）是由高砂百合（L. formosanum Walla.）和铁炮百合（L.
longiflorum Thunb.）为亲本杂交所得子代，又与铁炮百合回交培育而成的杂种系列（Ron & Yong，1996），
其最主要的特点是生育期短，可用种苗生产切花，而我国目前主要用百合种球生产切花，而种球大多
数依赖进口，生产成本高，且生产时间受种球供应商限制。新铁炮百合用种子进行切花生产的特性从
一定程度上缓解了这种矛盾。目前市场上购买的新铁炮百合种子部分为 F1代种子，用常规育种方法获

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得纯合自交系需要连续多年的自交与选择，花费大量的人力和物力。而通过花药培养获得单倍体植株
的途径，可在一年时间内获得纯合自交系，大大缩短育种年限，加速育种进程。目前还未见有关新铁
炮百合花药培养方面的报道。
已有的研究显示，供体的基因型、小孢子发育时期和培养基是影响花药培养的重要因素。首先，
基因型不同，花药培养的难易程度不同；褚云霞等（2002）用 6 个百合品种的花药进行培养，证明了
在百合花药愈伤组织诱导过程中，基因型不同，适宜的培养基也各不相同。其次，在小孢子发育时期
方面，Arzate 和 Nakazaki （1997）的研究表明，在诱导百合花粉雄核发育的过程中，花粉在接种时所
处的发育时期可能比培养基成分更重要，早、中期单核小孢子比晚期易产生愈伤组织。第三，培养基
的筛选是花药培养的重要环节。如谷祝平和郑国锠（1982）对处于单核晚期的大卫百合（L. davidii var.
willmottiae Raffill）的花药以改良 MS 为基本培养基，添加适当配比的生长调节剂，诱导出植株，最高
诱导率为 8.89％；Han 等（1997）以 MS 为基本培养基，添加 2.0 mg · L-1的 picloram 和 2.0 mg · L-1
的 Zeatin，从亚洲百合的杂交种‘Connecticut King’的花药诱导获得单倍体植株，诱导率达 17.6％；
褚云霞等（2001）以亚洲百合‘Pollyanna’的花药为外植体，以改良 MS 为基本培养基，在 2,4-D 3.0
mg · L-1和 KT 3.0 mg · L-1的条件下诱导获得花粉植株，且诱导率较高，为 42.16％。
作者在新铁炮百合‘雷山 1 号’花粉母细胞减数分裂及小孢子发育进程研究的基础上，确定花蕾
长度和花药形态与小孢子发育时期的关系；通过基本培养基、生长调节剂种类和浓度及小孢子不同发
育阶段的筛选，得到适合新铁炮百合‘雷山 1 号’花药愈伤组织诱导和单倍体植株再生的条件，使通
过花药培养获得大量单倍体或纯合二倍体成为可能。该研究为百合制种、遗传转化、遗传图谱构建等
工作奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
新铁炮百合‘雷山 1 号’种子购自日本，于北京林业大学温室播种，用当年实生苗形成的花蕾为
材料，于 2006 和 2007 年进行单倍体诱导试验。
1.2 小孢子发育进程观察
取不同长度的花蕾，记录花蕾和花药的形态特征；剥去花冠，取出花药，用卡诺固定液（无水乙
醇︰冰醋酸＝3︰1）固定 4 ~ 5 h，转入 70％乙醇中保存，以观测小孢子的发育进程。
制片时用蒸馏水清洗花药，采用涂片法，卡宝品红染色，Olympus 显微镜 BX51 观察，摄像系统
DP70 照相观察。
1.3 花药愈伤组织的诱导
1.3.1 基本培养基的筛选
将花蕾用塑料薄膜封好放在 4 ℃冰箱中冷藏 7 d。以 MS、 N6 及 B5 为基本培养基，附加 2,4-D
3.0 mg · L-1和 KT 3.0 mg · L-1，25 ℃黑暗条件下培养。
1.3.2 生长调节剂和蔗糖浓度的筛选
在上述试验的基础上，对筛选出的 MS 基本培养基改良，将 VB1 浓度提高到 4.0 mg · L-1 (褚云霞
等, 2001)，琼脂 0.8％，pH 5.8。运用 3 因素 3 水平正交试验设计（表 3），比较生长调节剂 2,4-D 和
KT 不同浓度组合及不同糖浓度对单倍体诱导的效果。接种花药时，使 23 ~ 26 mm 不同发育时期的小
孢子在每种培养基上数量相同，每个培养皿 18 ~ 20 个花药，3 次重复。置于 25 ℃黑暗条件下培养。

2 期 韩秀丽等：新铁炮百合单倍体植株的诱导 265

表 2 基本培养基的筛选
Table 2 Selection of basic media
1.3.3 小孢子发育时期的选择
利用试验筛选出的诱导效率最高的培养基（MS + 2,4-D 0.5 mg · L-1 + KT 4.0 mg · L-1 + 蔗糖 90
g · L-1），培养小孢子发育处于不同时期的花药，记录单倍体的诱导情况。每个处理 18 ~ 20 个花药，3
次重复，培养条件同上。
1.3.4 单倍体植株的检测
切取新鲜的根尖 3 ~ 4 mm，立即放入对二氯代苯饱和液中浸泡 5 ~ 6 h，蒸馏水冲洗 2 ~ 3 次，卡
诺固定液固定 12 h，蒸馏水冲洗 3 次，然后在 6 mol · L-1的 HCl 中离析 6 ~ 8 min，直到根尖足够软，
再用蒸馏水冲洗 3 次，卡宝染液染色 20 ~ 30 min，压片，镜检并照相（Olympus 显微镜 BX51），进行
染色体检测。
2 结果与分析
2.1 小孢子发育进程及与外部形态的相关性
小孢子的发育进程如图版，1 ~ 14 所示。百合每个花蕾中有 6 个花药，在小孢子发生和花粉发育
过程中，同一花蕾中不同花药基本处于同一发育时期。百合减数分裂过程中胞质分裂为连续型，即减
数第一次分裂后形成细胞壁，接着进行第二次分裂。
在减数分裂过程中存在着个别不同步的现象，如在以减数分裂后期Ⅱ为主的时期，存在着少量四
分体时期的细胞，即相邻的两个时期有时出现在同一视野。此外，在减数分裂过程中还出现减数分裂
异常的情况，如染色体不均等分离、染色体桥、染色体分离滞后等现象（图版，15 ~ 17）。
在观察小孢子形成和发育进程时，同时观测花蕾长度和花药的形态，以确定二者的对应关系，结
果见表 1。
表 1 新铁炮百合‘雷山 1 号’花蕾长度及花药颜色和小孢子发育时期的对应关系
Table 1 The relationship between bud length and anther color and microspore development stage of Lilium × formolongi ‘Rinzan 1’
花蕾长度/mm
Length of flower bud
花药颜色
Color of anther
小孢子发育时期
Microspores stage
15 ~ 17 淡绿， 透明 Weak green, crystal 小孢子母细胞 Mother of microspores
17 ~ 22 淡绿，不透明 Weak green,opaque 减数分裂前期 ~ 二分体 Meiosis prophase to anaphaseⅡ
22 ~ 24 绿色，不透明 Green,opaque 二分体 ~ 四分体 AnaphaseⅡ to telophaseⅡ
24 ~ 25 绿色，不透明 Green,opaque 单核小孢子早、中期 Uninucleate microspores prophase to metaphase
25 ~ 26 绿色，不透明 Green,opaque 单核晚期 Uninucleate anaphase
＞26 黄色 Yellow 二核期 ~ 成熟花粉粒 Two nucleus phase to ripe microspore
2.2 单倍体的诱导
2.2.1 适宜的基本培养基
将低温预处理后的花药分别接种在添加
2,4-D 3.0 mg · L-1 和 KT 3.0 mg · L-1 的 MS、B5
和 N6 基本培养基上，培养两个月后愈伤组织诱
导率见表 2。结果显示，诱导率最高的为 MS 培
养基，为 15%；其次为 B5，为 12.7%；N6 的愈
伤组织诱导率为 0；因此，MS、B5 都可作为基
本培养基。

基本培养基
Basic medium
接种花药数
Number of
inoculated anthers
愈伤数
Number of
induced calli
诱导率/%
Induction
frequency
MS 60 9 15.0
N6 57 0 0
B5 55 7 12.7
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愈伤组织的诱导见图版，18。培养 20 d 后在花药腹缝线处有几粒黄色颗粒物出现，50 d 后花药裂
开有黄色愈伤脱出。
2.2.2 单倍体愈伤组织适宜的诱导条件
表 3 显示 2,4-D、KT 和蔗糖不同浓度条件下，愈伤组织的诱导率不同：其中 2,4-D 0.5 mg · L-1、
KT 4.0 mg · L-1和蔗糖 90 g · L-1组合诱导率最高，为 36.7％。
通过对正交设计进行极差分析，KT 的浓度极差最大，对诱导率影响最大；其次是 2,4-D，蔗糖的
浓度对结果影响不大。
表 3 生长调节剂和蔗糖浓度对单倍体愈伤组织诱导的影响
Table 3 Effects of different concentrations of growth regulators and sucrose on haploid callus induction
编号
No.
2，4-D/
（mg · L-1）
KT/
（mg · L-1）
蔗糖/（g · L-1）
Sugar
接种花药数
Number of
inoculated anthers
愈伤数
Number of
induced calli
诱导率/％
Induction frequency
1 0.5 2.0 30 55 9 16.3
2 0.5 3.0 60 50 9 18.0
3 0.5 4.0 90 60 22 36.7
4 1.5 2.0 60 75 7 9.3
5 1.5 3.0 90 55 7 12.7
6 1.5 4.0 30 60 15 25.0
7 2.5 2.0 90 65 0 0
8 2.5 3.0 30 70 7 10.0
9 2.5 4.0 60 45 6 13.3

2.2.3 适宜的小孢子发育时期
将不同发育时期的小孢子接种于最适培养基上，愈伤组织发生情况如表 4 所示，诱导率最高的时
期为单核小孢子早、中期，此时花蕾长度为 24 ~ 25 mm，花药颜色为绿色，诱导率为 44.0％。
表 4 小孢子不同发育时期对愈伤组织发生的影响
Table 4 Effects of microspores development stages on callus induction
花蕾长/mm
Length of
flower bud
小孢子发育时期
Stage of microspores development
接种花药数
Number of inoculated
anthers
愈伤数
Number of
induced calli
诱导率/％
Induction frequency
20 ~ 22 二分体 Dyad 48 0 0
23 ~ 24 二分体 ~ 四分体 Dyad to tetrad 56 9 16.1
24 ~ 25 单核小孢子早、中期
Early and middle uninucleate microspores
50 22 44.0
25 ~ 26 单核小孢子晚期
Late uninucleate microspores
44 5 11.4
26 ~ 27 两核期 Two nuclei microspores 36 0 0

2.3 单倍体植株的分化诱导及鉴定
经诱导分化的愈伤组织转接于分化培养基中（MS + NAA 2.0 mg · L-1，蔗糖 30 g · L-1），分化率达
100％。采用压片法对再生植株根尖进行染色体检测，在所得花粉植株中单倍体植株达到 43%，染色
体数为 12 条（图版，20），二倍体植株占 57%，染色体数为 24 条。从植株外部形态上进行比较，单
倍体植株较正常二倍体植株纤弱（图版，19）。
2 期 韩秀丽等：新铁炮百合单倍体植株的诱导 267

图版说明：1. 双线期；2. 终变期；3. 中期Ⅰ；4. 后期Ⅰ；5. 末期Ⅰ；6. 前期Ⅱ；7. 中期Ⅱ；8. 后期Ⅱ；9. 末期Ⅱ；10. 单核早期；11. 单
核中期；12. 单核晚期；13. 二核期；14. 成熟花粉粒（× 20）；15、16. 染色体滞后；17. 染色体不均等分离；18. 愈伤组织；19. 分化的单倍体
植株；20. 单倍体染色体（除特别注明外，其余图片的放大倍数均为 × 40）。
Explanation of plates: 1. Diplotene; 2. Diakinesis; 3. Metaphase ; 4. Anaphase ; 5. Telophase ; 6. Prophase ; 7. Metaphase ; 8.Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Anaphase ; Ⅱ
9. Telophase ; 10.Ⅱ Uninucleate prophase; 11. Uninucleate metaphase; 12. Uninucleate anaphase; 13. Two nucleus phase; 14. Ripe microspore（× 20）;
15，16. Chromosome lag; 17. Chromosome unequal separation; 18. Calli; 19. Plantlet; 20. Haploid chromosome.
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3 讨论
3.1 不同品种小孢子发育时期与花蕾大小的相关性
本试验还将新铁炮百合‘雷山 1 号’与 OT 系列百合品种‘罗宾娜’小孢子发育时期与花蕾外部
形态的相关性进行了比较，两个品种在相同的小孢子发育阶段时，花蕾长度差异很大，‘雷山 1 号’小
孢子在单核期的花蕾长度为 24 ~ 26 mm，而‘罗宾娜’为 36 ~ 38 mm。因此，对不同品种进行花药培
养时，需对小孢子发育阶段进行研究。
3.2 影响百合花药培养的主要因素
影响百合花药培养的材料因素包括小孢子发育时期和基因型。在相同培养基上不同时期的小孢子
产生愈伤的效果不同。对于新铁炮百合‘雷山 1 号’来说，最佳时期为小孢子早期或中期，此时花蕾
长度为 24 ~ 25 mm，花药外部呈绿色。基因型不同，最佳培养基的成分不同。本试验中得到新铁炮百
合‘雷山 1 号’花药愈伤组织诱导的最佳培养基的生长调节剂配比为 2, 4-D 0.5 mg · L-1、KT 4.0 mg · L-1；
而大卫百合在添加 2,4-D 2.0 mg · L-1和 KT 2.0 mg · L-1的培养基上诱导效果最好（谷祝平和郑国锠，
1982）；‘Pollyanna’添加 2,4-D 2.0 mg · L-1，KT 2.0 mg · L-1诱导率最高（褚云霞 等，2001），表明了
不同基因型植株的花药对培养的反应不同，表现在花药愈伤组织诱导率、分化率及植株诱导率等（张
立功 等，1977）。
选择合适的培养基是花药培养的重要环节。培养基的成分包括基本培养基和生长调节剂成分。基
本培养基中有机成分和无机成分的含量不同诱导效果也不同。本试验结果表明：MS 改良培养基为新
铁炮百合‘雷山 1 号’最适宜的培养基。对于生长调节剂的种类和浓度，不同植物的需求不同。百合
若不在基本培养基中添加植物生长调节剂，小孢子无任何反应。在脱分化培养基中，细胞分裂素与生
长素共同使用对诱导愈伤组织十分重要，缺少其中之一均不能使花粉诱导获得成功。本试验显示，
2,4-D 和 KT 对小孢子由配子体发育转向孢子体发育途径起着重要作用。
因此，在小孢子植株诱导过程中，应针对不同的材料筛选适宜的培养基，以取得良好的效果。

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