全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（增刊）：2541 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com

收稿日期：2011–07–20
基金项目：国家自然科学基金项目（30871526）；广州市科技支撑项目（2009Z1-E801）
* E-mail：guopg@gzhu.edu.cn；Tel：020-39366911
菜薹荧光微卫星锚定片段长度多态性（MFLP）
技术体系的建立
郭培国 1,*，李荣华 1，张 华 2，郑岩松 2，黄红弟 2，夏岩石 1
（1广州大学生命科学学院，广州 510006；2广州市农业科学研究院，广州 510308）
选用 16个菜薹（菜心）品种作材料，采用 CTAB法提取基因组 DNA，荧光引物M13-F-IRDye
700购自美国 LICOR公司，其序列为 5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′；SSR锚定引物、加尾 SSR
锚定引物、MseI 接头、预扩增和选择性扩增引物均由上海生物工程有限公司合成，用于 PCR 反应
的 Taq DNA 聚合酶、MseI限制性内切酶、T4 DNA连接酶等试剂购自上海生工生物工程有限公司。
根据 MFLP 的基本原理，调节酶切反应、预扩增和选择性扩增的条件，运用琼脂糖凝胶电泳检测
预扩增效果，利用 LICOR 4300 DNA遗传分析仪进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测选择性扩增产
物。
经过多次摸索和探讨，建立了适合于菜薹的荧光MFLP技术体系，主要方法如下。（1）酶切反
应：酶切反应液总体积为 30 μL，包括菜薹 DNA（100 ng · μL-1）3.0 μL，MseI酶（10 U · μL-1）0.6 μL，
10 × 反应缓冲液 3.0 μL，在 37 ℃条件下酶切 2 h，之后在 80 ℃条件下保温 20 min终止反应。（2）
MseI 接头制备：取 MseI接头 1（100 pmol · L-1）和 MseI接头 2（100 pmol · L-1）各 62 μL，混均后
在 95 ℃水浴 5 min，取出后放在操作台上冷却 20 min，作为下步反应的 MseI接头。（3）连接：反
应总体积为 40 μL，包括 MseI酶切产物 30 μL，MseI接头 1 μL，10 × 反应缓冲液 2 μL，T4 DNA连
接酶（5 U · μL-1） 0.2 μL，双蒸水 6.8 μL，在 20 ℃条件下反应 5 h，产物作预扩增模板。（4）预扩
增：反应总体积为 30 μL，含预扩增模板 6 μL，Taq DNA聚合酶（5 U · μL-1）0.45 μL，SSR锚定引
物（10 μmol · L-1）1.5 μL，MseI选择性引物（10 μmol · L-1）1.5 μL，10 × PCR缓冲液 3.6 μL，10 mmol · L-1
dNTP 0.9 μL；PCR反应程序如下：94 ℃预变性 2 min，25个 PCR循环（94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s, 72 ℃
1 min）。（5）选择性扩增：10 μL反应体积，含选择性扩增模板 1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U · μL-1）
0.15 μL，加尾 SSR锚定引物（1 μmol · L-1） 0.6 μL，10 × PCR缓冲液 1.2 μL，10 mmol · L-1 dNTP 0.3
μL，M13荧光引物（0.1 μmol · L-1）0.5 μL；选择性扩增的 PCR程序为 94 ℃ 30 s，60 ℃（每个循环
下降 0.7 ℃）30 s，72 ℃ 1 min，循环 9次，再按 94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min循环 25次。
按此体系操作 16个菜薹材料预扩增产物在 300 ~ 900 bp区域呈明显的弥散带，表明预扩增效果
好；16个菜薹品种的选择性扩增结果显示MFLP荧光图谱清晰，多态性条带丰富可辨，表明该技术
体系适用于菜薹材料的基因分型。

关键词：菜薹；荧光MFLP；技术体系的建立
中图分类号：S 634.5 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）S-2541-01