全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (8) : 1239 - 1242
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 01 - 08; 修回日期 : 2009 - 06 - 22
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2006AA100109) ; 天津市科技计划项目 (07ZCKFNCO1200)3 E2mail: lix1401@ nankai1edu1cn; Tel: 13821814059
致谢 : 本项研究承蒙陈瑞阳教授多方指导 , 特此致谢 !
秋石斛同源四倍体诱导与鉴定
李秀兰 3 , 安　东
(南开大学生命科学学院 , 天津 300071)
摘 　要 : 为了创制秋石斛同源四倍体新种质 , 以秋石斛同株异花授粉种子为材料 , 用组织培养方法 ,
通过种子非共生萌发与原球茎诱导 , 在原球茎发育的原胚期 , 以低浓度混合诱变剂进行多倍体诱导。结果
用 0101%秋水仙素 + 5 mg·L - 1氨磺灵处理 8～10 d, 四倍体 (2n = 4X = 76) 诱变率达 90%以上 , 未发现嵌
合体。与二倍体对照比较 , 四倍体植株粗壮 , 叶色深绿 , 叶片宽厚。
关键词 : 秋石斛 ; 同源四倍体 ; 种子 ; 原球茎 ; 原胚期 ; 氨磺灵
中图分类号 : S 68212; Q 81311 + 2　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0821239204
Induction and Iden tif ica tion of Autotetraplo ids in D endrobium
L I Xiu2lan3 and AN Dong
(College of L ife Sciences, N ankai U niversity, T ian jin 300071, China)
Abstract: In this paper, the polyp loids were induced by low concentration of colchicin and oryzalin solu2
tion at early develop ing embryo in order to research and p roduce a new sort of germp lasm of autotetrap loid in
D end robium hybrida orchilds. During the p rocess, the cross2pollinated seeds in the same p lantwere utilized as
materials to obtain the PLB s through seed non2symbiotic germ ination and induction which app lied in the
p rocess of tissue culture. The results revealed that the rate of tetrap loid was over 90% when treated with
0101% colchicine and 5 mg·L - 1 oryzalin during 8 - 10 days. Moreover mosaic was not found in the doubling
materials in the whole experiment. Compared with dip loid, the tetrap loid p lantlets have always been more
stout, the leaf are dark green and wide2thick.
Key words: D endrobium hybrida; autotetrap loid; seed; p rotocorm2like body ( PLB ) ; early develo2
p ing embryo; oryzalin
秋石斛 (D endrobium hybrida) 为兰科石斛属多年生附生草本植物 , 以原产澳大利亚昆士兰地区
的蝴蝶石斛 (D. pha laenopsis Fitzg. ) 为主要亲本杂交而成 , 属蝴蝶石斛系 ( Phalaenopsis type) , 又
称蝶花型石斛兰 (中国林业科学研究院花卉研究与开发中心 , 2007)。秋石斛花期长 , 花姿优雅 , 花
多 , 枝长 , 目前主要以商业化切花和盆花生产为主 , 是石斛兰中最具观赏价值的种群。
石斛属是一个具有多倍性的属 (程式君 等 , 1985)。通常多倍化植物表现为根、茎、叶、花、
果实等器官的巨大性。四倍体可以直接育成稳定品种 , 同时也可以进行杂种优势利用 (李树贤 ,
2003)。李涵等 (2005) 用秋水仙素对二倍体齿瓣石斛 (D. devon ianum ) 试管丛生芽进行诱导 , 成功
获得了多倍体植株。目前有关秋石斛同源四倍体研究尚未见报道。作者以秋石斛系 ‘索尼亚 ’为材
料进行了多倍化诱导研究 , 报道如下。
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
1　材料与方法
111　材料
供试材料为秋石斛系的 ‘索尼亚 ’ (D. hybrida ‘Sonia’) , 购于三益集团山东兖州基地 , 栽种在
天津市蓟县本课题试验基地 (图版 , 1)。在秋石斛开花后 1～2周内进行同株异花授粉 , 授粉后 6个
月 (2005年 12月 16日 —2006年 6月 22日 ) 取下蒴果进行种子培养。
112　方法
11211　种子非共生萌发与原球茎诱导 　取蒴果果荚 , 先用流水冲洗干净 , 75%酒精表面擦拭 , 然后
75%酒精洗 30 s, 011% HgCl2表面消毒 6～8 m in, 无菌蒸馏水浸洗 3次。剖开果荚 , 种子接入 1 /2MS
液体培养基中 , 在 25 ℃条件下进行种子非共生萌发。避光培养 1周 , 然后转入光照培养 , 培养室每
天光照 12 h, 光强度 1 500 lx, 定期观察种子萌发情况。培养至 6周时转换一次培养基 , 即 1 /2MS +
蔗糖 25 g·L - 1 + 花宝 2号 (N ∶P ∶K = 20 ∶20 ∶20) 1 g·L - 1。种子一旦开始萌发 , 随时观察原球茎
发育状态 , 为下一步多倍体诱导提供最佳发育时期的原球茎材料。
11212　同源多倍体诱导 　取发育 4周、6周和 8周的种子原球茎 , 分别转入含秋水仙素 (0101% ) +氨
磺灵 (5 mg·L - 1 ) 的 1 /2MS液体培养基中 , 处理时间为 2、5、8和 10 d, 总共 12个处理 , 在
23～25 ℃条件下进行染色体加倍 , 然后将其转入不含任何诱变剂的新鲜 1 /2MS液体培养基中继续培养 ,
2周后统计其成活率 , 并进行编号。成活的原球茎经 4周培养以后 , 直接转入 MS +蔗糖 30 g·L - 1 +卡
拉胶 7 g·L - 1 +香蕉汁 100 g·L - 1 +活性碳 015 g·L - 1的固体培养基中 , 进行复壮和分化培养。
11213　染色体倍性鉴定 　每个处理均随机取样 50粒 (株 ) , 采用植物染色体标本制备的去壁低渗法
(陈瑞阳 等 , 1979) 进行倍性鉴定。
2　结果与分析
211　种子非共生萌发与原胚期原球茎的形成
秋石斛种子接种于 1 /2MS液体培养基中培养 2周后开始膨胀 , 4周时萌发率接近 100% (图版 ,
2)。秋石斛成熟种子在非共生萌发培养过程中除少数种胚不发育外 , 多数种胚都能发育 , 图版 2箭
头所示为种胚形成球形胚后 , 开始从种壳中脱落。球形胚发育到 6周 , 在显微镜下可以清晰地看到胚
细胞变大成为薄壁细胞 , 而且有部分球形胚表面伴有突起 (图版 , 3 ) , 但尚未分化。培养到 8周 ,
球形胚从种壳中完全脱落 , 成为裸露的绿色原球茎 , 但仍尚未分化 , 形成原胚期原球茎 (图版 , 4)。
212　原球茎发育时期与成活率
在相同的诱变处理条件下 , 原球茎成活率与原球茎发育时期密切相关 (表 1)。发育 4周的原球
茎诱变处理 2 d, 成活率为 42% , 诱变处理 5～10 d, 成活率为零 ; 发育 6周的原球茎 , 成活率在
46% ～100% ; 发育 8周的原球茎 , 成活率为 58% ～100%。因此 , 选择发育 6～8周的原球茎进行多
倍体诱变处理可以得到足够可供选择的群体。
213　原球茎发育时期与多倍体诱变频率
秋石斛多倍体诱变频率与原球茎发育时期密切相关 (表 1)。发育 4周的原球茎未能诱导成功多
倍体 , 发育 6周和 8周的原球茎都能诱导出多倍体。其中以发育 6周和 8周原球茎诱导 10 d的诱变频
率最高 , 同源四倍体频率达到 100%。
214　倍性鉴定与同源四倍体形态观察
鉴定结果表明 : 秋石斛二倍体对照植株为 2n = 2x = 38 (图版 , 5～7) , 同源四倍体植株为 2n = 4x
= 76 (图版 , 8～10)。与二倍体相比 , 同源四倍体植株外形粗壮 , 叶片增厚 , 叶色深绿 , 叶形和叶
片大小与二倍体有明显差异。四倍体的农艺性状表现出了多倍体典型的根、茎、叶的巨大性。
0421
　8期 李秀兰等 : 秋石斛同源四倍体诱导与鉴定 　
图版说明 : 1. 二倍体秋石斛花、蒴果 ( c) 和种子 ( s) ; 2. 培养 4周的萌发种子 (箭头所示为从种壳中脱落的球形胚 ) ; 3. 发育 6
周的原球茎 (箭头所示为种壳脱落原球茎 ) ; 4. 发育 8周原球茎 : ①加倍处理前的原球茎 , ②加倍处理后的原球茎 (箭头所示为白
化致死原球茎 ) ; 5. 二倍体瓶苗 ; 6. 二倍体移栽苗 ; 7. 二倍体染色体 , 2n = 2x = 38; 8. 四倍体瓶苗 ; 9. 四倍体移栽苗 ; 10. 四倍
体染色体 , 2n = 4x = 76。
Explana tion of pla tes: 11Flower, cap sule ( c) and seeds ( s) of dip loid D. hybrida ‘Sonia’; 21Seed germ inated by tissue culture at 4 weeks
( The arrow indicates spherical embryo fell from seed coat) ; 31The PLB s of developmental 6 weeks ( The arrow indicates that PLB s appear surface
p rojection) ; 41The PLB s of developmental 8 weeks: ①PLB s before doubling, ②PLB s after doubling ( The arrow indicates albino and dead
PLB s) ; 51Tissue2culture container seedling of dip loid control; 61D ip loid transp lants; 71D ip loid chromosomes, 2n = 2x = 38; 81Tissue2culture
container seedling of tetrap loids; 91Tetrap loids transp lants; 101Tetrap loid chromosomes, 2n = 4x = 76.
1421
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
表 1　0101%秋水仙素 + 5 m g·L - 1氨磺灵诱导秋石斛种子原球茎结果
Table 1　The results of those PL Bs induced by colch ic in ( 0101%) and oryza lin ( 5 m g·L - 1 ) solution in d ifferen t tim es
原球茎萌发时间 /w
Development
time of PLB s
加倍时间 / d
Doubling times
接种数
PLB numbers
成活数
A live numbers
成活率 /%
A live rate
同源四倍体数
Autotetrap loid
numbers
同源四倍体诱变率 /%
Rate induced
autotetrap loids
4 2 50 21 42 0 0
5 50 0 0 0 0
8 50 0 0 0 0
10 50 0 0 0 0
6 2 50 50 100 0 0
5 50 41 82 26 6314
8 50 31 62 29 9315
10 50 23 46 23 10010
8 2 50 50 100 0 0
5 50 50 100 9 1810
8 50 45 90 41 9111
10 50 29 58 29 10010
3　讨论
利用原球茎进行多倍体诱变是获得兰科植物多倍体新种质的有效途径。以兰花原球茎为材料进行
多倍体诱导国内外已有报道 ( Kim et al. , 1997; Kim & Kim, 2003; 邓樱 等 , 2008) , 但采用原胚期
原球茎进行秋石斛多倍体诱导尚未见报道。本项研究在原球茎分化的初期进行多倍体诱导 , 由于加倍
的都是处于尚未分化的母细胞阶段的原始细胞 , 加倍后原胚继续生长 , 发育成多倍体原球茎 , 由多倍
体原球茎再分化成多倍体幼苗 , 因此 , 一旦加倍成功 , 可以获得足够数量的多倍体群体 , 以满足选种
的需要。这是以种子和生长点进行多倍体诱变方法无法达到的。
References
Chen Rui2yang, SongW en2qin, L i Xiu2lan. 1979. A new method for p reparing m itotic cheomosomes from p lant. Acta Botanica Sinica, 21 (3) :
297 - 298. ( in Chinese)
陈瑞阳 , 宋文芹 , 李秀兰. 1979. 植物有丝分裂染色体标本制作的新方法. 植物学报 , 21 (3) : 297 - 298.
Cheng Shi2jun, Hu Zhi2heng, L i Xiu2lan, Chen Rui2yang. 1985. A p relim inary study on the chromosomes of D endrobium in China. Acta
Horticulturae Sinica, 12 (2) : 119 - 124. ( in Chinese)
程式君 , 胡志衡 , 李秀兰 , 陈瑞阳. 1985. 国产石斛属染色体研究初报. 园艺学报 , 12 (2) : 119 - 124.
Deng Ying, Zhou Ye, Chen J i2m in. 2008. Methods of polyp loid induction of Cym bidium with colchicine. Subtrop ical Plant Science, 37 ( 2) :
38 - 40. ( in Chinese)
邓　樱 , 周　晔 , 陈继敏. 2008. 秋水仙素诱导兰属 ‘素心黄’多倍体的方法研究. 亚热带植物科学 , 37 (2) : 38 - 40.
Flower Research and Development Center, Chinese Academy of Forestry. 2007. D endrobium. Beijing: Chinese Forestry Publishing House. ( in
Chinese)
中国林业科学研究院花卉研究与开发中心. 2007. 石斛兰. 北京 : 中国林业出版社.
Kim M, Kim Jae2Yeong. 2003. Chromosome doubling of a Cym bidium hybrid with colchicine treatment in meristem culture. Proceedings of
N IOC: 37 - 40.
Kim M S, Won J Y, Song C H, Eun J S, Lee D W. 1997. Polyp loidy induction of Cym bidium kanran by treatment of colchicine in vitro. Journal
of Horticulture Science, 39 (1) : 73 - 76.
L i Han, Zheng Si2xiang, Long Chun2lin. 2005. Induction of polyp loid of D endrobium devonianum. Acta Botanica Yunnanica, 27 (5) : 552 -
556. ( in Chinese)
李　涵 , 郑思乡 , 龙春林. 2005. 齿瓣石斛多倍体的诱导初报. 云南植物研究 , 27 (5) : 552 - 556.
L i Shu2xian. 2003. Several p roblem s on autopolyp loid breeding in p lants. Acta Bot Boreali2Occident Sin, 23 (10) : 1829 - 1841. ( in Chinese)
李树贤. 2003. 植物同源多倍体育种的几个问题. 西北植物学报 , 23 (10) : 1829 - 1841.
2421