全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (1) : 73 - 80
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 07 - 18; 修回日期 : 2008 - 10 - 13
基金项目 : 福建省自然科学基金项目 (2007J0055) ; 福建省教育厅项目 (JB04307)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: fjyifei@yahoo1com1cn)
观赏向日葵花青素苷合成途径同源基因的克隆与表
达
张剑亮 1, 2 , 潘大仁 1 , 周以飞 13 , 王占成 1 , 华树妹 1 , 侯黎丽 1 , 随粉粉 1
(1 福建农林大学作物科学学院 , 福州 350002; 2 广东省农业科学院作物研究所 , 广州 510640)
摘 　要 : 根据已发布的基因保守区域设计引物 , 从观赏向日葵 (Helian thus annuus L. ) 舌状花中克隆
到花青素苷生物合成途径中 PAL、CHS、CH I、F3′H、D FR和 AN S等 6个结构基因的保守序列 , 序列分析表
明这 6个结构基因与其它植物来源的花青素苷生物合成相关基因均具有较高的同源性 , 分别为 95% ～
97%、83% ～99%、64% ～80%、80% ～82%、64% ～85%和 87% ～89%。系统进化分析表明 6个结构基
因的系统进化基本上符合植物分类学分类。半定量 RT2PCR分析表明 , 除 CHS基因在管状花中未表达外 , 6
个基因在舌状花、管状花、花蕾、叶片和茎皮中均有表达 ; 大部分基因在花开放初期和盛期的表达较高 ,
而花完全开放后 , 所有基因的表达量降低 ; 观赏向日葵花青素苷合成相关基因的表达量在紫红色花瓣中高
于红褐色花瓣 , 深色花瓣高于混杂色花瓣。
关键词 : 观赏向日葵 ; 花青素苷 ; 克隆 ; 基因表达
中图分类号 : S 681　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2009) 0120073208
C lon ing and Expression of Genes Involved in An thocyan in s Syn thesis in
O rnam en ta l Sunflower
ZHANG J ian2liang1, 2 , PAN Da2ren1 , ZHOU Yi2fei13 , WANG Zhan2cheng1 , HUA Shu2mei1 , HOU L i2li1 ,
and SU I Fen2fen1
(1 College of C rop Science, Fujian A griculture and Forestry U niversity, Fuzhou 350002, Ch ina; 2 C rop R esearch Institu te, Guang2
dong A cadem y of A gricu ltura l Science, Guangzhou 510640, China)
Abstract: Six structural genes ( PAL, CHS, CH I, F3′H, D FR, AN S ) involved in anthocyanins synthesis
were cloned from the ray florets of ornamental sunflower (Helian thus annuus L. ) by homology sequence clo2
ning. Sequence analysis showed that these genes shared high sim ilarity with genes from other p lants, ranging
from 95% - 97% , 83% - 99% , 64% - 80% , 80% - 82% , 64% - 85% and 87% - 89% , respectively. The
results of phylogenetic analysis were in agreement with that described in p lant taxonomy. Sem i2quantitative
RT2PCR indicated that the transcrip ts of all six genes were detected in ray florets, tubular florets, buds, leav2
es, and barks excep t that the transcrip t of CHS was not detected in tubular florets. Exp ression levels of most
structural genes were higher in first florescence and full bloom periods and then decreased. The transcrip ts of
these genes were higher in purp le petals than in chocolate petals, and higher in petalwith deep color than with
multi2color.
Key words: ornamental sunflower; anthocyanin; cloning; gene exp ression
观赏向日葵 (Helian thus annuus L. ) 因其花色变异丰富 , 近些年来逐渐受到我国消费者的喜爱 ,
但其复杂的花色形成的分子机理研究甚少。
目前人们对花青素苷 ( anthocyanins) 的生物合成途径已有详细的研究 , 该途径中几乎所有的基
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
因包括一些调节基因均已被分离 (Holton & Cornish, 1995; 张剑亮 等 , 2008)。
花青素苷在色素形成过程中的合成主要是通过该途径中相关酶基因转录的增加所致。主要有两类
基因参与调控花青素苷的生物合成 , 其中一类就是结构基因直接调控花青素苷和其它类黄酮物质的形
成。因此花青素苷生物合成相关结构基因的转录调控对于植物花色的形成也起到重要的调控作用
( Farzad et al. , 2003)。
本研究中克隆了观赏向日葵花青素苷生物合成途径中苯丙氨酸解氨酶基因 ( PAL )、查尔酮合成
酶基因 (CHS )、查尔酮异构酶基因 (CH I)、黄烷酮 3′- 还原酶基因 ( F3′H )、二氢黄酮醇 4 - 还原
酶基因 (D FR ) 和花青素苷合成酶基因 (ANS ) 等 6个结构基因的保守序列 , 并利用半定量 RT2PCR
检测不同器官、花发育过程以及不同颜色花瓣花青素苷生物合成相关基因的表达量。这对于了解观赏
向日葵花瓣着色的机理具有重要的理论意义 , 也为今后利用基因工程技术改变花色、培育新的花色品
种、提高花卉品质奠定基础和提供技术支撑。
1　材料与方法
111　材料
以观赏向日葵 ‘R ing of Fire’(舌状花外围浅黄色 , 内部紫红色 , 深色管状花 )、‘Mouling Rouge’
(舌状花紫红色 , 深色管状花 )、‘Autumn Beauty’ (舌状花深红褐色 , 深色管状花 )、‘Joker’ (舌状
花外围黄色 , 内部红褐色 , 深色管状花 )、‘ Ikarus’ (舌状花黄色 , 深色管状花 ) 5个品种为供试材
料 (图 1)。
供试材料由本实验室保存。2007年 7月将供试材料播种在福建农林大学作物科学学院标本园 ,
栽培管理同大田生产。
图 1　不同花色观赏向日葵
F ig. 1　The ornam en ta l sunflower w ith d ifferen t ray flora l colors
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　1期 张剑亮等 : 观赏向日葵花青素苷合成途径同源基因的克隆与表达 　
112　引物设计
根据花青素苷合成相关基因在其他物种中共有的氨基酸保守序列设计相应的特异或简并引物 , 引
物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 , 引物序列如表 1。
表 1　用于扩增的引物
Table 1　Pr im ers used in am plif ica tion
目的基因
Target gene
引物编号
Primer code
引物序列
Sequence of p rimer
目的基因
Target gene
引物编号
Primer code
引物序列
Sequence of p rimer
PAL PAL2F 5′2ACGTGGATCCCAYGGIGGIAAYTTYCARGG23′ CHS CHS2F 5′2TCCCAACATGTGTGC23′
PAL2R 5′2ACGTGGATCCACRTCYTGRTTRTGYTGYTC23′ CHS2R 5′2GCCTTGTTGGTACAT23′
D FR DFR2F 5′2CAAAGGATCCGAGAATGAAGTRATHAARCC23′ CH I CH I2F 5′2GGTGTGAGAGGTATGGAAAT23′
DFR2R 5′2AGAAGGATCCAAAATACATCCATCCNGTCAT23′ CH I2R 5′2AGTCTTGATGCCAAACTTTG23′
ANS Ans2F 5′2TSCAAAW GAAGATMAACTACTACCCMA23′ F3′H F3′H2F 5′2TATTCGCCAGGAGGAGGTT23′
Ans2R 5′2CARAARACAGCCCAW GAAAYCCTIACC23′ F3′H2R 5′2TCGGCAAGGATAGTGGTGT23′
　　注 : Y = T + C; R =A + G; W =A + T; N =A + T + G + C; H =A + T + C; D =A + G + T; I =次黄嘌呤。
Note: Y = T + C; R =A + G; W =A + T; N =A + T + G + C; H =A + T + C; D =A + G + T; I = Inosine.
113　RNA提取和 cD NA第一链合成
分别以 ‘R ing of Fire’品种舌状花、管状花、花蕾、叶片和茎皮 5种器官 ; 蕾期、始花期、盛花
期、凋谢期 4个时期 ; ‘R ing of Fire’、‘Mouling Rouge’、‘Autumn Beauty’、‘Joker’、‘ Ikarus’5个
花色品种盛花期的舌状花花瓣为材料 , 采用 TR Izol Reagent ( Invitrigen公司 ) 法提取总 RNA。加 DNase
于 37 ℃消除 DNA后以 500μg总 RNA作为反应模板 , 参照 PrimeScrip tTM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit
( TaKaRa公司 ) 操作说明书合成 cDNA第一链。
114　花青素苷生物合成相关基因的克隆
以 cDNA第一链产物为模板 , PAL、CH I、F3′H、D FR和 AN S基因 PCR扩增反应条件为 94 ℃ 5
m in; 94 ℃ 50 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 m in, 35个循环 , CHS基因扩增反应的退火温度为 48 ℃。利用
DNAMAN和 NCB I网站进行序列分析。
115　半定量 RT2PCR表达分析
根据所获得的 PAL、CHS、CH I、F3′H、D FR和 AN S基因片段设计特异引物 (表 2) , 并以向日葵
看家基因β2actin ( GenBank登录号 : AF282624) 作为内参 , 设计内参引物。PCR反应的扩增条件为
94 ℃ 5 m in; 94 ℃ 50 s, 60 ℃ 50 s, 72 ℃ 1 m in, 28个循环。
表 2　用于半定量 RT2PCR的引物
Table 2　Pr im ers used in sem i2quan tita tive RT2PCR
目的基因
Target gene
引物编号
Primer code
引物序列
Sequence of p rimer
目的基因
Target gene
引物编号
Primer code
引物序列
Sequence of p rimer
PAL PAL2F 5′2GGAGTTTCTATGGACAACACACG23′ F3′H F3′H2F 5′2GATTCGCCAGGAGGAGGTT23′
PAL2R 5′2CCACATCTTGGTTATGCTGCT23′ F3′H2R 5′2CGGCAAGGATAGTGGTGTTG23′
CHS CHS2F 5′2AATGCCACGTCCTTAGACGATA23′ D FR DFR2F 5′2CAAAGGATCCGAGAATGAAGTG23′
CHS2R 5′2CATCATAAACCGCTTGACCG23′ DFR2R 5′2AGAAGGATCCAAAATACATCCATCC23′
CH I CH I2F 5′2GGTGTGAGAGGTATGGAAAT23′ ANS Ans2F 5′2TGCAAAAGAAGATCAACTACTACCC23′
CH I2R 5′2AGTCTTGATGCCAAACTTTG23′ Ans2R 5′2GAAGACAGCCCAAGAAACCC23′
β2actin Actin2F 5′2CCTATTGAACACGGTATTGTCAGC23′
Action2R 5′2CTCTCTGCTCCGATTGTGATAACT23′
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2　结果与分析
211　观赏向日葵花瓣总 RNA的提取
舌状花的总 RNA经 P IPES电泳检测呈现出 3条清晰可区分的条带 (图 2) , 表明 RNA基本上未
降解。
经紫外分光光度计检测 , RNA样品 A260 /A280的比值介于 118～210之间 , 据此认为 RNA中蛋
白质或者其他有机物的污染可以忽略。
因此 , 可以选取这些 RNA样品作为反转录模板。
图 2　观赏向日葵花瓣总 RNA电泳
F ig. 2　Electrophoresis of tota l RNA of peta l of ornam en ta l sunflower
212　观赏向日葵花青素苷合成相关酶基因的克隆与分析
根据已发布的花青素苷生物合成相关基因的保守区域设计了特异引物或简并引物 , 以观赏向日葵
‘R ing of Fire’舌状花的 cDNA为模板进行 PCR扩增 , 获得了 PAL、CHS、CH I、F3′H、D FR 和 AN S
等 6个结构基因的保守序列 , 其核苷酸长度分别为 303、232、527、686、227和 286 bp, 分别编码
100、76、175、228、75、94个氨基酸。
序列同源性和多重比较分析表明 , 6个结构基因与其它植物来源的结构基因均具有较高的同源
性。PAL蛋白与苯丙氨酸解氨酶 /组氨酸解氨酶 , CHS与 Ⅲ型聚酮合成酶 , F3′H与细胞色素 P450,
ANS与异青霉素 N合成酶及相关双加氧酶等蛋白质家族的保守结构域均有较高的同源性。PAL中含
有 1个由 5个氨基酸组成的催化活性位点 (HNQDV ) ; CHS中含有对查尔酮合成酶必需的保守氨基酸
位点 , 即 T132和 M137袋状环化位点以及 1个包括 S133在内的袋状桂皮酰结合位点 ; ANS与其他物
种的 ANS氨基酸均存在 1个保守基序 [L (V) GVEAHTDVS] , 该基序中含有 1个保守的组氨酸以结
合金属离子 ; CH I、F3′H和 DFR中均未找到相应的活性位点或保守基序。
通过软件 DNAMAN 610绘制观赏向日葵与菊花 (Chrysan them um )、非洲菊 (Gerbera hybrid )、大
豆 (Glycine m ax)、葡萄 (V itis vin ifera)、拟南芥 (A rabidopsis tha liana)、金鱼草 (A ntirrh inum m ajus)、
苹果 (M alus)、圆叶牵牛 ( Ipom oea purpurea)、水稻 (O ryza sa tiva)、玉米 ( Zea m ays)、小麦 ( Triti2
cum aestivum ) 等植物 6个结构基因的进化树聚类图。
从图 3可以看出 , 大部分基因的进化基本符合植物分类学分类 , 即单子叶和双子叶植物分属于各
自的聚类簇 ; 观赏向日葵与同为菊科的菊花或非洲菊为同一组 , 其亲缘关系较近。PAL基因中双子叶
植物与单子叶植物在 90%的相似系数时归为两类。CHS基因在 90%相似系数下圆叶牵牛与单子叶植
物各归属于一类 , 其余物种 CHS 基因的亲缘关系较近。CH I、F3′H和 D FR 基因的进化规律较为相
近。AN S基因的系统进化则依据单子叶植物和双子叶植物分属于两个聚类簇。
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213　观赏向日葵花青素苷生物合成相关基因的表达
21311　在不同器官中的表达 　
图 4表明 , 6个结构基因在舌状花、管状花、花蕾、叶片和茎皮上均有表达。其中大部分基因在
舌状花、管状花与花蕾中的表达量较高 , 其中在花蕾中的表达最高 , 而在叶片和茎皮中的表达较低。
CHS基因在管状花中未检测到表达。
21312　在花发育过程中的表达 　
图 5表明 , PAL、CHS和 F3′H在始花期表达量最高 , 凋谢期的表达量最低 ; CHS基因在蕾期未
检测到其表达。CH I基因在始花期和盛花期的表达较高。D FR基因在蕾期的表达就比较高 , 但在盛花
期和凋谢期未检测到其表达。AN S基因在蕾期的表达较低 , 在始花期和盛花期表达量逐渐增加 , 凋谢
期表达量有所降低。
214　在不同颜色花瓣中的表达
图 6表明 , PAL基因在 5个品种的舌状花中的表达量均较高。
CHS基因在 ‘Joker’和 ‘R ing of Fire’品种的舌状花中表达量较低 , 而在 ‘ Ikarus’品种中未检
测到其表达。
CH I基因除在舌状花为紫红色的 ‘Mouling Rouge’和舌状花为红褐色的 ‘Autumn Beauty’中表
达外 , 在其余 3个品种中未检测到其表达。
F3′H基因在 ‘Mouling Rouge’中的表达量最高 , 在 ‘R ing of Fire’和 ‘Autumn Beauty’中的表
达量较低 , 但在 ‘Joker’和 ‘ Ikarus’两个品种的舌状花中未检测到其表达。
D FR基因在 ‘R ing of Fire’、‘Mouling Rouge’和 ‘Autumn Beauty’中表达 , 而在 ‘Joker’和
‘ Ikarus’两个品种中未检测到其表达。
AN S基因在 ‘Mouling Rouge’和 ‘Autumn Beauty’品种中具有较高的表达量 , 在 ‘R ing of Fire’
和 ‘Joker’中的表达量较低 , 在 ‘ Ikarus’中表达量最低。
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图 6　不同颜色观赏向日葵花瓣中 PAL、CHS、CH I、F3′H、D FR和 ANS的表达
F ig. 6　Expression of PAL , CHS, CH I, F3′H , D FR and ANS in ray floret
w ith d ifferen t color from ornam en ta l sunflower
1: ‘R ing of Fire’; 2: ‘Mouling Rouge’; 3: ‘Autumn Beauty’; 4: ‘Joker’; 5: ‘Ikarus’.
3　讨论
311　观赏向日葵花青素苷生物合成相关基因的克隆
花青素苷生物合成需要的结构基因可分为两类 : 一类是在前期阶段表达的早期合成基因 , 包括
PAL、CHS、CH I; 另一类是在后期阶段表达的晚期合成基因 , 如 D FR、AN S、U F3GT等。本研究中从
观赏向日葵品种 ‘R ing of Fire’舌状花分离到 PAL ( GenBank登录号 : EF566469)、CHS、CH I ( Gen2
Bank 登 录 号 : EU366166 )、 F3′H ( GenBank 登 录 号 : EU366167 )、D FR ( GenBank 登 录 号 :
EF492066) 和 AN S ( GenBank登录号 : DQ884194) 等 6个结构基因的保守序列。这 6个结构基因与
其它植物来源的花青素苷生物合成相关基因均具有较高的同源性 , 其系统进化基本上符合植物分类学
分类。从 6个基因系统发育树的相似系数看出 , 除 CH I外的 2个上游基因 ( PAL、CHS ) 的进化速率
要低于 3个下游基因 ( F3′H、D FR、AN S ) , 证实了 Rausher等 (1999) 提出的 “花青素苷代谢途径
中上游基因的进化要慢于下游基因 ”的观点。这可能是由于上游基因参与了多种类黄酮化合物包括
花青素苷的合成 , 而下游基因仅仅调控花青素苷的合成 , 从而促使下游基因的选择约束要大于上游基
因 ( Sakuda, 2000; Lu & Rausher, 2003)。
312　观赏向日葵花青素苷生物合成相关基因的表达
花青素苷合成相关基因在同一植物不同器官中的表达不同。D FR 在圆叶牵牛的茎、萼片、叶片
和幼嫩花芽均有表达 ( Inagaki et al. , 1999)。而金鱼草 CHS基因在花组织以外的其他部位没有发现
其表达 (Martin & Gerats, 1993)。观赏向日葵花青素苷代谢途径中 6个结构基因的表达没有器官特异
性 , 但在不同器官的表达量不同。观赏向日葵花发育的不同时期花青素苷合成相关基因的表达量也不
同。大部分基因在花开放初期和盛期的表达较高 ; 花完全开放后 , 所有基因的转录水平均降低。这与
金鱼草、矮牵牛、苹果花瓣中花青素苷合成相关酶基因表达趋势相似 ( Katz & W eiss, 1998; W eiss,
2000)。
观赏向日葵不同颜色花瓣花青素苷合成相关基因的表达分析表明 , 作为上游基因之一的 PAL基
因即使在具浅色花瓣的品种中亦有较高的表达 , 这是由于 PAL是包括花青素苷在内多种化合物代谢
途径的起始点 , 并不是控制花青素苷合成的惟一关键酶基因 ( Given et al. , 1998)。因此 PAL基因在
观赏向日葵花瓣中的高表达并不能真实反应出花色的分子差异机理所在。CH I基因除在红褐色花瓣中
具有较高的表达外 , 在其它颜色的花瓣中很低 , 甚至无法检测到其表达 , 但即使完全缺失 CH I酶活
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性植株仍有花青素苷的积累 , 这可能是由于查尔酮能发生非酶促异构化 ( Forkmann & Dangelmayr,
1980)。因此 CH I对花青素苷的合成也不是必需的。F3′H基因在紫色系列品种花瓣中的表达分别高于
红色系列品种花瓣。这是由于代谢途径为从柚皮素 ( naringenin) 出发经 F3H、F3′H到 D FR 的方向
进行时 , 终产物为矢车菊素 (蓝色 /紫色 ) , 而当 F3′H突变或失活时则生成天竺葵素 (红色 ) ( Zufall
& Rausher, 2003)。而作为观赏向日葵花青素苷生物合成途径后期阶段表达的生物合成基因 D FR和
AN S基因的表达与花瓣颜色存在一定的关系。D FR和 AN S基因在深色花瓣中的表达均高于混杂色的
花瓣 , 说明 D FR和 AN S对观赏向日葵花色的深浅起到重要调控作用。此外 , F3′H、D FR和 ANS在黄
色品种中均未表达。张圆圆等 (2008) 在黄色向日葵舌状花花瓣中未检测到花青素苷类化合物 , 认
为矢车菊类花青素苷是红色观赏向日葵舌状花呈现红色的化学基础。这再次表明 F3′H、D FR和 AN S
基因调控观赏向日葵舌状花中花青素苷类化合物的积累。
植物花色差异是花青素苷生物合成相关基因的调控位点、调节基因以及环境因素共同作用的结
果。本研究主要针对花青素苷代谢途径中 6个结构基因对花色的调控开展研究 , 初步探讨了观赏向日
葵花色形成的分子机理。今后还有待于从花青素苷合成途径中的其他结构基因、调节基因以及环境因
素等方面进一步研究观赏向日葵花青素苷生物合成的调控机理 , 从而阐明观赏向日葵花色形成的分子
机理。
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