全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2010 37 4 661 668
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–09–22；修回日期：2010–03–23
基金项目：‘973’计划项目（2009CB119000）；国家自然科学基金项目（30671352，30200179）；浙江省自然科学基金杰出青年团队项
目（R307396）；教育部霍英东教育基金会高等院校青年教师基金项目（101032）
番茄子叶总蛋白双向电泳体系的建立
黎 飞1，徐秋芳1，臧宪朋1，赖亿玉1，程维舜1，徐幼平2,*，蔡新忠1,*
（1浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所，杭州 310029；2浙江大学分析测试中心，杭州 310029）
摘 要：通过对 IPG 胶条梯度、上样方式、上样量、聚焦条件等 4 方面条件的优化，建立了番茄子
叶总蛋白双向电泳体系，即采用 TCA 丙酮沉淀法提取番茄子叶总蛋白，选用 24 cm pH3-7NL 的 IPG 胶条，
采用水化上样，上样量 300 μg，按聚焦程序Ⅰ或Ⅱ聚焦后进行双向电泳分离和银染染色。若采用制备胶，
以获取高含量蛋白点，则将上样量提高至 1.5 mg，按聚焦程序Ⅲ进行聚焦后进行双向分离，并采用胶体
考马斯亮蓝染色。采用该优化的体系可以获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。
关键词：番茄；双向电泳；条件优化；子叶；蛋白质
中图分类号：S 641.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）04-0661-08

Establishment of Two-dimensional Electrophoresis System of Tomato
Cotyledons
LI Fei1，XU Qiu-fang1，ZANG Xian-peng1，LAI Yi-yu1，CHENG Wei-shun1，XU You-ping2,*，and CAI
Xin-zhong1,*
（1Institute of Biotechnology，College of Agriculture and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China；
2Centre of Analysis and Measurement，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China）
Abstract：A two-dimensional electrophoresis（2-DE）system for proteomic analysis of tomato
cotyledons was established by optimizing the parameters including the pH gradient of IPG strip，sample
application，sample loading and isoelectric focusing conditions. The optimized system include the
following steps：Extracting the total protein from tomato cotyledons by TCA/acetone precipitation，
separating the proteins with 24 cm pH3-7NL IPG strips，loading protein samples of 300 μg by rehydration
method followed by isoelectric focusing programⅠorⅡ，and staining the gels by silver staining after
SDS-PAGE electrophoresis. When preparative gel was applied，in order to obtain abundant protein spots，
1.5 mg sample was loaded followed by the isoelectric focusing program Ⅲ，and staining with colloidal
Coomassie Brilliant Blue. Reproducible profiles with high resolution were obtained by this optimized
2-DE system of tomato cotyledon.
Key words：tomato；two-dimensional electrophoresis（2-DE）；condition optimization；cotyledon；
protein

蛋白质组学分析是后基因组时代分析生物学功能的重要技术手段。建立一套重复性好和分辨率

﹡ 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ypxu@zju. edu. cn；xzhcai@zju. edu. cn）
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高的双向电泳体系是成功开展蛋白质组学分析的基础。由于植物、动物或微生物等研究对象的蛋白
质组成成分千差万别，即使是来自同一物种的不同类型，甚至同一个体的不同组织，其蛋白质组成
也存在较大差异，因此套用常规实验程序有可能得不到满意结果。对于每一种样品的蛋白质组学研
究而言，建立一套重复性好和分辨率高的双向电泳体系是取得实验成功的必要步骤。
双向电泳的分析流程主要包括样品制备、第一向等电聚焦、第二向 SDS-PAGE 分离、凝胶染色、
图像采集和分析等基本步骤。要获得较好的重复性和分辨率，除了成功的样品制备外，胶条选择、
上样方式、上样量的控制、聚焦条件、染色方法等很多方面都影响结果。这些因素最后综合体现在
凝胶图谱上。任何一个环节出现问题都无法得到满意的凝胶图谱。因此，对于每一种样品，为了获
取最佳的电泳结果，需确定每一个特定的条件组合，建立一套稳定的高分辨率的双向电泳体系。
目前已经采用蛋白质组学研究的番茄器官有叶片（Corpillo et al.，2004；Saravanan & Rose，2004）、
种胚（Sheoran et al.，2005）、果实（Casado-Vela et al.，2005；Rocco et al.，2006）、花粉（Sheoran et
al.，2007，2009）及根（Ahsan et al.，2007；Li et al.，2008），但对子叶尚未有相关研究。对于番茄
叶片的蛋白质组学研究，目前主要是采用 TCA/丙酮沉淀法提取叶片总蛋白，并采用 13 cm 或 17 cm
的 IPG 胶条进行双向分离，24 cm 胶条的双向电泳分离体系还未见报道。TCA/丙酮沉淀是一种提取
植物总蛋白的有效方法（Jacobs et al.，2001），可以有效去除内源性的离子性小分子，如核苷、代谢
产物、磷脂等。Corpillo 等（2004）利用 TCA/丙酮沉淀法提取转基因的抗病毒番茄苗叶片总蛋白后，
采用 13 cm pH3-10 的 IPG 胶条，150 μg 上样量进行水化上样，双向分离后蛋白主要集中在酸性和中
性区域，碱性区域的蛋白点很少。虽然其文中没有写明检测到的蛋白点数，但从 2D 图谱上看分离
效果并不是特别理想。Saravanan和Rose（2004）利用TCA/丙酮沉淀法提取番茄叶片后用17 cm pH4-7
的 IPG 胶条进行双向电泳分离，通过考马斯亮蓝得到 822 个蛋白点，但分离的图谱中横条纹明显。
在借鉴 Corpillo 等（2004）及 Saravanan 和 Rose（2004）结果的基础上，本试验中采用 24 cm 的 IPG
胶条，对双向电泳的 IPG 胶条选择、上样方式、上样量、等电聚焦参数等条件进行了优化，以期得
到更为理想的适于番茄子叶总蛋白的操作体系。
1 材料与方法
1.1 材料
采用携带 Cf-9 基因的‘Moneymaker’番茄种子放于垫有湿润滤纸的培养皿中，28 ℃黑暗催芽
2 ~ 4 d，将露白的种子播于营养基质中，置于人工气候箱（RXZ-300D，宁波江南仪器厂），24 ℃、
16 h/8 h 光/暗周期、70%湿度条件下培养。番茄子叶出土后约一周，两片子叶完全伸长而未长出真
叶时取子叶，迅速用液氮冷冻，保存于–70℃以备蛋白提取所用。
1.2 仪器和试剂
24 cm IPG 胶条（pH3-11NL、pH3-7NL、pH7-11NL），Ettan IPGphorⅡ isoelectric focusing system，
manifold 胶条槽，Ettan DALT six 电泳系统，ImageScannerⅡ扫描仪，ImageMaster 2D platinum 6.0
分析软件均购自 GE healthcare。
1.3 双向电泳
番茄子叶总蛋白提取采用TCA/丙酮沉淀法（Damerval et al.，1986；Jacobs et al.，2001），并作
了一定改进。具体方法如下：取 0.5 ~ 1.0 g番茄子叶，液氮充分研磨。加入 30 mL 预冷的含 10% TCA、
0.07% DTT或巯基乙醇的丙酮，充分混匀后，-20 ℃沉淀过夜。35 000 × g离心 1 h，弃上清液。加
4 期 黎 飞等：番茄子叶总蛋白双向电泳体系的建立 663
入 30 mL预冷的含 0.07%DTT或巯基乙醇的丙酮，充分混匀后置于–20 ℃ 1 h。4 ℃，35 000 × g离
心 1 h，弃上清液，重悬沉淀于含 0.07%DTT或巯基乙醇的丙酮后离心，冷冻干燥。放–70 ℃或直
接进行下一步提取。按 20 μL · mg-1的比例加入样品裂解液溶解样品干粉，放于 30 ℃水浴 1 h，不断
振荡，涡旋，充分溶解蛋白。4 ℃，40 000 × g离心 1 h，取上清液，定量，分装后存放于–70 ℃或
直接进行电泳。
番茄子叶总蛋白定量采用Bradford法（Bradford，1976）。并适当修改：分别在两组离心管中各
加入 0.5 mg · mL-1牛血清蛋白BSA（5、10、15、20 μL），以 0.15 mmol · L-1 NaCl补足至 100 μL。同
时以两管 100 μL的 0.15 mmol · L-1NaCl作空白对照。每管各加入 1 mL Bradford工作液，振荡混匀，
室温放置 2 min。用 1 cm光径的微量比色杯测A595 吸光值，在 2 min后 1 h内完成测定。取A595 吸
光值对标准蛋白浓度作图，绘制标准曲线，并测量待测样品的A595 吸光值。从BSA标准曲线中确定
待测样品的浓度。
第一向等电聚焦（Isoelectric focusing，IEF）在Ettan IPGphorⅡIEF等电聚焦仪（GE Healthcare）
上完成。等电聚焦的样品通过水化上样方式或杯上样方式加样。对于水化上样，胶条用水化液（7
mol · L-1尿素，2 mol · L-1硫脲，2% CHAPS，0.2% Bio-Lyte pH4-7 和pH3-10，40 mmol · L-1 DTT，0.001%
溴酚蓝）补足 450 μL，加入水化槽后室温水化 12 h。水化结束后在 20 ℃条件下设定聚焦程序后进
行等电聚焦。对于杯上样，则用 450 μL水化液室温水化胶条 12 h，然后进行等电聚焦，聚焦时利用
样品杯加样。等电聚焦结束后，胶条进行两步平衡。第一步：向平衡缓冲液母液（6 mol · L-1尿素，
75 mmol · L-1 Tris-HCl pH 8.8，29.3%甘油，2% SDS，0.002%溴酚蓝）中加入 1%二硫苏糖醇（即平
衡缓冲液Ⅰ），置于振荡仪上振荡 15 min，倒掉平衡缓冲液Ⅰ。第二步：向平衡缓冲液母液中加入
2.5%碘乙酰胺（即平衡缓冲液Ⅱ），振荡 15 min后倒掉平衡缓冲液Ⅱ。
水化上样方法：蛋白样品用水化上样缓冲液补足 450 μL，沿着水化盘槽的边缘至左而右线性加
入样品。去除预制 IPG 胶条上的保护层，轻轻地将 IPG 胶条胶面朝下置于水化盘中的样品溶液上，
用覆盖油覆盖，胶条泡胀 12 h 后，将 IPG 胶条转移至 Manifold 胶条槽。用去离子水将预制好的电
极滤纸片湿润，置于 IPG 胶条的末端。安装电极。设定程序参数并开始运行。
杯上样方法：取 450 μL 水化上样缓冲液，沿着水化盘槽的边缘至左而右线性加入水化槽。胶条
胶面朝下置于水化槽中水化液之上，用覆盖油覆盖，泡胀 12 h 后，将 IPG 胶条转移至 Manifold 胶
条槽。将样本杯安装在合适的位置，并固定在胶条槽的底部。用去离子水将预制好的电极滤纸片湿
润，然后吸取水分直到接近干燥后，置于 IPG 胶条的末端。将蛋白样品用水化液补足 150 μL 加入
样品杯中，并用覆盖油完全覆盖样品。安装电极。设定程序参数并开始运行。
聚焦程序：24 cm pH3-11NL 的 IPG 胶条的聚焦程序根据操作手册《2-D Electrophoresis principle
and methods》设定，并作了一些修改，按 100 V 1 h，250 V 1 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 3 h，
之后采用 8 000 V 56 000 Vhs（聚焦程序Ⅰ），或 8 000 V 68 000 Vhs（聚焦程序Ⅱ），或 8 000 V 120 000
Vhs，500 V 0.5 h，30 V 0.5 h（聚焦程序Ⅲ）进行聚焦。
第二向SDS-PAGE电泳采用Ettan DALT six电泳系统进行分离，分离胶的浓度为 12%，电泳参数
为 1 W · gel-1电泳 1 h后改用 13 W · gel-1电泳，直至溴酚蓝线到达凝胶底部。电泳结束后银染采用与
质谱兼容的银染染色法（Blum et al.，1987）；考染采用胶体考马斯亮蓝染色法（Candiano et al.，2004），
将凝胶用 40%乙醇和 10%乙酸固定 30 min后，ddH2O漂洗 4 次，每次 15 min；用胶体考马斯亮蓝染
色液（0.12% CBB G250，10%硫酸铵，10%磷酸，20%乙醇）染色过夜；用ddH2O漂洗至背景清晰
为止。
凝胶图像采集和分析分别采用 ImageScanner 和 ImageMaster 2D Platinum 6.0，扫描参数选用透
射模式，分辨率 300 dpi。

664 园 艺 学 报 37 卷
2 结果与分析
2.1 采用不同pH梯度IPG胶条的双向电泳结果比较
为选择最适合番茄子叶总蛋白分离的 IPG 胶条 pH 梯度，分别对 pH3-11NL、pH3-7NL、pH7-11NL
的 IPG 胶条的分离效果进行比较。根据胶条的特点，pH3-11NL、pH3-7NL、pH7-11NL 的 IPG 胶条
分别选用 275、300 和 350 μg 的上样量，上样方式采用水化上样，聚焦程序采用聚焦程序Ⅱ。
采用 pH3-11NL 的 IPG 胶条的双向电泳结果显示，番茄子叶总蛋白主要分布在酸性至中性区域，
碱性端分布较少，且蛋白点没有有效分离，出现一些横条纹。利用 ImageMaster 软件对 pH3-11 的 IPG
胶条双向电泳图谱进行蛋白点的分析，得到蛋白点为（1 610 ± 60）个，其中 pH 3 ~ 7 范围内的蛋白
点为（1 387 ± 52）个，占总蛋白点数的 80.2% ± 2.1%。
采用 pH3-7NL 的 IPG 胶条分离所得蛋白点在凝胶上分布比较均匀，分析得到的蛋白点为（2 487 ±
62）个。利用 pH3-7NL 的胶条分离得到的 pH 值在 3 ~ 7 之间的蛋白点的比用 pH3-11NL 的 IPG 胶
条分离到的 pH3-7 蛋白点增加了 54.5%。表明利用窄 pH 梯度的 pH3-7 NL IPG 胶条极大地提高了蛋
白的分辨率。仔细比较两个图谱中相同区域的蛋白点，可以看出利用窄范围的 pH3-7 NL IPG 胶条相
比 pH3-11NL 的 IPG 胶条显著增加了分离所得的蛋白点，使一些低丰度蛋白可以清晰显现。
采用 pH7-11NL 的 IPG 胶条的双向电泳检测到的蛋白点为（236 ± 43）个，其中绝大部分蛋白
聚集在酸性端。利用 pH7-11NL 的 IPG 胶条进行分离，结果多为横条纹，蛋白点很少，很可能不是
由于样品中碱性蛋白量存在较少，而是该双向电泳条件并不是最适宜，导致碱性蛋白分离效果较差。
以上结果表明，番茄子叶总蛋白在用双向电泳分离后，蛋白主要分布在 pH 3 ~ 7 的区域，碱性
端蛋白分布较少，在现有系统条件下碱性蛋白分离效果差。利用 pH3-7NL 的 IPG 胶条相比 pH3-11NL
的 IPG 胶条，分离到的蛋白点显著增加，分辨率明显提高。因此，pH3-7NL 的 IPG 胶条最适合番茄
子叶总蛋白的分离。
2.2 采用不同上样方式的双向电泳结果比较
采用不同 pH 梯度 IPG 胶条、水化上样的双向电泳结果表明，pH3-11 的 IPG 胶条在碱性端的分
离效果不理想。
杯上样是分离碱性蛋白的有效方法（Bak-Jensen et al.，2004；Corton et al.，2004），因此尝试用
杯上样的方法来改善 pH3-11NL IPG 胶条碱性端的蛋白分离效果，并对水化上样和杯上样的上样方
法对 2-DE 结果的影响进行了比较。
选用 pH3-11NL IPG 胶条，分别采用水化上样、上样量 300 μg，以及杯上样、上样量 125 μg 对
番茄苗子叶总蛋白进行双向分离。通过 ImageMaster 软件对杯上样和水化上样图谱的蛋白总点数、
pH≤7 及 pH＞7 范围的蛋白点进行检测，获取的蛋白点情况见表 1。
利用水化上样检测到 pH3-11 的总蛋白点为（1 691 ± 72）个，其中碱性蛋白为（304 ± 44）个，
重复性较好。而利用杯上样检测到的总蛋白点为（2 528 ± 458）个，其中碱性端蛋白为（654 ± 160）
个（表 1）。杯上样可以得到更高的分辨率，显著改善碱性蛋白分离效果，但杯上样对实验技术的要
求相对较高，容易出现横条纹和纵条纹，重复性较差，虽然进行了优化条件的摸索，但结果仍不理
想。
综合分析分辨率和重复性，认为水化上样所得结果重复性好，可以取得稳定的分离效果，适合
番茄子叶总蛋白的分离。

4 期 黎 飞等：番茄子叶总蛋白双向电泳体系的建立 665
表 1 采用 pH3-11NL IPG 胶条杯上样和水化上样的双向电泳图谱蛋白点分析结果
Table 1 The protein spots of the 2-DE profiles obtained using pH3-11 IPG strips with cup loading and rehydration loading
pH≤7 pH＞7 上样方式
Sample loading
重复
Repeat
蛋白点总数
Total protein
spots
蛋白点
Protein spots
百分比/%
Percentage
蛋白点
Protein spots
百分比/%
Percentage
杯上样 1 2 776 2 101 75.7 675 24.3
Cup loading 2 2 849 1 993 70.0 856 30.1
3 1 854 1 383 74.6 471 25.4
4 2 632 2 018 76.7 614 23.3
平均Average 2 528 ± 458 1 874 ± 232 74.3 ± 3.0 654 ± 160 25.8 ± 3.0
水化上样 1 1 767 1 402 79.3 365 20.7
Rehydration loading 2 1 617 1 320 81.6 297 18.4
3 1 642 1 381 84.1 261 15.9
4 1 738 1 445 83.1 293 16.9
平均Average 1 691 ± 72 1 387 ± 52 82.0 ± 2.1 304 ± 44 18.0 ± 2.1

2.3 采用不同上样量的双向电泳结果比较
为获取最佳上样量，采用水化上样方式，对于 pH3-11NL 的 IPG 胶条选用 250 和 275 μg 的上样
量，对于 pH3-7NL 的 IPG 胶条则选用 250、300 和 350 μg 的上样量，进行电泳，利用 Imagemaster
软件分析所得蛋白点。如表 2 所示，对于 pH3-11NL 的 IPG 胶条，上样量为 275 μg 较合适，有效蛋
白点数较多，且能有效分离，图谱中仅主要几个
高丰度蛋白出现点饱和；对于 pH3-7NL 的 IPG
胶条，当上样量为 250 μg 时有效蛋白点数较少，
分辨率较低，而上样量为 350 μg 时虽然蛋白点数
表 2 不同上样方式、pH 梯度和上样量对双向电泳图谱蛋白点的影响
Table 2 The protein spots of the 2-DE profiles obtained by different
sample loading methods，pH gradients
and sample loading volumes
上样方式
Sample loading
胶条梯度
pH gradient
上样量/μg
Sample loading
volume
蛋白点
Protein
spots
水化上样 pH3-11NL 250 1 431
Rehydration loading 275 1 667
pH3-7NL 250 1 645
300 2 245
350 2 380
杯上样 pH3-11NL 100 846
Cup loading 125 2 306
150 2 173
提高，但不能有效分离，且银染时蛋白出现点饱
和现象，上样量为 300 μg 时蛋白点数明显增加，
且能有效分离，效果最佳。
采用杯上样，对 pH3-11NL 的 IPG 胶条的
上样量进行了优化（表 2），125 μg 的上样量相
比 100 μg，分辨率有了很大的提高；当上样量
为 150 μg 时，高分子量蛋白不能很好的分离，
部分蛋白点出现点过饱和，因此最佳上样量为
125 μg。
2.4 采用不同聚焦参数的双向电泳结果比较
对 Cf-9 番茄子叶总蛋白采用 pH3-7NL 的 IPG 胶条，水化上样，上样量 300 μg，分别采用聚焦
程序Ⅰ和Ⅱ进行聚焦，二向电泳后获得 2-DE图谱。软件分析得到的蛋白点总数分别为 2 048和 2 135，
差异不明显。
2.5 适合番茄子叶总蛋白分离的分析型凝胶双向电泳体系
通过上样方式、上样量、不同 pH 梯度的 IPG 胶条选择及等电聚焦参数的优化，建立了一套重
复性好、分辨率高、采用分析型凝胶的番茄子叶总蛋白双向电泳体系。这几项因素的优化条件分别

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为：采用水化上样方式，选用 pH3-7NL 的 IPG 胶条，300 μg 上样量，聚焦程序Ⅰ或Ⅱ，银染法染
色凝胶。优化双向电泳体系对番茄子叶蛋白的双向电泳结果见图 1。
图 1 采用优化的双向电泳体系分离番茄子叶总蛋白的双向电泳图谱
Fig. 1 The 2-DE profiles of total proteins extracted from tomato cotyledons following
the optimized protocol with silver staining
2.6 适合番茄子叶总蛋白分离的制备型凝胶双向电泳体系
采用制备型凝胶进行 2-DE，可以容纳高上样量，因而可以获得高含量的蛋白点，从而满足质谱
测序的要求。与分析型凝胶相比，对制备型凝胶进行 2-DE 可以将上样量提高到 1.5 mg，采用水化
上样，pH3-7NL 的 IPG 胶条，采用聚焦程序Ⅲ进行双向分离。并且凝胶采用胶体考马斯亮蓝染色。
典型的图谱结果见图 2。
经 ImageMaster 软件分析，检测到（1 459 ± 23）个蛋白点。相比 Saravanan 和 Rose（2004）的
分离方法，增加了 600 多个蛋白点。
图 2 番茄子叶总蛋白的制备型凝胶双向电泳考马斯亮蓝染色图谱
Fig. 2 The 2-DE profile of total proteins extracted from tomato cotyledons using preparative gel staining
with colloidal Coomassie Brilliant Blue
4 期 黎 飞等：番茄子叶总蛋白双向电泳体系的建立 667
3 讨论
3.1 IPG胶条对双向电泳结果的影响
同一样品采用不同 pH 梯度的 IPG 胶条分离，得到的蛋白点具有明显差别。番茄子叶总蛋白使
用 pH3-11NL IPG 胶条和 pH3-7NL IPG 胶条分离，得到的蛋白点数相差 800 多个。窄 pH 梯度的 IPG
胶条可以获得较大的上样量，分离等电点相差不大的蛋白，分辨率也可以得到显著提高。
IPG 胶条的选择需根据样品中蛋白的分布、目的蛋白性质及丰度等进行选择。对于未知蛋白分
布特性的样品，可以先用宽 pH 梯度的 IPG 胶条（如 pH3-10 或 pH3-11）进行分离。对于蛋白点无
法充分分离的 pH 区域，可选用对应范围的窄 pH 梯度的 IPG 胶条进一步进行分离。
3.2 上样方式对双向电泳结果的影响
蛋白质的上样方式既可在胶条水化时同水化液混合后水化上样，也可以在聚焦时采用杯上样。
水化上样法中，每个蛋白都带有正、负电荷，它们可向两侧移动到达它们的等电点。杯上样法中，
所有的蛋白带电荷方式相同，从同一位置移动到达它们的等电点。对于非常大量的样本和制备电泳
可采用纸桥上样。
蛋白上样方式对双向电泳图谱的质量和完整性有直接的影响。从本研究的结果可以看出，杯上
样分辨率比水化上样高，可以获得更多的蛋白点，能对碱性蛋白进行有效分离。杯上样所需的上样
量要比水化上样少，对于小量样品的分离具有优势。但其最大上样量和上样体积较小，一般推荐的
最大上样量为 150 μg，最大上样体积为 150 μL。如果上样量再增大，有些蛋白质的等电点靠近上样
处、迁移率及溶解性降低，加样点蛋白易发生沉淀。此外，杯上样对试验的技术要求较高，容易出
现横条纹和竖条纹。
多次重复试验结果表明，水化上样可以取得较好的重复性。此上样方法能进行较大体积、较大
量和浓度较低的样品加样和分离。由于没有特定的加样点，这种方法不会出现用样品杯加样时在加
样点出现蛋白沉淀现象，也不会出现杯上样时样品渗漏等问题。但由于水化上样时 IPG 胶条需水化
液室温溶涨过夜（12 h），蛋白质易降解。
3.3 上样量对双向电泳结果的影响
上样量的大小直接影响双向电泳的分辨率。上样量过低，丰度较低的蛋白无法显现，上样量过
高，蛋白无法有效分离。上样量的大小因上样方式、IPG 胶条的 pH 梯度及胶条长度等差异而各不
相同，最佳的上样量需根据具体实验的对象来探索确定。窄 pH 梯度的 IPG 胶条比宽 pH 梯度的 IPG
胶条需更大的上样量，而杯上样相对于水化上样，上样量可以减少。
在胶条长度、染色方法、上样方法等均确定的情况下，优化上样量对提高分辨率和增加低丰度
蛋白均有重要的意义。上样量过大，蛋白点不能有效分离；过少，则低丰度蛋白点无法显现。对于
pH3-7NL 的 IPG 胶条，当上样量从 250 μg 增加至 300 μg 时分辨率有所提高，当上样量从 300 μg 增
加至 350 μg 时，蛋白点没有明显增多，且蛋白不能有效的分离成单个蛋白点。
3.4 双向电泳聚焦参数对双向电泳结果的影响
双向电泳中第一向等电聚焦电泳（IEF）是利用蛋白质分子等电点的不同，在一个稳定、连续
的 pH 梯度中进行蛋白质的分离和分析。等电聚焦程序对蛋白质分离有直接的影响，可以导致 2-DE
图谱上出现横向或纵向条纹、蛋白点的拖尾及不规则的蛋白质点，影响分辨率和重复性。如果等电
聚焦不完全，在凝胶上容易产生水平条纹，但是过度等电聚焦能够造成电渗和蛋白质飘移。样品在

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聚焦前的阶段，用低电压维持，可以除盐和一些杂质。本研究采用聚焦程序Ⅰ和Ⅱ进行聚焦，但结
果的差别不显著，这可能是最佳聚焦时间有一个区间，在此范围内，聚焦时间对结果的影响不明显。

References
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