全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（6）：931–938
Acta Horticulturae Sinica
黄瓜抗白粉病品系 cDNA文库构建及 EST分析
齐晓花，罗晶晶，Mouammar Alfandi，马 威，徐 强，陈学好*
（扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009）
摘 要：采用 SMART技术构建了高抗白粉病的黄瓜品系 JIN5-508的叶片 cDNA文库，并对其进行
了质量鉴定。结果表明，该文库的重组率为 95.3%，库容量为 1.02 × 106 pfu · mL-1，平均插入片段为 0.5 kb
左右，是一个高质量的 cDNA文库。利用该文库随机挑选的 8 352个克隆从 5′ 端进行单向测序，共获得
8 035个有效的 ESTs（expressed sequence tags），序列的平均长度为 838 bp。进一步的生物信息学分析表
明：EST序列拼接出 3 467个 unigenes，其中包括 953个 contigs和 2 514条 singletons，文库冗余度较低，
为 56.9%；从文库中筛选出了大量的低丰度表达基因，约占 unigene总数的 72.5%，说明文库的复杂性较
高；1 991个 unigenes获得分子功能注释，其中与蛋白结合活性和催化活性相关的基因分别达到了 41.34%
和 38.72%；在获得功能注释的 unigene中，有部分抗病抗逆相关基因高丰度表达，其中 3个 unigenes与
拟南芥白粉病抗性基因 Mlo2、Mlo8和 Mlo14高度同源，表明该文库可为进一步研究黄瓜抗白粉病相关的
特异基因的克隆及功能验证奠定基础。
关键词：黄瓜；白粉病；cDNA文库；EST
中图分类号：S 642.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）06-0931-08

Construction of Cucumber Leaf cDNA Library and Analysis of Expressed
Sequence Tag
QI Xiao-hua，LUO Jing-jing，Mouammar Alfandi，MA Wei，XU Qiang，and CHEN Xue-hao*
（College of Horticulture and Plant Protection of Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）
Abstract: We constructed a cDNA library from the leaf of cucumber (Cucumis sativus L.) line
JIN5-508 with high powdery mildew resistance based on the SMART technology，and checked the quality
of this library. The recombinant rate of present library was 95.3%，the titer was 1.02 × 106 pfu · mL-1，and
the average size of inserted cDNA fragments were about 0.5 kb. It indicated that one high quality cDNA
library of cucumber was successfully constructed. Subsequently，8 352 clones were chosen randomly
from this library，and 8 035 valid expressed sequence tags were generated from the 5′ end sequencing. The
average length of ESTs were 838 bp. Bioinformatics analysis of EST data indicated the low redundancy of
this library with a score of 56.9%，in which 3 467 unigenes including 953 contigs and 2 514 singletons
were assembled. Genes that expressed with low abundance occupied 72.5% of total unigenes，indicating
the good complexity of gene expression in this library. One thousand nine hundred and ninty-one unigenes
could be assigned functional description. Among the unigenes with molecular function classification，binding

收稿日期：2009–12–17；修回日期：2010–03–24
基金项目：江苏省科技支撑计划项目（BE2008360）；江苏省科技基础设施建设计划项目（BM2008008）；江苏省高校自然科学研究计划
项目（09KJB10006）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xhchen@yzu.edu.cn）
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activity and catalytic acitivity related proteins took up to 41.34% and 38.72%，respectively. Three unigenes
with high homology to Arabidopsis thaliana powdery mildew resistance locus were also identified，which
suggested this library could be useful for further identification and expression analysis of powdery mildew
resistance genes in cucumber.
Key words：cucumber；powdery mildew；cDNA library；EST

黄瓜（Cucumis sativus L.）白粉病是目前生产上十分严重的病害，常对黄瓜的产量和品质产生
不利的影响。众多的报道表明黄瓜白粉病抗性由多个基因控制（Smith，1948；Barners & Epps，1956；
Wilson et al.，1956；Kooistra，1968；Shanmugasundaram et al.，1971；Pierce & Wehner，1990）。与
抗性连锁的形态标记如叶片褪绿（Zijlstra et al.，1995）和分子标记（刘龙洲 等，2008；张海英 等，
2008）也陆续被鉴定。但是由于黄瓜白粉病抗性遗传机制较为复杂，控制抗性的关键基因克隆至今
未取得明显进展。
构建 cDNA 文库并进行大规模测序（EST）是发现新基因和研究基因表达的有效方法（史成颖
等，2009）。
目前已有众多学者通过构建黄瓜的cDNA文库进行功能基因克隆及表达研究。Greenler等（1989）
通过黄瓜子叶构建 cDNA文库分离了 NADH依赖性羟基丙酮还原酶 cDNA。Morgens等（1990）利
用经过乙烯利处理的黄瓜子叶构建 cDNA 文库，分离乙烯诱导的过氧化物酶的 cDNA 克隆。Kim
（2004）利用黄瓜的衰老子叶（> 95%枯黄）构建 cDNA文库，研究从早期异养生长经过光合营养
生长而逐渐衰老过程中的基因表达。Cho等（2005）利用雌雄同株的黄瓜根尖构建 cDNA文库分离
雄性诱导表达的 cDNA克隆。毛伟华（2006）通过构建 NaCl胁迫下黄瓜根部的 cDNA文库筛选到
一系列与抗盐胁迫相关的基因。
上述文库鉴定的功能基因大都集中在黄瓜子叶、根尖和果实部分的转录本，未涉及到叶片中表
达的功能基因及调控基因。而叶片是黄瓜白粉病发病的主要部位，因此构建叶片组织的 cDNA文库
是研究黄瓜白粉病抗性基因的基础。
作者以高抗白粉病黄瓜品系 JIN5-508的叶片为材料构建了 cDNA文库，并对此文库进行了表达
序列标签分析，以期为分离克隆黄瓜叶片重要功能基因尤其是抗白粉病基因奠定基础，也为今后制
备黄瓜基因芯片提供平台。
1 材料与方法
1.1 材料及总RNA抽提
供试材料为黄瓜品系 JIN5-508（从津春 5 号中选育出的高抗白粉病品系），经多次田间自然发
病和人工接种鉴定，该品系均表现高抗白粉病（蔡建华 等，2006）。在三叶一心期取幼嫩叶片，液
氮速冻后保存在−80 ℃冰箱中备用。
RNA 抽提试剂为天根生化公司生产的 DP407-02 提取剂。按照操作说明书利用黄瓜叶片进行
RNA提取，然后采用 Rneasy Mini Kit（Qiagene）对总 RNA进行纯化，质检，具体步骤参照试剂盒
说明书。
1.2 cDNA第一链的合成
在 0.2 mL PCR管中加入以下试剂：3 µL样品总 RNA（对照反应使用 1 µg 的 control RNA）、1 µL
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SMART IV oligo nucleotide和 1 µL CDS Ⅲ/3′ PCR primer；混合以上各组分并稍离心；依次 72 ℃温
浴 2 min，冰浴 2 min后稍离心；然后向离心管中加入下列试剂：2.0 µL 5 × first-strand buffer、1.0 µL
DTT（20 mol · L-1）、1.0 µL dNTP Mix（10 mol · L-1）、1.0 µL powerscript reverse transcriptase，混匀
以上各组分并稍离心；42 ℃的条件下空气浴 1 h；将反应管置于冰上终止 cDNA一链反应。
1.3 LD-PCR（long distance PCR）cDNA扩增
向反应管中加入下列试剂：2 µL cDNA第一链、80 µL去离子水、10 µL 10 × advantage 2 PCR
buffer、2 µL 50 × dNTP Mix、2 µL 5′ PCR primer、2 µL CDS Ⅲ/ 3′ PCR primer和 2 µL 50 × advantage
2 polymerase mix，混匀以上各组分；稍稍离心后放到已预热（95 ℃）的 PCR仪中；运行以下 PCR
程序：95 ℃变性 1 min，95 ℃ 15 s，68 ℃ 6 min，26个循环。
程序结束后取 5 µL样品进行电泳检测。
1.4 蛋白酶K消化、Sfi I消化及分级分离
在 50 µL LD-PCR 产物中加入 2 µL蛋白酶 K（20 µg · µL-1），混匀后稍离心；45 ℃温浴 20 min，
稍离心后加入等体积酚︰氯仿︰异戊醇剧烈震荡 1 ~ 2 min，14 000 r · min-1离心 5 min；收集上层液体
加入等体积的氯仿︰异戊醇剧烈震荡 1 ~ 2 min；14 000 r · min-1离心 5 min；再收集上层液体加入 1/10
体积的 3 mol · L-1乙酸钠，2.5倍体积 95%的乙醇，室温下立即 14 000 r · min-1离心 20 min；倒掉上
清液，用 100 µL 80%乙醇洗沉淀物，而后空气干燥沉淀物约 10 min后加入 79 µL的去离子水溶解沉
淀。
将蛋白酶 K消化后的产物 79 µL、10 µL 10X Sfi buffer、10 µL Sfi I 酶和 1 µL 100倍 BSA充分
混匀，50 ℃温浴 2 h产生黏性末端，而后加入 2 µL 1%二甲苯胺染料，混匀。
将酶切产物用 chroma spin-400进行分级分离，按照说明书操作去除分子量小于 400 bp的 cDNA
片段。将收集的片段溶解在 100 µL去离子水中。
1.5 cDNA与载体的连接与转化
在 0.2 mL离心管中加入下列试剂：1.0 µL cDNA、1.0 µL pBlueScriptⅡSK vector（50 ng · µL-1）、
1.0 µL 10倍连接缓冲液、1.0 µL ATP（10 mmol · L-1）、1.0 µL T4 连接酶和 5.0 µL 双蒸水，16 ℃条
件下过夜。遗传转化 DH-5α宿主菌，计算菌落总数和蓝白菌落数，确定重组率和库容量。
1.6 重组质粒抽提和EST序列测定
随机挑选阳性 cDNA克隆，使用 96孔板进行碱裂解法提取质粒 DNA；cDNA克隆 5′ 端进行单
向测序。
1.7 EST序列的生物信息学分析
利用 cross-match软件去除载体序列、大肠杆菌基因组污染序列和长度小于 100 bp序列。然后
利用 Phrap软件进行序列拼接。最后利用 CAP3软件对拼接结果进行组装，有至少 40 bp的匹配且
重叠区有 95%以上相似性的两条和两条以上的 EST序列组成的拼接序列鉴定为一条重叠群（contig）
序列，不能包含在任何 contig中的独立EST认为是一条单拷贝EST（singleton）序列，contig和 singleton
序列合并称为代表性序列（unigene）。
将获得的 unigene在 UniPro蛋白库中进行 Blastx搜索，将最佳匹配（E value < 1e-5）的 unigene
进行基因功能（Gene Ontology）注释。

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2 结果与分析
2.1 cDNA文库构建
从黄瓜叶片提取的总RNA经 1%甲醛琼脂
糖变性凝胶电泳检测，出现清晰的 28S 和 18S
rRNA两条带，说明总 RNA结构完整、未降解，
完全可以满足 cDNA文库的构建。
黄瓜 cDNA第一链 LD-PCR的产物检测结
果呈弥散状，大小主要集中在 500 ~ 2 000 bp
之间（图 1），符合建库要求。
2.2 cDNA文库质量鉴定
经滴度检测，表明黄瓜叶片原始文库容量
为 1.02 × 106 pfu · mL-1，重组率为 95.3%。对
随机挑选的 36个 cDNA克隆进行 PCR扩增，
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明文库随机插入片段为 500 bp左右，部分检测结果见图 2。
图 2 PCR检测插入片段大小
M：DNA分子量标记 DL2000；1 ~ 23：随机挑选克隆。
Fig. 2 Detection of insert fragment sizes by PCR
M：DNA ladder DL2000；1–23：Clones selected randomly.

为了获得更多的黄瓜叶片的表达基因，把文库菌液均匀涂在 LB 平板培养基上筛选有效的重组
克隆，随机挑选 8 352个 cDNA克隆进行 5′ 端单向测序。去除低质量序列后，目前共获得 8 035条
有效 EST序列。测序成功率为 96%。
2.3 EST数据分析
2.3.1 EST序列拼接分析
利用 Phrap程序对 8 035条有效 EST进行拼接，共获得 3 467条 unigenes，其中跨叠群（contig）
和单条序列（singleton）分别为 953个和 2 514个。文库的冗余度较低，为 56.9%（表 1），说明该
文库构建质量较好，基因的重复测序较少。
由两个以上 EST拼接组成的 953个 contigs中，包含 EST数最多的 contig由 696条 EST拼接组
成，但是 851个 contigs（占 contig总数的 89.3%）是由 2 ~ 8条 EST序列拼接而成的。包含 16条及
以上 EST 的 39 个 contigs代表文库高丰度表达基因，其余的 914个 contigs代表中丰度表达基因，
所有的 singletons 序列代表低丰度表达基因。低丰度表达基因约占 unigene 的 72.5%，表明构建的
cDNA文库的复杂性较好，可以有效地筛选出低丰度表达基因。
图 1 LD-PCR扩增产物质检图
M：1 kb DNA分子量标记；1：双链 cDNA。
Fig. 1 Assessment of LD-PCR products
M：1 kb DNA ladder；1：ds cDNA.
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表 1 5′ 端 EST数据分析
Table 1 Analysis of express sequence tags generated from 5′ end sequencing
EST参数
EST parameter
数据
Data
占 unigene的比率/%
Percentage of total unigene
EST总数 Number of total ESTs 8 035
EST平均长度 The average length of ESTs 838
冗余度/% Redundancy 56.9
Unigene总数 Number of unigene 3 467
Singletons（1 EST） 2 514 72.5
Contigs（≥ 2 ESTs） 953 27.5
2 ~ 8 ESTs 851 24.5
9 ~ 15 ESTs 63 1.8
≥ 16 ESTs 39 1.1
注：冗余度＝（EST总数－unigene数）/ EST总数。
Note：Redundancy = (Number of total ESTs－Number of unigenes) / Number of total ESTs.

2.3.2 Unigene功能注释和分类
对 3 467个 unigenes的 Blastx比对结果表明：2 061个 unigene（E value<1e-5）可进行下一步功
能注释。
利用 Gene Ontology（GO）对 2 061个 unigenes进行功能注释，其中 1 991个具有分子功能，其
余的 1 476个没有明显同源性而被鉴定为未知基因，约占 unigene总数的 42.6%。
利用 GO分类法对有功能注释的 1 991个 unigenes进行分子功能分类，共分成 12个功能类别（表
2）。蛋白结合和催化活性相关基因比例较高，分别达到 41.34%和 38.72%。转运活性、转录调节活
性、分子传感活性和结构分子活性等相关基因含量也较高，分别为 5.52%、4.27%、3.62%和 3.37%。
此外，酶调控活性、翻译调控活性、抗氧化活性、启动活性、蛋白标签和辅助转运蛋白活性相关基
因也有表达，但是含量低于 2%。其中 3 个 unigene 分别与拟南芥白粉病抗性基因 Mlo2、Mlo8 和
Mlo14（Schulze-Lefert & Vogel，2000）高度同源。
表 2 注释 unigene的分子功能分类
Table 2 Molecular functional classification of annotated unigenes
分子功能分类
Molecular function classification
Unigene数
Number of unigenes
占注释 unigene总数的比例/%
Percentage of total unigenes
结合活性 Binding 823 41.34
催化活性 Catalytic activity 771 38.72
转运活性 Transporter activity 110 5.52
转录调节活性 Transcription regulator activity 85 4.27
分子传感活性Molecular transducer activity 72 3.62
结构分子活性 Structural molecule activity 67 3.37
酶调控活性 Enzyme regulator activity 38 1.91
翻译调控活性 Translation regulator activity 13 0.65
抗氧化活性 Antioxidant activity 7 0.35
发动活性 Motor activity 3 0.15
蛋白标签 Protein tag 1 0.05
辅助转运蛋白活性 Auxiliary transport protein activity 1 0.05

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2.4 高丰度表达基因
共有 39 个 unigenes 在 EST 数据库中出现 15 次以上，用来代表文库高丰度表达的基因，其中
23个初步确定为已知功能基因，推定功能基因 6个，未知功能基因 9个。高丰度表达的基因中包括：
叶绿素 a/b 结合蛋白、细胞内抗坏血酸过氧化物酶、脂质转移蛋白、核酮糖二磷酸羧化酶、细胞壁
水解酶、组蛋白、核糖体蛋白、衰老相关蛋白等。这一结果与叶片直接涉及光合作用等重要生理机
能直接相关，其中抗坏血酸过氧化物酶是植物应对病菌侵染反应的重要酶基因；脂质转移蛋白在拟
南芥（Jung et al.，2005）和烟草（Sarowar et al.，2009）中的研究表明：它可以有效抑制多种病菌
的侵染。
上述这些结果都将为今后进行黄瓜抗白粉病分子机理研究提供线索。
3 讨论
高质量的文库是研究基因表达的基础。本研究中用高抗白粉病的黄瓜品系为材料构建其叶片
cDNA 原始文库，通过文库滴度、重组率和插入片段长度等分析表明文库质量较好。在文库构建时
除了考虑文库的容量，插入片段大小及重组率外，还应该考虑文库的利用目的。如果建库的目的是
为了大规模测序，则载体系统的选择非常关键（陈秀珍，2004）。用质粒型载体构建的文库进行测序
具有较大优势，如容易操作、避免噬菌体操作中的污染、免去亚克隆等繁琐步骤，这对大规模 EST
分析极为有利。构建的黄瓜叶片 cDNA 文库主要用于大量测序获得 EST，因此选用了质粒型载体
pBlueScriptⅡSK。测序与 EST统计分析结果表明：测序成功率 96%，文库冗余度较低，复杂度较高。
这些试验结果也很好的证明了本研究载体选择的正确性。
近年来众多研究者致力于通过 cDNA文库筛选具有重要功能的基因（Tian et al.，2006）。目前，
通过构建 cDNA文库获得黄瓜上的功能基因有：NADH依赖性羟基丙酮还原酶（Greenler et al.，1989）、
乙烯诱导的过氧化物酶（Morgens et al.，1990）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（Kim & Smith，1994）等。
此外，毛伟华（2006）构建了 NaCl 胁迫下黄瓜根的 cDNA 文库，筛选到一系列参与胁迫防御的基
因。
为了研究黄瓜果实的生长发育调控基因，梅茜（2004）构建了黄瓜幼果的 cDNA文库，EST分
析表明：果实中 EST推测功能主要包括生长发育，光合作用，转录调控等相关基因。
本研究中构建的黄瓜高抗白粉病品系的叶片 cDNA文库中，参与植物抗病防御机制的细胞内抗
坏血酸过氧化物酶和脂质转移蛋白高丰度表达，此外植物抗逆相关蛋白（例如：衰老相关蛋白、细
胞壁水解酶等）也高丰度表达。这些高丰度表达基因表明该文库获得的 EST信息包括了白粉病抗性
相关基因。
通过对文库中获得的 1 991个获得分子功能的 EST进行分析，筛选到部分涉及抗病抗逆相关的
EST。其中 3个 unigene分别与拟南芥白粉病抗性基因 Mlo2、Mlo8和 Mlo14高度同源。这为黄瓜白
粉病抗性基因鉴定提供了重要的线索，使得利用已知片段获得抗性基因成为可能。
与此同时，作者正在构建该品系接种白粉病菌后不同时间点的抑制性消减文库，拟利用 cDNA
文库和抑制性消减文库获得的 EST信息以及 NCBI数据库上黄瓜的 EST序列制备黄瓜基因芯片。随
着基因芯片工作的开展，将来不仅可以准确筛选黄瓜抗白粉病相关基因，还可以比较不同基因的表
达水平以及同一基因在不同条件下的表达情况，并根据接种白粉病菌后生理、形态指标变化结合基
因表达水平的变化来判断基因功能，最终确定黄瓜白粉病抗性相关的特异基因。


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和 ，主要栽培设施的设计、施工，保护地环境及调节，保护地蔬菜栽培技术；采后处理及贮藏保鲜篇重点介绍
了
病
改
简
员
学
员、病
应用
蔬菜采后处理技术及贮藏原理和方法等。与原著（1987年版）相比较，具有如下特点：
1. 重点增加了自 20世纪 80年代后期以来，中国在蔬菜栽培理论、无公害蔬菜栽培技术、推广应用的新品种、
虫害综合防治以及在蔬菜产品质量、产品采后处理及贮藏保鲜原理和技术等方面取得的新成果、新进展；概述了
革开放以来中国蔬菜产、销通过商品基地建设、流通体系建设等在解决蔬菜周年生产和供应方面所取得的成绩。
2. 对蔬菜栽培历史，蔬菜的起源、来源，分类，蔬菜学名，病虫害学名等进行了复核，校勘。
3. 尽可能地反映不同学术思想和观点；尽量反映不同生态区，包括台湾地区在内的栽培技术特点。
4. 删去了“蔬菜的加工”和“野生蔬菜”两章，以使本书的内容更加切题。另在附录中增加了“主要野生蔬菜
表”、“主要野生食用菌简表”和“主要香辛料蔬菜简表”3个附表。
本书由中国农业科学院蔬菜花卉研究所主编，组织全国有较高学术水平和实际工作经验的专家、学者和技术人
130余人分别撰写，反映了 21世纪初中国蔬菜栽培科学研究和蔬菜生产技术的水平，内容较全面、系统，科学性、
术性强，亦有较强的实用性，并插有近 500 张彩图，可供相关科研人员、农业院校师生、专业技术人员或管理人
等参考。
定价 330元（含邮费）。
购书者请通过邮局汇款至北京中关村南大街 12号中国农科院蔬菜花卉所《园艺学报》编辑部，邮编 100081。