全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（增刊）：2598 http: // www. ahs. ac. cn
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收稿日期：2011–08–26
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菜用大豆 CBF 信号转导途径相关基因的克隆与
功能分析
张古文*，龚亚明，胡齐赞，徐盛春
（浙江省农业科学院蔬菜研究所，杭州 310021）
克隆菜用大豆耐寒信号转导途径相关基因 GmCBF（Glycine max CBF），并对其序列特征进行分
析，为研究菜用大豆耐寒性的分子机制增加理论基础，也为进一步以 CBF 信号转导途径相关因子作
为改良靶标提供理论依据。
以菜用大豆耐寒品种‘沪宁 95-1’为材料，4 ℃诱导 8 h 的叶片 cDNA 为模板，参照已发表的
大豆 CBF 基因（AF370735）设计特异引物，采用 RACE-PCR 技术进行基因克隆。采用 DNAMAN 4.0
软件对所得序列编码的氨基酸进行分析，采用 BLAST 程序对其核苷酸和氨基酸序列进行同源性比
较，利用 ClustalX 1.8 软件进行多重序列比对，利用 MEGA 4.0 软件构建系统进化树，二级结构用
Bioinformatics & Biological computing 分析，三级结构用 SWISS-MODEL 分析。以 25 ℃ 12 h、4 ℃ 0.5
h、4℃ 2 h、4 ℃ 4 h、4 ℃ 8 h、4 ℃ 8 h 后再 25 ℃ 12 h 等 6 种处理后的叶片总 RNA 为模板，利用
半定量 RT-PCR 方法验证 GmCBF 基因表达是否受低温诱导。酵母单杂交方法鉴定其转录激活活性。
结果表明，GmCBF 基因 cDNA 全长 1 150 bp，含有 705 bp 的完整开放阅读框，编码 234 个氨
基酸残基，起始密码子 ATG 的-3 位为 A，符合 Kozak 规律，符合有效翻译的基因全长 cDNA 的特
征。编码的蛋白具有典型的 AP2 结构域，并具有 DNA 结合区，分子量约为 94.60 kD，等电点为 4.84。
将该基因与大豆 CBF1、野生大豆 DREB1、番薯 DREB1、海棠 CBF1、桉树 CBF1、甘蓝型油
菜 DREB1B、花生 DREB1 等基因进行多序列比对并构建系统进化树，结果表明该基因核苷酸序列与
大豆 CBF1 基因的同源性最高，为 98%，与花生 DREB1 基因的同源性最低，为 74%；氨基酸序列
与大豆 CBF1 基因的同源性最高，为 98%，与桉树 CBF1 基因的同源性最低，为 55%。
GmCBF 蛋白由 80 个 α 螺旋，8 个 β 转角组成，被 32 个延伸链和 92 个自由卷曲连接，与大豆
CBF1 蛋白及野生大豆 DREB1 蛋白较相似，表明三者有较近的亲缘关系。α螺旋为其主要结构，表
明该蛋白不是球蛋白。三级结构分析没有发现数据库中有和 GmCBF 蛋白同源的三维结构图。
25 ℃时没有扩增到条带，4 ℃诱导 0.5 h 后 GmCBF 基因开始表达，诱导 4 h 达到高峰，随后又
逐渐减弱，4 ℃诱导 8 h 后再用 25 ℃处理 12 h，未检测到表达。该结果证明 GmCBF 基因与低温诱
导过程相关，属于 CBF 基因家族。GmCBF 基因可以与 DRE 元件结合，激活下游报告基因 LacZ 的
表达，但其不能结合突变的 DRE 元件，进一步证实其属于转录因子。

关键词：菜用大豆；CBF 基因；克隆；功能分析
中图分类号：S 643.7 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）S-2598-01