全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（2）：313–318
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–10–10；修回日期：2010–01–04
基金项目：国家自然科学基金项目（300960224）；云南省自然科学基金面上项目（2005C0036M，2007C0036M）；云南省教育厅自然科
学基金项目（5Y0171B）；国家‘973’项目（2006CB100204）
﹡ 通信作者 Author for correspondence (E-mail: liuyating999@yahoo.com.cn)
致谢：美国北卡罗来那州立大学植物病理系主任 James W Moyer 教授为本研究提供 N & Nsm 基因引物序列。
云南省蝴蝶兰上凤仙花坏死斑病毒的鉴定
郑元仙 1，李永忠 2，刘雅婷 1,*，徐小刚 1，叶 茂 1，朱秋燕 1
（1云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201；2云南农业大学烟草学院，昆明 650201）
摘 要：2008 年对云南省主要花卉基地进行调查，获得症状表现为环斑、坏死，疑似番茄斑萎病毒属
（Tospovirus）病毒的蝴蝶兰样品。应用生物测定，结合现代电镜技术、免疫试纸条检测技术初步确定为番
茄斑萎病毒属的凤仙花坏死斑病毒（Impaliens necrotic spot virus，INSV），通过设计的 4 对引物进行 RT-PCR
扩增和测序，获得核壳体蛋白（Nucleocapsid protein）基因核酸长度为 886 nts，RNA M 编码的非结构蛋白
（Nonstructure protein，NSm）基因核酸长度为 681 nts，依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶（RdRp）基因核酸长度
为 1 048 nts，测序结果在 NCBI BLAST 网络数据库中比对，同时应用生物信息软件 DNAman 比对，其与 INSV
的同源性都达 90%以上，都证明分离到的病原物为凤仙花坏死斑病毒（INSV）。
关键词：蝴蝶兰；蝴蝶兰环斑病；凤仙花坏死斑病毒；病毒病
中图分类号：S 682.31 文献标识码：A 文章编号：0513-353X(2010)02-0313-06

Identification of Impatiens necrosis spot virus from Phalaenopsis amabilis in
Yunnan
ZHENG Yuan-xian1，LI Yong-zhong 2，LIU Ya-ting1,*，XU Xiao-gang1，YE Mao1，and ZHU Qiu-yan1
（ 1College of Agricultural and Biotechnology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2College of Tobacco
Science，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）
Abstract: Tospovirus，the only genus to infect plants in the Bunyaviridae family，can cause many
crops and flowers to the serious disease in the tropics，the subtropics as well as the temperate zone area. This
research surveyed the main flower fields of Yunnan Province in 2008. One sample with concentric rings spots
and necrosis spots symptom was collected from Phalaenopsis amabilis in Kunming. By the biological
techniques，electron microscope and ImmuStrip Test，it was confirmed that the plant was infected by
Impatiens necrotic spot virus，belong to Tospovirus. Four pairs primers was used for RT-PCR，clone and
sequencing，886 nts nucleic acid sequence of nucleocapsid protein，681 nts nucleic acid sequence of
non-structure protein in RNA M and 1 048 nts fragment of RNA-dependent RNA polymerase（RdRp）were
obtained. By comparing with network database of NCBI BLAST and multiple alignment using biological
information software DNAman，it was found that homology between the sample and Impatiens necrotic spot
virus（INSV）reached higher than 90%. It was proved that the pathogens of the sample was Impatiens necrosis
spot virus.

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Key words：Phalaenopsis amabilis；impatiens ring spot disease；Impatiens necrosis spot virus；viral
diseases

凤仙花坏死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus，INSV）是球形病毒，直径 80 ~ 120 nm，有包膜，
最早从有症状的凤仙花上分离鉴定出来（汪鑫和郭京泽，2004），可以侵染 50 个科近 300 种植物
（Windham et al.，1998 ）。
植株感染凤仙花坏死斑病毒后会产生同心环斑，叶片皱缩畸形，坏死斑，花器破裂，叶片及茎上
有棕紫色斑点等（张仲凯和李毅，2001），严重时会造成矮化，枯死，是花卉生产中最难解决的问题之
一（汪鑫和郭京泽，2004）。
蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）是目前世界上最受人们喜爱的热带兰之一。据报道，有 27 种植
物病毒能够侵染蝴蝶兰（程晓非 等，2008）。近年来，云南蝴蝶兰上发现同心环斑、坏死等疑似 INSV
的症状，且发病率逐年上升。
本研究中应用生物测定法、结合现代电镜技术、免疫试纸条检测和 RT-PCR 技术技术对这种病害
进行了鉴定研究。
1 材料与方法
1.1 病毒样本
2008 年，自云南省昆明市花卉基地采集症状表现为同心圆环状坏死斑的蝴蝶兰病株（图版，1）。
用 Ndunguru 等（2005）的方法将具有疑似症状的叶片转移到 FTA 卡上，备用。
1.2 免疫试纸条检测
使用 Agdia 公司生产的 Tomato spotted wilt virus（TSWV）（Catalog number：STX39300）和 INSV
免疫试纸条（Catalog number：STX20500），根据 AGDIA 公司使用说明，进行 TSWV 和 INSV 的检
测。
1.3 分离物形态观察
将样品进行负染制样（张仲凯和李毅，2001），置 JEM 100CX-Ⅱ型透射电子显微镜下观察。
1.4 生物接种
鉴别寄主为防虫大棚种植的黄花烟（Nicotianal rustica L.）和一点红（Emilia sonchifolia）（Morris，
2000）。
将采自田间的疑似 INSV 样本通过摩擦接种（方中达，2004）到鉴别寄主的幼嫩植株上，放置于
25 ℃防虫隔离温室中培养，1 周后记录结果。
1.5 分子生物学检测
1.5.1 RNA 提取
应用 Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit 从 FTA 卡上提取 RNA，具体操作根据 GE Healthcare
公司使用说明，略有改动，进行在 RNA 溶解溶液中加入了 2%PVP 和 1% β–巯基乙醇。
1.5.2 RT-PCR
本试验采用 TaKaRa 公司的试剂盒（TaKaRa One Step RNA PCR Kit）完成，使用 4 对引物进行
RT-PCR 扩增。
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RT-PCR 反应体系为：10 × One Step RNA PCR Buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol · L-1）10 μL，dNTP
Mixture（各 10 mmol · L-1）5 μL，RNase Inhibitor（40 U · μL-1）1 μL，AMV RTase XL（5 U · μL-1） 1
μL，AMV-Optimized Taq（5 U · μL-1）1 μL，上游特异性引物（20 μmol · L-1） 1 μL，下游特异性引物
（20 μmol · L-1）1 μL，Total RNA 1 μL；RNase Free dH2O2 4 μL，整个反应体系共 50 μL 样品。
RT-PCR 反应条件：RT 50 ℃ 30 min；94 ℃预变性 2 min；94 ℃ 变性 30 s，37 ~ 65 ℃退火 30 s，
72 ℃延伸 2 min，共 25 ~ 30 个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。而后 1%琼脂糖电泳，紫外成像
系统拍照。
表 1 INSV 基因组 RNA 扩增引物
Table 1 Primers for RT-PCR amplification of INSV genomic RNAs
基因
Gene
正向引物
Forward Primer（5′→3′）
反向引物
Reverse Primer（3′→5′）
N INSV-S2016 ATTTAACACAACACAAAGCAAAC INSV-S2873 TTTAGTAATTTGAACACTTTAAGC
NSm INSV-NsM9 CAGTGCATCAAAATTATATCTAGCCG INSV-NsM716 CATCTTTCTTGTAAACTTGATCACAT
RdRp L1 AGAGCAATCAGGCACAACTA L866 ATGGTTTTGTTGTTTCTGGT
L580 CCCGGCAAAAATAGTCAC AT L1198 TGATGCTTCTGGCTTCAAAA

1.5.3 基因测序
用 QIA quick PCR 纯化试剂盒（Qiagen Inc.，Chatsworth，CA）纯化 PCR 扩增产物，然后将纯化
产物送到北京百泰克公司进行测序。
1.5.4 序列分析
通过 BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）（Schwartz et al.，2000），将获得的序列与已
知的 INSV 序列进行同源性比较；然后用 DNAstar Editseq（DNASTAR Inc.，Madison，WI）分析序列
长度以及其他相关特性；相似性矩阵及系统进化树由 DNAman（version 2.5，Lynnon Biosoft，Quebec，
Canada）产生。
2 结果与分析
2.1 免疫试纸条
经过免疫试纸条检测发现 INSV 出现两条带（指示带和检测带），结果为阳性；TSWV 只有一条带
（指示带），结果为阴性。初步鉴定该样品的病原物是 INSV，而不是 TSWV。
2.2 分离物形态观察
经电镜观察，蝴蝶兰分离物为球状粒体，直径 80 ~ 110 nm，由一层外膜包被，有的外膜厚度较大，
有的则消失，仅见核壳体。
2.3 生物接种
经过汁液摩擦接种，在黄花烟上接种后症状为叶片畸形，坏死斑，黄化，萎蔫，叶脉坏死；一点
红叶片上出现褪绿和整个叶片畸形（图版，2、3）。
2.4 RT-PCR 扩增，序列分析
通过 INSV-S2016 /INSV-S2873 、INSV-NsM9 /INSV-NsM716、 L1/L866、L580/L1198 这 4 对引物
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进行 RT-PCR 扩增，得到云南蝴蝶兰上感染的 INSV 病毒的 N 基因核酸长度为 886 nts，Nsm 基因核酸
长度为 681 nts，RdRp 基因核酸长度为 1 048 nts（由 L1/L866、L580/L1198 两对引物得到两个片段拼
接）。
将N基因的核酸序列和GenBank公布的Tospovirus属其他种的N基因序列进行比对，用DNAMAN
软件分析得到系统进化树（Neighbor-Joining phylogeny）（图 1）。
从图 1 可以看出，云南的蝴蝶兰的 N 基因与 INSV 明显聚为一簇。
通过 DNAMAN 分别比对本试验中扩增出的序列（N 基因、Nsm 基因、RdRp 基因）与网上公布的
日本、意大利、美国等地报道的 INSV 病毒的 N 基因、Nsm 基因和 RdRp 基因的一致性，均超过 90%。
因此，进一步确定云南蝴蝶兰上感染的病毒属于 Tospovirus 属的凤仙花坏死斑病毒（Impatiens
necrotic spot virus，INSV）。
图 1 Tospovirus 核壳体基因的系统进化树
N-GENE为本试验蝴蝶兰的样品。
Fig. 1 Phylogenetic tree of Tospovirus on nucleocapsid
N-GENE: Sample from Phalaenopsis.
3 讨论
程晓非等（2008）应用电镜观察、DAS-ELISA 以及 RT-PCR 检测，从症状表现黄化、环斑的云南
蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）病样中分离得到的一个病毒分离物 Tospo-Pha，该分离物与 Tospovirus
属病毒血清组Ⅳ亲缘关系较近，与 INSV 进化关系较远。
刘雅婷等（2008）报道云南烟草上发生的两个组群，其中一个组群与 TSWV 相似值高达 96%，而
另一个组群与血清组Ⅳ亲缘关系较近，与 INSV 进化关系较远。刘雅婷等（2009）报道云南建水番茄
上发生 Tospovirus 属病毒，其与血清组Ⅳ亲缘关系较近，与 INSV 进化关系较远。
2008 年，云南出入境检验检疫局的张巧萍等（2008）应用酶联免疫吸附检测法（ELISA）和 RT-PCR
技术从表现有同心圆褪绿斑的进境盆栽文心兰上检测出凤仙花坏死斑病毒。并且利用 RT- PCR 方法检
2 期 郑元仙等：云南省蝴蝶兰上凤仙花坏死斑病毒的鉴定 317

测得到 500 bp 的预期核酸片段。
本研究中采用免疫试纸条检测、电镜观察和分子生物学等方法对症状表现为同心圆环斑和坏死斑
的蝴蝶兰环斑病进行鉴定，确定其病原物为 INSV 病毒，属于 Tospovirus 属病毒血清组Ⅲ，是首次在
云南本土种植的蝴蝶兰上发现了 INSV，证明该病毒在云南的发生。
云南省地处温带、亚热带和热带地区又是我国花卉的主要集散地，非常适合 INSV 的发生，且 INSV
的传播介体复杂，因此，凤仙花坏死斑病毒在云南花卉上进一步传播的可能性很大，如不加以防治将
对云南省的花卉产业造成重大损失。


图版说明：1. INSV 在自然寄主蝴蝶兰上表现的症状；2. 感染了 INSV 的黄花烟；3. 感染了 INSV 的一点红。
Explanation of plates：1. Symptoms on natural host Phalaenopsis；2. Nicotianal rustica L. was infected with INSV；3. Emilia sonchifolia was infected
with INSV.

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