全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (5) : 743 - 748
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 12 - 09; 修回日期 : 2009 - 03 - 24
基金项目 : 广州市科技攻关计划项目 (2004Z32E0411)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xyzh28@1261com; Tel: 020281551937)
红掌炭疽病病原的分离鉴定及其核糖体 DNA2ITS
序列分析
邢红梅 1, 2 , 丁　平 2 , 王克荣 2 , 周晓云 13
(1 广州花卉研究中心 , 广州 510360; 2 南京农业大学植保学院 , 南京 210095)
摘 　要 : 在广州、南京和扬州等地红掌病株上分离的炭疽菌中存在形态差异明显的两个群体。各选取
两个代表菌株进行形态特征、致病性、寄主范围鉴定及核糖体 DNA2ITS序列分析。结果表明 , 红掌炭疽病
病株上有两种致病菌 : 胶孢炭疽和毁灭炭疽 , 后者导致红掌炭疽病为首次报道。
关键词 : 红掌 ; 炭疽病 ; 病原鉴定 ; 核糖体 DNA2ITS
中图分类号 : S 68211 + 4　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0520743206
Iden tif ica tion of C olle totrichum sp . from A n thu rium andraeanum and Its
Sequenc ing of R ibosoma l D NA2ITS
X ING Hong2mei1, 2 , D ING Ping2 , WANG Ke2rong2 , and ZHOU Xiao2yun13
(1 Guangzhou Flow er Research Center, Guangzhou 510360, Ch ina; 2 College of P lant Protection, N anjing A gricu ltura l U niversity,
N an jing 210095, China)
Abstract: Among the Colletotrichum strains isolated from A nthurium andraeanum in Guangzhou, Nan2
jing, Yangzhou, there were two group s exhibited different morphology on the culture. Two strains of each
group were chose for species identification with the morphological character, pathogencity on p lants, host
range and the sequence of ribosomal DNA2ITS. The results indicated that these strains belong to two species,
Colletotrichum gloeosporioides and C. destructivum , and the latter was first reported as a pathogen in A nthurium
andraeanum. Both species could infect solely, crossly and latently.
Key words: A nthurium andraeanum ; Colletotrichum ; pathogen identification; ribosomal DNA2ITS
近年来 , 红掌 (An thu rium andraeanum ) 炭疽病 (Colletotrichum sp. ) 已成为其生产与销售中的重
要病害 , 有些地区已经造成严重危害。其主要症状为 : 从叶尖和叶缘开始发病 , 形成半圆形或不规则
形病斑 , 病健交界明显 , 有黄色晕圈 , 病斑暗褐色 ; 叶面不规则着生小黑点 , 当空气湿度大时 , 有粉
红色的点状粘质物溢出。
此前 , 关于红掌上发生炭疽病菌的种类及其特性还不清楚。作者采集了红掌种植基地炭疽病病株
进行常规分离 , 并对病原菌形态、致病性、寄主范围及分子生物学鉴定等进行了研究。
1　材料与方法
111　标本来源与病原菌的分离纯化
标样于 2004—2006年采自广州花卉研究中心红掌种植基地、扬州江都雅典娜花卉基地、南京花
卉市场等。
选取新发病的叶片作为分离材料 , 进行常规组织分离 , 经单孢纯化、培养获得单孢菌株共 136
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个 , 分别编号为 C01, HZ21, YZ21等。
112　致病性测定
采用 Kochp s法将发病组织上分离到的病原菌纯培养物 (孢子 ) 制成悬浮液 (孢子浓度为 105 ～
106个 ·mL - 1 )。在 25 ℃, RH 90% ～100%的光照培养箱中 , 用消毒后的 5#昆虫针穿刺红掌植株中上
部叶片的叶尖、叶缘及主叶脉间 , 形成创伤 , 将孢子悬浮液对叶片伤口进行喷雾接种 , 每个菌株接种
8株苗 , 3次重复 , 以无菌水为对照。
接种后保湿 2 d, 每隔 1～2 d观察症状。发病后 , 制作切片镜检产孢结构 , 并从病斑再次分离病
原菌 , 确认致病菌。
113　病原菌形态与培养性状测定
在 PDA培养基上培养 7 d后 , 观察菌落的颜色、形状及是否产生菌核。观察分生孢子的形状和
大小。观察分生孢子盘有无刚毛。
滴加适当浓度的孢子悬浮液于投影胶片上 , 25 ℃保湿培养诱导附着胞形成 , 12 h后观察附着胞
的形态。
114　寄主范围测定
供试寄主植物 11种 : 白掌 (Spa th iphyllum koch ii Engler & Krause. ) (天南星科花烛属 ) , 花叶万
年青 (D ieffenbach ia picta) (天南星科花叶万年青属 ) , 绿巨人 ( Spa th iphyllum floribundum L ind. et.
Andre NE. B r. cv. M ) (天南星科苞叶芋属 ) , 康泰凤梨 (Guzm ania con tinen ta l) (凤梨科擎天属 ) , 孔
雀竹芋 (Cala thea m akoyana) (竹芋科肖竹芋属 ) , 山海带 (D racaena cam bodiana) (龙舌兰科山茱萸
属 ) , 石斛兰 (D endrobium sp. ) (兰科石斛兰属 ) , 蝴蝶兰 ( Phalaenopsis am abilis) (兰科蝴蝶兰属 ) ,
大花惠兰 (Cym bid ium sp. ) (兰科兰属 ) , 也门铁 (D racaena arborea ) (百合科龙血树属 ) , 苹果
(M alus pum ila M ill. ) (蔷薇科苹果属 )。
在温室花盆中种植 , 出苗后于 25 ℃, RH 90%～100%的光照培养箱中培养。接种方法同红掌接
种 , 每种寄主接种幼苗 6株 , 3株喷清水作对照。接种后保湿 2 d, 每隔 1～2 d观察症状。以红掌
(品种为 ‘红宝石 ’) 作为对照。
115　rD NA内转录间隔区 ( in terna l tran scr ibed space, ITS) 的 PCR扩增与测序
11511　菌丝体的培养与收集 　
将斜面保存的菌株接种在 PDA培养基上进行活化。将活化的菌株移接在铺有灭菌玻璃纸的 PDA
平板上 (每皿约 30 mL培养基 ) , 每皿均匀接种 3个菌丝块 , 每菌株接 2个平板。于 22～25 ℃暗培养
4～6 d后 , 用灭菌解剖刀刮取菌丝 , 置于 5 mL塑料离心管中 , 真空冷冻干燥 24～48 h后 , 在离心管
中用玻棒将其捣碎成菌丝粉 , 置于 - 20 ℃保存备用。
11512　基因组 DNA的提取 　
取各待测菌株的菌丝粉 012 g分别置于 115 mL的 Eppendorf管中 , 加 900μL CTAB提取液 , 90
μL 10%的 SDS溶液 , 振荡混匀 , 55 ℃水浴 1 h, 12 000 r·m in - 1离心 15 m in。取上清液 , 加入等体
积的酚 ∶氯仿 ∶异戊醇 (25∶24∶1) , 轻轻颠倒混匀 , 12 000 r·m in - 1离心 10 m in。取上清液加等体积氯
仿轻轻混匀 , 12 000 r·m in - 1离心 10 m in, 取上清液加入 1 /10体积的 NaAc、2倍体积的冰乙醇 , 在
- 20 ℃下沉淀 1 h, 12 000 r·m in - 1离心 10 m in。弃上清液 , 70%的乙醇洗涤 1次 , 干燥后溶于 30
μL灭菌水中备用。
11513　 ITS扩增　
用真核生物核糖体 DNA通用引物 ITS1和 ITS4进行 PCR扩增。其序列为 , ITS1: 5′2TCCGTAG2
GTGAACCTGCGG23′, ITS4: 5′2TCCTCCGCTTATTGATATGC23′。
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　5期 邢红梅等 : 红掌炭疽病病原的分离鉴定及其核糖体 DNA2ITS序列分析 　
11514　PCR反应条件 　
PCR的反应混合液的总体积为 25μL: 包括相应浓度的模板 DNA, 015μmol引物 , 4种 dNTP各
50μmol, 215μL 10 ×PCR反应缓冲液 , 2 mmolMg2 + , 1125单位 Taq酶 ( Promega) , 混合离心后加 1
滴矿物油 , 在 PE2400 PCR仪上进行扩增反应。反应程序为 : 94 ℃预变性 5 m in; 然后进入循环 , 94
℃变性 1 m in, 55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 m in, 共 31个循环 ; 最后 72 ℃延伸 7 m in。
用 UN IQ210柱式试剂盒从胶中回收 PCR产物 , 连接在 PMD182T载体上 , 转化 E1coli JM109, 在
加有 Amp的 LB平板上筛选阳性转化子。用菌落 PCR验证阳性转化子 , 并委托北京三博远志生物有
限责任公司测序。
11515　 ITS序列分析 　
将菌株的核糖体 DNA2ITS序列与 GenBank中核酸数据库 ( http: //www1ncbi1nlm1gov1blast) 进行
同源性比较。
2　结果与分析
211　分离结果与供试菌株的选取
共分离培养获得 136个单孢菌株 , 其在 PDA平板上形成菌落形态差异明显的两个群体。分别从
两个群体中各选取 2个代表菌株 (C038和 C049; C08和 C014) 作为供试菌株。
在分离过程中发现 : 同一个病斑上可同时分离到上述两种菌株 ; 在未发病的叶片上也可分离到以
上两种菌株 ; 以菌株 C08为代表的群体为优势群体 (占 6215% )。
212　病原菌形态与培养性状
菌株 C038和 C049在 PDA平板上培养颜色有两种变化 : ①初期菌落白色 , 后转灰白色 ; ②初期
菌落白色 , 后转灰绿色。两个菌株均菌丝疏松絮状 , 气生菌丝茂盛 , 后期在培养基上产生球形菌核 ,
有时连成块状 , 菌核大小不一 , 011～014 cm。菌落表面易形成橘红色的粘孢子团。分生孢子柱形 ,
一端稍尖 , 一端钝圆 , 大小为 1315～1710μm ×410～510μm, 有时含有油球。附着胞黑色 , 近圆形
(图 1)。分生孢子梗无色透明 , 具隔膜 , 成排生于分生孢子盘内。根据其形态特征 , 鉴定为胶孢炭疽
菌 Colletotrichum gloeosporioides ( Penz. ) Penz. & Sacc. 。
图 1　炭疽菌菌株 C038的形态
A: 菌落 ; B: 分生孢子 ; C: 附着胞。
F ig. 1　M oda lity of stra in C038 in Colletotrichum sp.
A: Colony; B: Conidia; C: App ressoria.
菌株 C08和 C014在 PDA平板上初期菌落为白色 , 中间逐渐出现墨绿色斑块 , 并扩展连成片 , 后
期菌落变黑褐色 , 气生菌丝少 , 质硬 , 在培养基上形成细碎状菌核 , 有时菌落表面会形成桔黄色的粘
孢子团 (菌落形态稳定 )。分生孢子筒状 , 两端钝圆 , 大小 18～22μm ×315～415μm, 与菌株 C038
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和 C049相比 , 较狭长 , 中间有油球。附着胞黑色 , 形状差异大 , 有近圆形、不规则形 , 边缘裂瓣状
(图 2)。根据其形态特征 , 鉴定为毁灭炭疽菌 Colletotrichum destructivum OpiGara。
由此可以初步确定红掌上存在两种炭疽菌。
图 2　炭疽菌菌株 C014的形态
A: 菌落 ; B: 分生孢子 ; C: 附着胞。
F ig. 2　M oda lity of stra in C014 in Colletotrichum sp.
A: Colony; B: Conidia; C: App ressoria.
213　致病性测定
将菌株 C038和 C049穿刺接种在红掌的中上部叶片边缘及叶脉间 , 接种 3 d后 , 接种部位变黑形
成褐色病斑 , 并逐渐扩展 , 在外围形成黄色晕圈 , 但速度较慢 , 早期大约 4 d扩展 012 cm, 中后期病
斑似乎不再扩展 , 叶肉组织逐渐干枯掉 , 接种后 30 d, 病斑处形成子实体 (图 3)。
将菌株 C08和 C014接种红掌后 5 d发病 , 其症状与 C038接种的症状相同 , 但扩展速度比 C038
慢 (图 3)。
致病性测定发现 : 两者接种后叶缘比叶片其他部位易发病 , 且症状与田间发病相同 , 从病斑处再
次分离得到的菌株均与原菌株相同。致病性测定证明两者均为病原菌。
图 3　炭疽菌接种红掌 30 d后的症状
F ig. 3　Sym ptom on A n thu rium andraeanum leaves caused by
Colleto trichum sp. 30 days after inocula tion
214　寄主范围测定
通过人工接种 , 分离自红掌的炭疽菌除了侵染红掌外 , 也能侵染其他科的寄主 , 菌株不存在寄主
专化性。
菌株 C038和 C049接种的结果为 : 所有供试植株都会发病 , 在接种处会出现黄化症状 , 但发病
程度不一样 , 兰科的石斛兰、蝴蝶兰、大花惠兰发病程度比红掌重 , 其他属植株发病程度都比红掌
轻。
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　5期 邢红梅等 : 红掌炭疽病病原的分离鉴定及其核糖体 DNA2ITS序列分析 　
菌株 C08和 C014接种的结果是除也门铁外其他供试植株都发病 ; 发病症状与菌株 C038相同。
发病程度也以石斛兰、大花惠兰、蝴蝶兰最重 , 其他属的植株发病程度都比红掌轻。
215　 ITS序列分析
选取两种炭疽菌的代表菌株 : 菌株 C038和 C049 (C. g loeosprioides) , 菌株 C08、C014和 HZ215
(C. destructivum ) , 分别对其核糖体 DNA2ITS序列进行测序。测序结果显示 : 菌株 C038和 C049的
ITS序列与菌株 C08、C014、HZ215的同源性为 85%～87%。
对菌株 C038, C049的核糖体 DNA2ITS序列进行分析 , 结果显示 : 不包括引物结合区 , 两个菌株
的核糖体 DNA2ITS基因序列长度分别为 532 bp和 534 bp。将 B last与 GenBank (NCB I) 中核酸数据库
进行同源性比较 , 发现在与其同源性最高的 100个序列中 , 有 98个是 C. g loeosporioides或其有性型
Glom erella cingu la ta, 且同源性为 97%～98% , 两个菌株的同源性也达到 98%。说明 C. g loeosporioides
种内不同个体之间的 ITS序列是非常保守的 , 分子生物学的鉴定也进一步确认了生物学鉴定的结果。
对 3个菌株 C08、C014和 HZ215进行分析 , 结果显示 : 不包括引物结合区 , 3个菌株的核糖体
DNA2ITS基因序列长度均为 538 bp。将 B last与 GenBank中核酸数据库进行同源性比较 , 发现与其同
源性最高的 100个序列中 , 98个明确为 C. destructivum 或其有性型 , 3个测序菌株的同源性也达到
99% , 说明 C. destructivum 种内的 ITS序列是保守的。
3　讨论
由于真菌种、属间 ITS序列的稳定性 , 能真实反映同一属内不同种间以及某些种内菌株间的序列
差异 , 因此 , ITS序列分析广泛地被应用在真菌属种分类的研究领域中。目前 , 真菌基因组核糖体
DNA的基因间隔区 ITS ( internal transcribed space) 序列信息被大量应用于真菌属内不同种或近似种
间的系统发育研究中 , 在疫霉属、炭疽菌属、蜜环菌属、轮枝菌属、小克银汉属、囊壳属、木霉属、
根瘤菌属等许多重要真菌属的系统分类中得到应用 ( Cooke et al. , 1996; A ltomare et al. , 1997;
Johnson & Jones, 1997; Leclerc2Potvin et al. , 1999; 王源超 等 , 2000; 彭桂香 等 , 2004; 李琬 等 ,
2007)。王国芬等 (2006) 对香蕉叶斑病进行鉴定和 ITS序列分析 , 证实了目前引起海南省香蕉叶斑
病的主要病原菌为斐济球腔菌 (M ycosphaerella f ijiensis)。Yan等 (1995) 利用 ITS序列分析和比较形
态学研究了被一些人认为是同种异名的 Phia lophora am ericana和 P. verrucose, 得出了它们是不同种的
结论。
本试验中对红掌炭疽菌核糖体 ITS序列进行了分析 , 按照炭疽属种内菌株间的同源性至少在 97%
以上 ( Sreenivasp rasad et al. , 1996 ) 的原则 , ITS的测序结果证明菌株 C038、C049与菌株 C08、
C014、HZ215分属两个种 , 与形态学鉴定结果吻合 , 说明同一个种内的菌株之间 ITS序列是保守的 ,
不同种的菌株间 ITS序列的同源性较低 , 为鉴定红掌炭疽菌提供了有力证据。测序菌株与 B last和
GenBank核酸数据库中 AR3750 ( Colletotrihum sp. ) 及 AR3749 ( Glom erella sp. ) ITS的同源性高达
99% , 认为这两个菌种虽然没有鉴定到种 , 但据其同源性推测应是 C. destructivum 或其有性型。所以
对于那些引起重大经济作物的真菌病害及属内种间较相似的病原物 , 除采用病原菌的形态鉴定和柯赫
氏法则证明外 , 分子生物学检测手段可作为快速诊断病原物种类的可靠、简便的技术。但部分疫霉种
的 ITS序列差异很小 , 以此为靶标设计的引物难以区分这些疫霉菌及其近缘种 (孟军 , 2008) , 说明
利用 ITS序列进行真菌种的分类存在一定的局限性。
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