全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（11）：1745–1750
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–05–20；修回日期：2010–09–30
基金项目：国家科技支撑计划项目（2008BAD92B08）；国家科技基础条件平台项目（2005DKA21207-28）
* E-mail：Zhyong@sdip.cn
我国桃树新病害——叶枯病的病原菌鉴定及生
物学特性研究
张 勇*，李晓军，曲健禄，范 昆，杨建明
（山东省果树研究所，山东泰安 271000）
摘 要：对我国桃树上发生的一种新病害进行了病原鉴定及生物学特性研究。通过形态特征观察、
致病性测定、rDNA-ITS 序列测定及分析，确定该病害为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起的叶
枯病，病原菌 rDNA-ITS 区序列已在 GenBank 上登录（GenBank 登录号：GU270581）。病原菌生长的适
宜温度为 25 ~ 30 ℃，适宜 pH 5 ~ 7，适宜碳源为蔗糖，适宜氮源为酵母。
关键词：桃树；叶枯病；立枯丝核菌；生物学特性
中图分类号：S 662.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）11-1745-06

Pathogen Identification and Biological Characteristic of Leaf Blight — A
New Peach Disease in China
ZHANG Yong*，LI Xiao-jun，QU Jian-lu，FAN Kun，and YANG Jian-ming
（Shandong Institute of Pomology，Tai’an，Shandong 271000，China）
Abstract：The pathogen causing leaf blight on peach was isolated from diseased leaf. Based on
morphological characteristics，pathogenicity test，the sequence of ribosomal DNA-ITS，the pathogen was
identified as Rhizoctonia solani Kühn，the rDNA-ITS sequence data of the pathogenic fungus has been
submitted to GenBank（GenBank accession number：GU270581）. The temperature for mycelial growth of
the pathogen ranged from 10 ℃ to 35 ℃，with the optimum temperature 25–30 ℃. The pH ranged from
4–10 with the optimum pH 5–7. For mycelial growth，the optimum carbon and nitrogen source were
sucrose and yeast，respectively.
Key words：peach；leaf blight；Rhizoctonia solani Kühn；biological characteristics

2007—2009 年，作者在山东单县、肥城等地桃园调查发现一种新的病害，其症状与刘开启（1999）
报道的苹果叶枯病症状相似，定名为桃树叶枯病；该病可导致桃树生长季节叶片腐烂，枝条枯死，
发病重的果园病株率在 10%以上，严重削弱树势，降低产量和品质。为了明确该病的病因，为病害
防治提供理论依据，结合传统形态鉴定及分子生物学技术，对该病害的病原菌及其生物学进行了研
究，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 病情调察、病原的分离与形态鉴定
2007—2009 年于桃树生长季节调查山东桃产区（泰安、淄博、临沂、潍坊、烟台等）叶枯病发

1746 园 艺 学 报 37 卷
生和危害情况，并定株、定期进行系统观察，详细记载各个时期症状特点及发病规律。
自单县、肥城、蒙阴等地桃园采集病枝、病叶，组织分离参照方中达（1998）植病研究法，直
接挑取菌核或菌膜，在 PSA 培养基上分离培养，长出菌落后，挑取单一菌落的少量菌丝，移植到
PSA 平板纯化培养。病原菌的形态学特征鉴定参照陆家云（2001）和魏景超（1979）的描述。
1.2 病原菌的致病性测定
供试品种为肥城桃（Prunus persica‘Fei-Cheng’）及重阳红（Prunus persica‘Chongyanghong’），
接种材料为离体枝梢及盆栽幼树。接种前用 75%酒精对枝条、叶片进行表面消毒，以直径 5 mm 的
菌丝块进行无伤接种，无菌的 PSA 培养基为对照。离体枝梢每品种接种 30 条；盆栽幼树每品种 6
株，每株树接种 5 处。接种后置常温下保湿 48 h，每 24 h 调查 1 次发病情况。
1.3 病原菌生物学特性
酸碱度试验：将 0.1 mol · L-1 HCL 和 0.1 mol · L-1 NaOH 及 PSA 培养基高压灭菌，调节 PSA 培
养基 pH 值分别为 3、4、5、6、7、8、9、10、11，挑取直径 5 mm 的病原菌菌丝块接种于 PSA 培
养基中央，25 ℃培养。每处理 3 次重复，逐日观察菌丝生长情况，十字交叉法测量菌落直径。
温度试验：供试菌株活化培养 72 h 后，挑取直径 5 mm 的菌丝块接种于 PSA 培养基中央，于 5、
10、15、20、25、30、35、40 ℃下培养，3 次重复，逐日观察菌丝生长情况，十字交叉法测量菌落直径。
营养条件试验：基础培养基是以 Richard 培养液加琼脂配制而成，具体成分及含量为：KNO3 10
g、MgSO4 · 7H2O 2.5 g、KH2PO4 5 g、FeCl2 0.02 g、蔗糖 50 g 、琼脂 35 g、蒸馏水 1 000 mL。按相
同的比例，分别以葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉、半乳糖取代基础培养基中的蔗糖，配制成不同
碳源的培养基。同样分别以蛋白胨、NH4NO3、脲素、酵母、谷氨酸取代基础培养基中的 KNO3，配
制成不同氮源的培养基。每处理 3 次重复，挑取直径 5 mm 的病原菌菌丝块接种于 PSA 培养基中央，
于 25 ℃下培养，每天观察菌丝生长情况，十字交叉法测量菌落直径。
1.4 病原菌rDNA-ITS PCR扩增和序列分析
病原菌活化培养72 h后，挑取直径 5 mm的菌丝块接种于铺有无菌玻璃纸的PSA平板上，5 d后收
集菌丝。采用CTAB法提取和纯化基因组DNA（Edwards et al.，1991）。采用rDNA-ITS通用引物ITS1
和ITS4进行PCR扩增，扩增引物为ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGC
TTATTGATATGC-3′。PCR反应体系总体积25 μL，反应液为：10 × PCR buffer 2.5 μL，25 mmol · L-1
MgCl2 2 μL，10 mmol · L-1dNTP 2 μL，5 U · μL-1 Taq酶0.5 μL（以上试剂均由TaKaRa公司提供），
模板DNA 2 ng，引物ITS1和ITS4（由上海生工公司合成）各1 μL（25 μmol · L-1），用ddH2O使总体
积达到25 μL，在PCR扩增仪（PTC-200）上进行扩增。扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min；
51 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min；共32个循环；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。
采用上海生物工程技术服务有限公司的 DNA 凝胶回收试剂盒，从 1.0%的琼脂糖凝胶中回收
ITS 片段，并用紫外分光光度计（UV1601，SHIMADZU 公司）检测浓度。回收产物用大连宝生物
工程公司的 pMD18-T Vector 连接，转化于大肠杆菌（E. coli）DH5α 菌株感受态细胞，经蓝白斑筛
选和 PCR 鉴定后，交上海生物工程技术服务有限公司完成测序。
用 BLAST 软件，将分离所得菌株的 rDNA-ITS 序列与 GenBank 核酸数据库（http：//www.ncbi.
nlm.nih.gov）中相关序列进行序列比对和同源性分析。用 MEGA version 4.0（Tamura et al.，2007）
进行系统发育分析和进化树的构建。进化距离分析采用邻位相连法（NJ，neighbor-joining），用
Bootstrap 对系统树进行检验，1 000 次重复。
11 期 张 勇等：我国桃树新病害——叶枯病的病原菌鉴定及生物学特性研究 1747

2 结果与分析
2.1 危害症状
田间调查，桃树叶枯病在山东各个桃产区均有不同程度发生，一般病株率在 3% ~ 5%，严重的
在 10%以上。
病原菌主要在病残枝叶上以菌丝体或形成菌核越冬，翌年春季菌核萌发生成营养菌丝侵染叶
片，4、5 月份开始发病，7—9 月份为发病盛期。田间发病往往集中于一个枝，叶片多从叶尖或叶缘
开始水浸状变褐枯死，叶内发生的病斑多为圆形、褐色，以后迅速扩展到整片叶，导致干枯；病叶
一般不立即脱落，翌年枝上仍有残存病叶。病叶及枝条上有银灰色菌丝体，以后形成菌膜。最后可
形成半球形或不规则菌核，灰褐色至黑褐色。发病后期病枝病叶粘贴在一起，黄化焦枯（图 1），严
重的导致枯枝死树。
年度间发病情况有差异，主要与气候、降雨有关，高温多雨利于叶枯病发生。地势低洼、排水
不良、果园密闭、通风透光不良、管理粗放等情况下发病重。
图 1 桃叶枯病田间症状
Fig. 1 Symptoms of peach leaf blight

图 2 接种TJH-2后桃叶发病症状
Fig. 2 Symptom on leaf inoculated with TJH-2

1748 园 艺 学 报 37 卷
2.2 病原菌的致病性
直接挑取菌核即可获得病原菌纯培养TJH-2，25 ℃菌丝在PSA培养基上生长良好，5 ~ 7 d左右即
可形成菌核。接种离体新梢、盆栽幼树，发病率为87% ~ 100%，对照发病率为零。发病材料都表现
典型的叶片腐烂、枝条枯死症状（图 2），从中均分离获得TJH-2。
2.3 病原菌培养性状及形态特征
在PSA平板上，TJH-2菌落呈放射状生长，菌丝蛛网状，初期无色，后期黄褐色，生长迅速。菌
核近球形至不规则形，直径约为 0.3 ~ 5.0 mm，表面粗糙，内外颜色一致；幼嫩菌核白色，老熟菌
核栗褐色或黑褐色，多产生于培养基表面或紧密贴在培养皿的盖和壁上。菌丝粗壮，直径 7 ~ 10 μm，
菌丝细胞多核；多为直角分枝，分枝处稍有缢缩，近分枝处有1个隔膜。老熟菌丝缢缩明显，部分膨
大成念珠状。不产生无性孢子（图3）。
图 3 TJH-2的形态特征
Fig. 3 Morphological characteristics of TJH-2
2.4 病原菌生物学特性
叶枯病原菌 TJH-2 在 pH 4 ~ 10 范围基质中均可生长，而以 pH 5 ~ 7 基质中生长最好，菌丝生
长扩展快，致密浓厚，表明微酸性培养基质较适合该病原菌生长（图 4）。叶枯病菌 TJH-2 在 10 ~
35 ℃温度范围内均可生长，适宜生长温度为 25 ~ 30 ℃（图 4）。由表 1 可见，不同营养条件对叶枯
病菌 TJH-2 生长的影响差异较大。综合分析菌丝扩展及菌丝生长量情况，适合该病原菌生长的最佳
碳源为蔗糖，最佳氮源为酵母。

图 4 pH 值和温度对 TJH-2 菌丝生长的影响
Fig. 4 The effect of pH and temperature on mycelial growth of TJH-2


11 期 张 勇等：我国桃树新病害——叶枯病的病原菌鉴定及生物学特性研究 1749

图 5 TJH-2 PCR扩增产物电泳图
Fig. 5 Electrophoresis of PCR product of TJH-2
表 1 营养条件对病原菌 TJH-2 生长的影响
Table 1 Effects of carbon and nitrogen on TJH-2 mycelial growth
碳源
Carbon source
生长速率/（cm · d-1）
Growth rate
菌丝生长量
Amount of mycelium
氮源
Nitrogen source
生长速率/（cm · d-1）
Growth rate
菌丝生长量
Amount of mycelium
蔗糖 Sucrose 3.0 茂密 Thickish 蛋白胨 Peptone 3.0 较密 Thick
葡萄糖 Glucose 2.8 较密 Thick 脲 素 Urea 2.6 稍稀薄 Thinnish
麦芽糖 Maltose 3.0 较密 Thick 硝酸铵 NH4NO3 1.7 稍稀薄 Thinnish
甘露糖 Marnose 3.0 稍稀薄 Thinnish 谷氨酸 Glutamate 1.6 稀薄 Thin
淀粉 Starch 3.0 稍稀薄 Thinnish 酵母 Yeast 3.0 茂密 Thickish
半乳糖 Galactose 3.0 稍稀薄 Thinnish
2.5 病原菌的rDNA-ITS序列验证及系统发育分析
引物ITS1和ITS4从叶枯病菌TJH-2基因组
DNA中扩增出一条大小约为720 bp的片段（图
5），测序结果表明该菌的rDNA-ITS区大小为717
bp，序列已在GenBank上登录（GU270581）。
将TJH-2的rDNA-ITS序列与GenBank中已有的
DNA序列进行同源性比较，发现与其同源性最
高的ITS序列菌株均为立枯丝核菌（Rhizoctonia
solani Kühn）或立枯丝核菌的有性态瓜亡革菌
［Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk］，TJH-2
与它们的同源性为98% ~ 100%。根据TJH-2 ITS
序列，连同从GenBank下载的7个最相似物种的
ITS序列，构建系统发育树（图6），结果TJH-2的序列与GenBank中立枯丝核菌（FJ746936）及立枯
丝核菌的有性态瓜亡革菌（AF067641）的遗传距离最近，以99%的支持率聚在一起，位于系统发育
树的同一分支，支持了形态鉴定结果。根据病原菌的形态和生物学特征，以及ITS序列同源性比较的
结果，确定桃叶枯病的病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）。
图 6 基于rDNA-ITS区碱基序列构建的NJ系统发育树
Fig. 6 Neighbor-joining（NJ）phylogenetic tree based on rDNA-ITS region sequences
3 讨论
桃树叶枯病是我国桃树上近年来发生的一种新病害，结合形态学及分子生物学的方法, 参阅相
关资料（Mazzola，1997；王洪凯 等，1997；黄江华 等，2002），鉴定该病的病原菌为立枯丝核菌
（Rhizoctonia solani Kühn）。立枯丝核菌危害寄主多，分布范围广，可引起苗木立枯病，但危害桃
树造成叶片腐烂、枝条枯死尚未见报道。
生物学特性研究表明，桃树叶枯病菌在10 ~ 35 ℃均可生长，适宜生长温度为25 ~ 30 ℃；与陈
1750 园 艺 学 报 37 卷
京元等（2006）记述的湿地松立枯丝核菌最高生长温度40 ℃的结果有差异；与李增平和陈坚（2008）
记述白木香立枯丝核菌最高生长温度35 ℃及肖功年等（1999）报道杧果立枯丝核菌最适生长温度
25 ~ 31 ℃相似。桃树叶枯病菌在pH 4 ~ 10范围基质中均可生长，而以pH 5 ~ 7基质中生长最好，与
陈京元等（2006）记述的湿地松立枯丝核菌生长适宜pH 7 ~ 8的结果有差异；对碳源利用以蔗糖最
佳，对氮源利用以酵母最佳，与陈京元等（2006）的报道相似，与李增平和陈坚（2008）记述白木
香立枯丝核菌有差异。分析原因，存在差异可能与地理环境及寄主等因素有关。
桃树叶枯病田间菌源自何而来，传播媒介是什么，目前尚未深入研究。调查发现，田间有明显
发病中心，整个生长季只在发病中心周围近距离扩展。桃树叶枯病能造成死枝、死树等严重危害，
但其扩展速度较慢，只要田间及时发现并控制病株，辅以药剂防治，完全可以控制其危害。桃树叶
枯病病原的鉴定为下一步进行该病害的防治研究及抗病品种筛选研究奠定了基础。

References
Chen Jing-yuan，Huo Xian-qi，Cai San-shan，Xu Hong-mei，Tu Jun-jie，Hou Ming-sheng，Ji Bao-zhong. 2006. Identification and characterization
of the pathogen causing damping-off on seedlings of slash pine. Journal of Huazhong Agricultural University，25 (2)：128–131. (in Chinese)
陈京元，霍宪起，蔡三山，徐红梅，涂俊杰，侯明生，嵇保中. 2006. 湿地松猝倒病病原鉴定及其生物学特性的观察. 华中农业大学学
报，25 (2)：128–131.
Edwards K，Johnstone C，Thompson C. 1991. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucl Acids
Res，19：1349.
Fang Zhong-da. 1998. Plant pathology research methods. Beijing：China Agriculture Press. (in Chinese)
方中达. 1998. 植病研究方法. 北京：中国农业出版社.
Huang Jiang-hua，Yang Mei，Zhou Er-xun，Qi Pei-kun. 2002. Research advances in Rhizoctonia. Journal of Zhongkai Agrotechnical College，15 (1)：
61–67. (in Chinese)
黄江华，杨 媚，周而勋，戚佩坤. 2002. 丝核菌研究进展. 仲恺农业技术学院学报，15 (1)：61–67.
Li Zeng-ping，Chen Jian. 2008. Identification and characteristics of the damping-off pathogen on Aquilariasinensis（Lour.）Gilg. Chinese Journal of
Tropical Crops，29 (2)：231–236. (in Chinese)
李增平，陈 坚. 2008. 白木香立枯病的病原鉴定及生物学特性. 热带作物学报，29 (2)：231–236.
Liu Kai-qi，Wang Hong-kai，Wu Xun-chi. 1999. Identification of apple leaf blight—a new apple disease in China. Acta Phytopathologica Sinica，
29 (3)：284–285. ( in Chinese)
刘开启，王洪凯，吴洵耻. 1999. 我国苹果上发生的一种新病害——丝核菌叶枯病的鉴定. 植物病理学报，29 (3)：284–285.
Lu Jia-yun. 2001. Plant pathogenic mycology. Beijing：China Agriculture Press. ( in Chinese)
陆家云. 2001. 植物病原真菌学. 北京：中国农业出版社.
Mazzola M. 1997. Identification and pathogenicity of Rhizoctonia spp. isolated from apple root s and orchard soils. Phytopa-thology，87 (6)：582–587.
Tamura K，Dudley J，Nei M，Kumar S. 2007. MEGA4：Molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）software version 4.0. Molecular Biology
and Evolution，24：1596–1599.
Wang Hong-kai，Liu Kai-qi，Wu Xun-chi. 1997. Advance of taxonomy of Rhizoctonia. Journal of Shandong Agricultural University，28 (3)：
375–382. (in Chinese)
王洪凯，刘开启，吴洵耻. 1997. 丝核菌分类研究进展. 山东农业大学学报，28 (3)：375–382.
Wei Jing-chao. 1979. A manual for fungi identification. Shanghai：Shanghai Science and Technology Press. (in Chinese)
魏景超. 1979. 真菌鉴定手册. 上海：上海科学技术出版社.
Xiao Gong-nian，Pang Zong-wen，Li Xiang-ping，Yang Sheng-yuan，Liang Zhi-qun. 1999. Identification of Rhizoctonia solani Kühn from Mango
and studies of its biological characteristics. Journal of Guangxi University：Nat Sci Ed，4：268–270. (in Chinese)
肖功年，庞宗文，李湘萍，杨胜远，梁智群. 1999. 芒果果腐病原菌（Rhizoctonia solani Kühn）的鉴定及生物学特性研究. 广西大学学
报：自然科学版，4：268–270.