全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（9）：1733–1740 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–04–18；修回日期：2011–08–23
基金项目：国家自然科学基金项目（31171930）；重庆市自然科学基金项目（CSTC2009BB1119）；中央高校基本科研业务费专项
（XDJK2011C001）；西南大学科技创新基因项目（SZ201102）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zqzhoubj@yahoo.com）
致谢：衷心感谢中国农业科学院柑橘研究所种质资源圃江东副教授在样品采集与鉴定中提供的帮助。
基于 matK 和 rbcL DNA 序列条形码鉴定柑橘及
其近缘属植物
于 杰 1，闫化学 1，鲁振华 3，周志钦 1,2,*
（1 南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715；2 西南大学园艺园林学院，重庆 400716；3 中国农业科学院郑
州果树研究所，郑州 450009）
摘 要：对柑橘及其近缘属植物 59 份样品进行叶绿体 matK 和 rbcL 的序列测定，序列比对与人工校
正，计算属间、种间以及种内的遗传距离，比较序列间的差异，构建系统发育树。结果表明，matK、rbcL
及其组合（matK + rbcL）可以对柑橘及其近缘属属间进行鉴定，在种间水平上三者的鉴定率分别为 55.9%、
37.3%和 83.0%。由此可见，与单一片段相比，matK + rbcL 序列组合鉴定率更高，可用于对柑橘及其近缘
属植物进行物种鉴定。
关键词：柑橘属；近缘属；matK；rbcL；DNA 条形码
中图分类号：S 666 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）09-1733-08

Identifying Citrus and Its Related Genera Based on matK and rbcL DNA
Sequence as Barcodes
YU Jie1，YAN Hua-xue1，LU Zhen-hua3，and ZHOU Zhi-qin1,2,*
（1Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions，Ministry of Education，Chongqing 400715，
China；2College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University，Chongqing 400716，China；3Zhengzhou
Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450009，China）
Abstract：The classification of Citrus is still a scientific problem unresolved because of apomixes，
asexual variation，and interspecific hybridization in the genus Citrus. To use matK，rbcL，and them
together to identify Citrus and its closely related genera，the chloroplast matK and rbcL sequences of 59
accessions were analyzed， the inter- and intraspecific genetic distances were calculated，and the
phylogenetic trees of all the accessions tested were constructed based on the obtained distance data. The
results indicated that matK and matK + rbcL could be successfully used to identify Citrus and its related
genera. However，at the species level，matK，rbcL and their combination（matK + rbcL）only have correct
identification frequency of 55.9%，37.3%，83.0% respectively. Compared with the single fragment，matK +
rbcL was shown to be more powerful，implying that it can be used to identify the species of Citrus and its
related genera.


1734 园 艺 学 报 38 卷
Key words：Citrus；related genera；matK；rbcL；DNA barcode

自 1753 年林奈（Linnaeus）创立柑橘属（Citrus L.）以来，该属种的数目一直是一个世界难题。
在 Swingle 系统中确定 16 个种（Swingle & Reece，1967），而在 Tanaka 系统中确定了 159 个种，14
个变种（Tanaka，1977）。Scora（1975）认为真正柑橘亚属中只有 3 个真正生物学种，即柚（C. grandis）、
枸橼（C. medica）和宽皮柑橘（C. reticulata），其余皆是杂种或后生变异类型。周志钦（1992）对
柑橘属 24 个分类群进行形态学分支分析，结果表明柑橘属内有 5 个单系类群，即马蜂柑（C. hystrix）、
枸橼类（Citrophorum）、柚类（Cephalocitrus）、宽皮柑橘类（Acrumen）和橘亚类（Microacrumen）。
由此可见柑橘属植物物种的数目仍存在很大的分歧，传统的形态学鉴别方法难于解决此问题。
DNA 条形码（DNA barcode）是由加拿大奎尔夫大学 Paul Hebert（Hebert et al.，2003a；2003b）
教授发明，利用一个或少数几个 DNA 片段对地球上现有物种进行识别和鉴定的一项新技术，已成
为现代生物分类学研究中引人注目的新方向和研究热点。DNA 条形码技术具有准确性高、操作简便、
快速等特点（Stoeckle et al.，2004）。利用线粒体细胞色素 C 氧化酶亚单位Ⅰ（cytochrome coxidase
subunitⅠ，COⅠ）基因作为编码序列，已经在鸟类（Hebert et al.，2004b；Yoo et al.，2006；Kerr et
al.，2007）、昆虫（Hebert et al.，2004a；Barrett & Hebert，2005；Hajibabaei et al.，2006）、鱼类（Ward
et al.，2005；Hubert et al.，2008；Yancy et al.，2008）上广泛应用，取得了良好的鉴定效果。2009
年，生命条形码联盟植物工作组推荐以叶绿体编码成熟酶 K 蛋白（maturase K protein）的 matK 基
因和编码核酮糖 1,5–二磷酸羧化酶（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase）大亚基的 rbcL 基因作为
陆地植物 DNA 条形码的特征序列（Hollingsworth et al.，2009）。
本研究旨在通过 DNA 条形码技术，以 matK、rbcL 基因及其组合（matK + rbcL）为 DNA 条形
码的编码序列，对柑橘及其近缘属植物 59 份试验材料进行分析，探索各序列在柑橘类植物中的适用
性，从而为柑橘及其近缘属植物 DNA 条形码鉴定提供依据，为物种鉴定和分类奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
2008 年 4 月在中国农业科学院重庆柑橘研究所国家果树种质柑橘圃（CRI）采集 53 份柑橘及其
近缘属植物样品鲜叶，2008 年 6 月向美国国家柑橘与枣椰子种质资源圃（CAL）收集 6 份试验样品
干叶。样品详情见表 1。表 1 中植物命名采用 Swingle 系统和 Tanaka 系统，如两系统中没有的品种
采用《中国果树志 · 柑橘卷》的命名方式：在拉丁双命名下加单引号，中国原产的或自育品种，一
般用汉语名称，如沙田柚 C. grandis‘Shatianyou’。
1.2 总 DNA 提取
称取新鲜叶片或干叶 0.5 g，加入少量非溶性聚乙烯吡咯烷酮 PVP，在液氮条件下迅速粉碎。总
DNA 提取参照改良的 CTAB 法，DNA 浓度和质量的检测采用紫外分光光度法和 1%琼脂糖凝胶电泳
法（谢让金和邓烈，2007）。
1.3 叶绿体基因组部分编码序列的扩增、纯化和测序
聚合酶链式反应（PCR）在 PTC-100 PCR 仪上进行。反应体积为 25 μL，DNA 模板 30 ~ 50 ng，
MgCl2 1.5 mmol · L-1，dNTP 各 0.15 mmol · L-1，引物各 0.12 μmol · L-1，EX Taq 聚合酶 1.0 U。各序
列扩增引物及反应条件见表 2。
9 期 于 杰等：基于 matK 和 rbcL DNA 序列条形码鉴定柑橘及其近缘属植物 1735

表 1 柑橘及其近缘属植物样品
Table 1 The samples of Citrus and its closely related genera used in this study
注：CRI，中国农业科学院重庆柑橘研究所国家果树种质柑橘圃；CAL，美国国家柑橘与枣椰子种质资源圃。
Note：CRI，Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Citrus Germplasm Repository Chongqing China；
CAL，USDA-ARS National Clonal Germplasm Repository for Citrus and Dates.
编号
No.
材料
Material
采集地
Location
采集凭证
Voucher
1 澳指檬 Microcitrus australasica（F. Muell）Swing. CAL Robert R Krueger Accession No. PI 539717
2 澳圆檬 M. australis（Planch.）Swing. CAL Robert R Krueger Accession No. PI 306117
3 澳沙檬 Eremocitrus glauca（Lindl.）Swing. CRI J. Dong LT0083
4 富民枳 Poncirus polyandra S. Q. Ding CRI J. Dong LT0129
5 飞龙枳 P. trifoliata var. monstrosa（T. ito）Swing. CRI J. Dong LT0083
6 枳 P. trifoliata（L.）Raf. CRI J. Dong LT0021
7 多蕊橘 Clymenia polyandra（Tan.）Swing. CAL Robert R Krueger Accession No. PI 263640
8 罗浮金柑 Fortunella margarita（Lour.）Swing. CRI J. Dong LF0005
9 圆金柑 F. japonica Swing. CRI J. Dong LF0011
10 金豆 F. hindsii Swing. CRI J. Dong LF0024
11 金弹 F. classifolia Swing. CRI J. Dong LF0006
12 长寿金柑 F. obovata Tan. CRI J. Dong LF0030
13 马蜂柑 Citrus hystrix D.C. CRI J. Dong LP0009
14 西里伯大翼橙 C. celebica Koord. CAL Robert R Krueger Accession No. PI 539182
15 卡西大翼橙 C. latipes（Swing.）Tan. CAL Robert R Krueger Accession No. PI 230987
16 美拉尼西亚大翼橙 C. macroptera Montr. CRI J. Dong LP0095
17 小花大翼橙 C. micrantha Wester CAL Robert R Krueger Accession No. PI 539694
18 宜昌橙 C. ichangensis Swing. CRI J. Dong LP0055
19 大种橙 C. ichangensis‘Dazhongcheng’ CRI J. Dong LP0043
20 4 号宜昌橙 C. ichangensis‘No. 4’ CRI J. Dong LP0057
21 香橼 C. medica L. CRI J. Dong LM0029
22 佛手 C.medica var. sarcodactylis（Noot.）Swing. CRI J. Dong LM0019
23 枸橙 C. medica‘GouCheng’ CRI J. Dong LM0012
24 香橙 C. junos Sieb. ex Tan. CRI J. Dong LP0003
25 江北香橙 C. junos‘Jiangbei’ CRI J. Dong LP0002
26 费米耐劳 C. limon‘Femminello’ CRI J. Dong LM0078
27 粗柠檬 C. jambhiri Lush. CRI J. Dong LM0094
28 尤力克 C. limon‘Eureka’ CRI J. Dong LM0084
29 巴柑檬 C. bergamia Risso & Poit. CRI J. Dong LM0069
30 墨西哥梾檬 C. aurantifolia‘Mexican’ CRI J. Dong LM0003
31 兰卜梾檬 C. limonia‘Rangpur’ CRI J. Dong LM0001
32 红黎檬 C. limonia‘Redlemon’ CRI J. Dong LM0002
33 广西土柠檬 C. limon Burm. f. CRI J. Dong LM0032
34 代代 C. aurantium‘Daidai’ CRI J. Dong LA0003
35 构头橙 C. aurantium‘Goutoucheng’ CRI J. Dong LA0008
36 甜橙 C. sinensis（L.）Osb. CRI J. Dong LS0306
37 路比血橙 C. sinensis‘Ruby’ CRI J. Dong LS0037
38 伏令夏橙 C. sinensis‘Valencia’ CRI J. Dong LS0049
39 邓肯 C. paradisi‘Duncan’ CRI J. Dong LG0092
40 马叙 C. paradisi‘Marsh’ CRI J. Dong LG0093
41 沙田柚 C. grandis‘Shatianyou’ CRI J. Dong LG0002
42 三宝柑 C. sulcata Hort. ex Tan. CRI J. Dong LG0133
43 琯溪蜜柚 C. Grandis‘Guanximiyou’ CRI J. Dong LG0038
44 印度野橘 C. indica Tan. CRI J. Dong LR0419
45 立花橘 C. tachibana（Mak.）Tan. CRI J. Dong LR0215
46 莽山野橘 C. mangshanensis S. W. He & G. F. Liu CRI J. Dong LR0405
47 蕉柑 C. reticulata Hayata CRI J. Dong LR0022
48 瓯柑 C. reticulata Hort.ex Tan. CRI J. Dong LR0082
49 温州蜜柑 C. unshiu Marc. CRI J. Dong LR0111
50 道县野橘 C. doxianensis S. W. He CRI J. Dong LR0050
51 红橘 C. taugerina Hort. ex Tan. CRI J. Dong LR0633
52 朱红橘 C. erythrosa Hort. ex Tan. CRI J. Dong LR0032
53 土橘 C. chuana Hort. ex Tan. CRI J. Dong LR0347
54 酸橘 C. sunki Hort. ex Tan. CRI J. Dong LR0039
55 朱橘 C. erythrosa Hort. ex Tan. CRI J. Dong LR0144
56 曼橘 C. tardiferax Hort. ex Tan. CRI J. Dong LR0029
57 本地广橘 C. nobilis Lour. CRI J. Dong LR0326
58 南丰蜜橘 C. kinokuni Hort. ex Tan CRI J. Dong LR0012
59 晚白柚 C. grandis‘Wanbaiyou’ CRI J. Dong LG0026
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表 2 序列扩增引物及来源
Table 2 List of primers used in the present study
PCR 产物经纯化试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）纯化后，送 Invitrogen（上海
英骏生物科技有限责任公司）进行序列测定。为保证测序的准确性，采用正反双向测序。
1.4 序列统计分析方法
利用 ClustalX 进行序列比对，BioEdit 软件对序列辅以人工校正；采用 Mega4.0 计算所得序列的
碱基组成、序列间的碱基变异频率和序列间的转换颠换频率及其比率。利用 SPSS17.0 软件进行
Wilcoxon 检验比较分析不同编码序列之间的差异。通过比较序列种内和种间差异的分布，利用
PAUP4.0 b10 构建系统发育树，评价各序列的鉴定效果。
2 结果与分析
2.1 序列测定结果
测序所得 59 份柑橘及其近缘属植物叶绿体 matK、rbcL 编码基因序列共 118 条，将其在 NCBI
上进行 BLAST 相似性检索，均有较好的匹配程度，确认所测序列为目标序列，检索比对结果表明
测序结果可靠和准确。
2.2 序列分析
2.2.1 matK、rbcL序列及变异
采用 Mega 4.0 软件计算柑橘及其近缘属植物 matK、rbcL 各基因序列的组成，G + C 含量，并
计算各序列中的碱基变异率，信息位点率，转换/颠换比率等，结果见表 3。
表 3 序列碱基组成及变异率
Table 3 Sequence base composition and mutation rate
2.2.2 不同序列变异的Wilcoxon秩和检验
采用 SPSS13.0 统计软件对 matK、rbcL、matK + rbcL 各基因序列种间遗传距离进行 Wilcoxon
符号秩和检验，结果见表 4。
表 4 不同序列变异的 Wilcoxon 秩和检验
Table 4 The Wilcoxon rank test of different sequence variations
名称
Name
方向
Direction
扩增引物
Amplification primer
反应条件
Reaction condition
文献
Reference
390F CGATCTATTCATTCAATATTTC 94 ℃ 5 min Lahaye et al.，2008a
1326R TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT 94 ℃ 30 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 个循环
matK
（cycles）；72 ℃ 10 min
rbcL 1f ATGTCACCACAAACAGAAAC 94 ℃ 5 min Kress & Erickson，2007
724r TCGCATGTACCTGCAGTAGC 94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34 个循
环（cycles）；72 ℃ 10 min
序列名称
Sequence name
序列长度/bp
Sequence length
G + C 含量/%
G + C content
变异位点/%
Variable site
信息位点/%
Informative site
转换/颠换
Transform/Transversion
matK 847 37.0 3.66 2.36 0.768
rbcL 730 45.0 5.07 2.29 0.899
matK + rbcL 1577 40.7 4.25 2.35 0.817
正向秩 W+ 负向秩 W- 秩均值，秩频数，显著性概率 Relative ranks，n，P value 结果 Result
rbcL matK W+ = 40.67，W- = 72.82，n = 46，P ≤ 0 rbcL < matK
rbcL matK + rbcL W+ = 46.00，W- = 67.01，n = 91，P ≤ 0.005 rbcL < matK + rbcL
matK matK + rbcL W+ = 26.00，W- = 40.03，n = 7，P ≤ 0.025 matK < matK + rbcL
9 期 于 杰等：基于 matK 和 rbcL DNA 序列条形码鉴定柑橘及其近缘属植物 1737

根据 P < 0.05 为显著差异的原则，matK 序列变异性显著大于 rbcL 序列变异性；matK + rbcL 序
列组合变异性显著大于 matK、rbcL 序列；故三者的变异性差异为 matK + rbcL > matK > rbcL。
2.2.3 matK、rbcL、matK + rbcL序列在种内、种间的变异
根据 Swingle 和 Reece（1967）报道，真正柑橘果树类可分为澳指檬属、澳沙檬属、枳属、多蕊
橘属、金柑属和柑橘属 6 个属。按照同属分为 1 组的原则将 59 份样品进行分组，1 ~ 2 号定为 G1
组，3 号定为 G2 组，4 ~ 6 定为 G3 组，7 号定为 G4 组，8 ~ 12 号定为 G5 组，对于柑橘属样品 13 ~
59 号按照其基本类型进行分组。大翼橙类 13 ~ 17 号定为 G6，宜昌橙类 18 ~ 20 号定为 G7，枸橼类
21 ~ 23 号定为 G8，香橙类 24 ~ 25 号定为 G9，柠檬类 26 ~ 28 号定为 G10，梾檬类 29 ~ 30 号定为
G11，藜檬类 31 ~ 33 号定为 G12，酸橙类 34 ~ 35 号定为 G13，甜橙类 36 ~ 38 号定为 G14，葡萄柚
39 ~ 40 号定为 G15，柚类 41 ~ 43、59 号定为 G16，橘类 44 ~ 58 号定为 G17。利用 Mega4.0 计算
matK、rbcL、matK + rbcL 各基因序列种内遗传距离（intraspecific genetic distance）及种间遗传距离
（interspecific genetic distance），距离模型采用 Kimura-2-parameter distance﹙K-2P﹚模型计算，其变
异分布情况见图 1。
matK 基因序列种间遗传距离范围为 0 ~ 0.013，平均遗传距离为 0.0045；rbcL 序列为 0 ~ 0.006，
平均遗传距离为 0.0029；matK + rbcL 序列为 0 ~ 0.009，平均遗传距离为 0.0038；matK 基因序列种
间变异最大，是柑橘及其近缘属植物 DNA 条形码的研究中一个比较重要的片段。从分布图中可以
看出，各序列种间变异明显大于种内变异（图 1），符合条形码种间变异大，种内变异小的要求，证
明该 DNA 条形码序列适用于种水平上的物种鉴定。

图 1 柑橘及其近缘属植物 matK、rbcL 序列及组合的种内变异和种间变异分布图
Fig. 1 The distribution of intraspecific and interspecific variations in Citrus and its related genera

2.2.4 属间、种间物种鉴定
属间植物鉴定采用最近距离法，计算样品 DNA 条形码序列与其他样品序列间的遗传距离（K-2P），
如果该样品与某一序列的遗传距离值最小，且为同一物种，则鉴定成功，反之则失败。matK、rbcL、
matK + rbcL 序列均能对澳指檬属、澳沙檬属、枳属、多蕊橘属、金柑属 5 属间的大多数植物进行正
1738 园 艺 学 报 38 卷
确聚类，属间的鉴定率为 98%，澳圆檬与澳沙檬的距离最近，而与澳指檬较远，与传统形态分类不
同。
各序列对柑橘属内植物鉴定率差异很大。故选用枳属植物富民枳（Poncirus polyandra S. Q.
Ding）、飞龙枳[P. trifoliata var. monstrosa（T. ito）Swing.]、枳[P. trifoliata（L.）Raf. ]为外类群（Li
et al.，2010），利用 PAUP4.0 b10 软件构建基因树。最大简约数树（Maximum Parasimony，MP）的
构建采用启发式搜索，树二等分再连接分支交换（TBR），各种核酸替代等同加权，对由于序列多态
性造成的空位在数据统计中作为缺失处理。序列添加采用随机方式，拓扑结构的可靠性用 1 000 次
重复的自展检验（bootstrap analysis）来评估，见图 2。测定 matK、rbcL、matK + rbcL 各序列对柑
橘属植物物种鉴定率。

图 2 柑橘属植物 matK + rbcL 序列组合系统发育树
Fig. 2 The phylogenetic tree of matK + rbcL sequences in Citrus

单一 matK 序列对柑橘属植物大翼橙类、宜昌橙类、柠檬类、甜橙类、枸橼类、柚类等类型样
品可以正确聚类，而对柑橘属植物的其他样品，序列间差异较小，不能很好地区分，故系统进化树
呈梳子状。全部样品鉴定率为 55.9%。单一 rbcL 序列对柑橘属植物，鉴定率更低，全部样品仅为
37.3%。两者的鉴定效果差，系统发育树略。
matK + rbcL 序列组合对柑橘属内的大翼橙（Papeda）13、14、15、16、17；梾檬（C. aurantifolia）
30、31；黎檬（C. limonia）32、33；香橙（C. junos）24、25；甜橙（C. sinensis）36、37、38；柚
（C. grandis）41、43、59；酸橙（C. aurantium）34、35；宽皮柑橘（C. reticulata）48、47、58、
53、54、56、52、55、51、45；宜昌橙（C. ichangensis）18、19、20；香橼（C. medica）21、22、
9 期 于 杰等：基于 matK 和 rbcL DNA 序列条形码鉴定柑橘及其近缘属植物 1739

23 等植物可以正确聚类，全部样品鉴定率为 83.0%。序列组合与单一序列相比，鉴定率有较大幅度
的增加。
3 讨论
matK 序列具有进化速度快，变异大等优点，所以被大多数分类学家认为可以作为 DNA 条形码
候选片段（Chase et al.，2007；Lahaye et al.，2008b）。在本试验中，该序列可以对柑橘及其近缘属
进行属间鉴定，鉴定率为 98%，对于柑橘属内植物，仅能对大翼橙、宜昌橙、甜橙、枸橼、柚、酸
橙等类型进行鉴定，但对于宽皮柑橘（C. reticulata Blanco）中大多数样品不能鉴定。rbcL 序列具有
通用、易扩增、易比对的特点，被提议作为条形码片段。本试验中对柑橘及其近缘属植物的 rbcL
序列进行测定，序列比对后长度为 730 bp，仅为 rbcL 序列全长的一部分，这也为鉴定带来困难。本
试验中 rbcL 序列仅能对澳指檬、澳沙檬、枳、多蕊橘、金柑属等植物进行属间鉴定，而对于柑橘属
内的植物鉴定率低，试验结果与前人关于 rbcL 进化速度较慢，其变异只存在种以上的分类水平，在
物种水平上变异不够大的观点（Newmaster et al.，2006；Kress & Erickson，2007；Lahaye et al.，2008a）
相符合。
matK + rbcL 序列全长为 1 576 bp，变异位点 67 个，能对柑橘及其近缘属植物样品中的 83.0%
进行鉴定，但对于如马叙、粗柠檬、费米耐劳、巴柑檬、温州蜜柑、尤力克、邓肯、三宝柑、印度
野橘这些柑橘属近缘种植物样品不能正确聚类，实现鉴定的目的。属间植物鉴定中澳圆檬与澳沙檬
遗传距离最近，而与澳指檬较远，这与传统分类学相异，这可能是由于澳指檬、澳圆檬、澳沙檬均
为澳洲柑橘类型，三者之间有较近的亲缘关系，存在着基因交流与融合。matK + rbcL 序列得出的鉴
定结果需要其他片段加以验证。
柑橘植物容易产生芽变，种属间植物易杂交且杂种可育，体细胞突变率高，无融合生殖占优势。
这些因素都造成了柑橘及其近缘属植物鉴定和分类的复杂性，可考虑扩大序列组合，增加叶绿体基
因组非编码区基因片段 trnH-psbA 序列和核基因组内转录间隔序列（internal transcribed spacer，ITS）
作为候选序列，提高其物种鉴定率﹙Kress et al.，2005；Chen et al.，2010；Yao et al.，2010﹚。通
过联合这些新的序列数据甚至形态学等方面的性状构建更大的数据集进行分析，然后相互参照所得
结果再作出系统发育推定，实现物种鉴定的目的。matK + rbcL 序列可作为柑橘及其近缘属植物 DNA
条形码研究中重要的特征序列之一。

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