全 文 ：果汁中柑橘属成分实时荧光PCR检测方法
梁宇斌，牟靖芳，李晓明，梁德沛*
（广东产品质量监督检验研究院，国家食品质量监督检验中心（广东），广东顺德 528300）
摘 要：通过分析 20条不同柑橘属植物的 trnL基因序列，设计柑桔属植物特异性扩增引物。通过对苹果、梨、葡萄等多
种水果成分的特异性筛选，建立检测柑桔属植物成分的 SYB Green实时荧光 PCR检测方法，该方法对柑桔 DNA的检
测低限为 0.1 pg/μL。用该方法检测 10种橙汁及其饮料商品，结果表明，该方法能够检测到橙汁中的柑桔属植物成分。该
方法可用于果汁或食品中柑桔属植物成分的鉴别。
关键词：果汁；柑橘属植物成分；trnL基因；实时荧光PCR；SYB Green
Real-time Fluorescence PCR Method for the Detection of Citrus Component in Fruit Juice
LIANG Yu-bin，MU Jing-fang，LI Xiao-ming，LIANG De-pei*
（China National Quality Supervision and Testing Center for Food，Guangdong Testing Institute of Product
Quality Supervision（Guangdong），Shunde 528300，Guangdong，China）
Abstract：A real-time fluorescence polymerase chain reaction method using the fluorescence dye SYBR Green
and aimed at citrus trnL gene sequence was established for detection of citrus DNA in fruit juice. The citrus-
specific primers were designed according to the sequence alignment result between 20 different citrus trnL gene
sequences. The citrus component could be detected by the citrus-specific primers with a limit of detection of
0.1 pg/μL DNA. The following detection of 10 fruit juice and beverage samples showed that this method was
suitable to identify the citrus component in fruit juice beverage and other relative food and can provide a technique
base for research of fruit juice adulteration detection.
Key words：fruit juice； citrus component； trnL gene； Real-time PCR； SYB Green
作者简介：梁宇斌（1984—），男（汉），硕士，研究方向：食品生物技术。
*通信作者
食品研究与开发
Food Research And Development
2014年 8月
第 35卷第 16期
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.022
近年来，随着人民生活水平的不断提高，消费者
对具有较高营养价值的果汁及果汁饮料的消费量也
越来越大[1]。巨大的市场需求导致掺伪行为涉入果汁
行业，严重损害消费者的利益。果汁鉴伪检测技术的
研究具有非常重要的实际意义。目前，人们鉴别掺伪
果汁的方法多基于各种水果特有的标志性化合物[2-5]。
但是，果汁掺假手段越来越高明，从最初的简单勾兑
水发展到现在的根据原果汁的特征图谱进行调配，导
致开展鉴伪工作的难度也越来越高[6]。
分子生物技术以其简便、准确、快速、灵敏度高等
特点，可从基因水平分析食品原料及其产品的特性与
来源，在食品生物成分的鉴别方面展现广阔的应用前
景[7]。近年来，国内外科研工作者开始利用分子生物学
技术开发果汁鉴伪检测技术。Ng与 Chang等[8]利用PCR
技术检测鲜榨橙汁与再生橙汁之间的区别。刘伟红
等 [9]利用 PCR技术根据橙 UDP-葡糖基转移酶蛋白基
因设计特异性扩增引物，研究出一种可用于果汁中的
柑橘属成分的检测及鉴伪方法。韩建勋等[10]利用实时
荧光 PCR技术开发出一种检测果汁中梨成分的方法。
Palmieri L.等 [11]根据 5S rRNA 基因序列和 ANS（antho－
cyanidin synthase）序列设计特异性引物，用实时荧光
PCR方法检测食品中的桔子、菠萝、蓝莓、草莓成分。
但未见利用实时荧光 PCR技术开展对果汁中柑橘属
植物成分进行检测及鉴伪的研究。
本研究通过分析多种柑橘属植物 trnL 基因，设
计柑橘属植物特异性引物，拟建立一种可检测果汁
中柑橘属植物成分的 SYB Green 实时荧光 PCR 检
测方法，以其为果汁分子生物学鉴伪体系的建立奠
定基础。
检测分析
84
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品材料
14种果实样品，包括柑桔、脐橙、蜜桔、贡柑、葡萄
柚、柚子、柠檬、梨、苹果、山楂、香蕉、草莓、葡萄、猕猴
桃，购自超市；橙汁及橙汁饮料 10种，其中 100 %橙汁
4种（A、B、C、D），橙汁饮料 6种（E、F、G、H、I、J），所有
样品均购自超市。
1.1.2 PCR扩增引物
从 NCBI 数据库选取 20 条不同柑橘属植物的
trnL基因序列（详细见表 1），通过 Clustal X软件对序
列进行比对分析，找到同源性序列区间，再利用 Bea－
con Designer 7.9软件设计出一对特异性扩增柑橘属植
物成分的引物：citrus -trnl -F：5′ -GAAAGCGAAAAA
GGGGGATA-3′，citrus-trnl-R：5′-GGGCAGTCAACTC－
CATTTGT-3′，扩增片段长度为 69 bp，Tm值为 79.7℃。
以上引物序列由上海生工有限公司合成。
1.1.3 主要试剂
果汁 DNA 提取液：CTAB 缓冲液 [2 % CTAB，
100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mmol/L NaCl，
pH 8.0]；蛋白酶 K溶液（20 mg/mL）；1×TE缓冲液；其它
试剂或溶剂均为分析纯级或生化纯级。
植物基因组 DNA提取试剂盒购自天根生化科技
（北京）有限公司；实时荧光 PCR反应采用的 2×SYBR
Premix Ex TaqTM购于大连宝生物工程有限公司。
1.1.4 主要仪器与设备
微量移液器：德国 Eppendorf；三孔电热恒温水槽：
上海一恒科学仪器有限公司；小型离心机：德国 Ep－
pendorf；高速冷冻离心机：德国 Sigma；Nanodrop2000
微量紫外分光光度计：美国 Thermo；LightCycler 1.5荧
光定量 PCR扩增仪：瑞士 Roche。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
1.2.1.1 果汁 DNA提取
取 10mL果汁，加入 0.6倍体积的异丙醇，混匀，4℃
下 12 000 r/min离心 10 min，去上清，留沉淀，重复上述
步骤 3次，将沉淀放于新离心管中，加入 5 mL CTAB
缓冲液与 40 μL蛋白酶 K溶液，振荡混匀，将离心管
放于 60℃水浴中温浴 30 min，期间不断摇匀。随后取
1 mL悬浊液到新离心管中，冷却至室温后，13 000 r/min
室温离心 10 min；将上清转移至新离心管中，加入等体
积的氯仿，剧烈震荡后，13 000 r/min离心 15 min，取水
相至新的离心管中；加入等体积异丙醇，混匀，室温放
置 30 min后，13 000 r/min离心 15min，去上清，留沉淀；
加入 600 μL 70 %乙醇进行上下颠倒后，12 000 r/min
离心 5 min，去上清，将离心管倒置，室温放置 10 min～
20 min；加入 100μL1×TE缓冲液溶解沉淀；-20℃保存。
1.2.1.2 果实 DNA提取
将不同的水果用解剖刀切碎后，取部分样品于
-20℃条件下进行冷冻，随后样品放置于冷冻干燥仪
中进行干燥。将干燥后的样品至于预冷的研钵中磨
碎，随后按照天根生化科技有限公司的植物基因组
DNA提取试剂盒的步骤对样品进行 DNA提取。
1.2.2 DNA提取质量的测定
取样品 DNA溶液 2 μL，用 Nano Drop 2000型微
量紫外分光光度计测定样品 DNA在波长为 260 nm和
280 nm处的紫外吸收值，通过 OD260 /OD280比值和浓度
值判断 DNA的纯度和浓度。
同时，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业
标准 SN/T 1204-2003《植物及其加工产品中转基因成
分实时荧光 PCR定性检验方法》[12]，通过检测 DNA样
品中植物内参照基因 tRNA Leu 基因，确定所提取
DNA样品的可扩增性。其中空白对照以无菌超纯水代
替 DNA样品，阴性对照为牛肉 DNA样品，阳性对照为
经本实验室验证 DNA质量的大豆 DNA样品。每个样
品各做 2个平行管。
1.2.3 实时荧光 PCR反应体系
DNA 模板 2 μL（≤100 ng）；2×SYBR Premix Ex
TaqTM试剂 10 μL；引物 citrus-trnl-F和 citrus-trnl-R各
0.4 μL（10 μmol/L）；用无菌水补至总体积为 20 μL。扩
增反应程序为 95 ℃预变性 30 sec；95 ℃变性 10 sec，
55 ℃退火 30 sec，40 个循环，反应于 Roche LightCy－
cler1.5荧光定量 PCR扩增仪上进行，阈值设置采用默
认值，同时保证阈值不小于阴性对照的最高荧光值，
使阴性对照的 Ct值大于 40。随后做溶解曲线分析，分
析 PCR产物的 Tm值。每个样品各做 2个平行管。
1.2.4 引物通用性与特异性验证
以柑桔、脐橙、柚子、柠檬、葡萄柚、贡柑和蜜桔
7种柑橘属植物作为验证样品，无菌超纯水作为空白
对照，验证 citrus-trnl-F/R引物对扩增柑橘属植物的
通用性；以梨、苹果、山楂、香蕉、草莓、葡萄和猕猴桃 7
种常见用于生产果汁的果实作为参照样品，柑桔作为
阳性对照，无菌超纯水作为空白对照，以确定该引物
的特异性。
1.2.5 果汁中柑橘属植物成分实时荧光 PCR灵敏度
试验
以浓度为 100 ng/μL的柑桔 DNA 溶液作为验证
样品，进行 10倍梯度稀释，验证特异性引物对 citrus-
trnl-F/R的检测灵敏度。在实时荧光 PCR反应中加入
该模板 2 μL，使其终浓度分别为 10 ng/μL、1 ng/μL、
100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、0.1 pg/μL、0.01 pg/μL。通
过分析结果确定引物对柑桔 DNA的最低检出限。以无
检测分析 梁宇斌，等：果汁中柑橘属成分实时荧光PCR检测方法
85
表 1 引物设计所参考的不同 trnL基因片段信息
Table 1 Information of different trnL gene fragments used for the primer design
菌超纯水作为空白对照。
1.2.6 商品化柑橘类果汁饮料的检测
按照上述方法对 10种橙汁及橙汁饮料进行 DNA
提取并进行实时荧光 PCR扩增，分析引物的可用性。
以无菌超纯水作为空白对照，以牛肉 DNA为阴性对
照；以柑桔 DNA为阳性对照。
2 结果与分析
2.1 DNA提取质量
对柑桔、脐橙、柚子、柠檬、葡萄柚、贡柑、蜜桔、
梨、苹果、山楂、香蕉、草莓、葡萄和猕猴桃 14种果实提
取的 DNA 样品进行微量紫外分光光度计检测，其
OD260 /OD280均在 1.7～2.0 范围之间。（详细数据未显
示）。同时，根据 SN/T 1204-2003利用植物通用引物
（tRNA Leu基因）及探针对所有 DNA样品进行扩增，
扩增结果见图 1。
扩增结果显示，阳性对照、阴性对照和空白对照
均正常，所有样品均扩增出典型的 S型荧光信号曲线，
结果表明所有样品中均含有适合 PCR扩增的 DNA。
2.2 引物通用性
为确定所设计的引物 citrus-trnl F/R的通用性，用
引物 citrus-trnl F/R对柑桔、脐橙、柚子、柠檬、葡萄柚、
贡柑和蜜桔 7种柑橘属植物进行实时荧光 PCR扩增。
结果见图 2。
从图 2可见，引物 citrus-trnl F/R均可对 7种柑橘
属植物的基因组扩增出荧光信号，扩增曲线的 Ct值分
别为 14.90±0.09、12.93±0.17、13.05±0.02、16.28±0.03、
15.62±0.04、16.76±0.07和 14.60±0.01；溶解曲线分析结
果显示各扩增产物均在温度（79.8±0.4）℃出现特征峰，
且各种扩增产物的解链温度与软件预测的产物解链
温度无显著差异。试验结果表明，所设计的引物
citrus-trnl F/R对柑桔属植物表现出较好的通用性。
序号 物种名称 编号 序号 物种名称 编号 序号 物种名称 编号
1 柚（Citrus maxima） AY115642.1 2 酸橙（Citrus aurantium） AB558253.1 3 粗柠檬（Citrus jambhiri） AY115647.1
4 柠檬（Citrus limon）
voucher RJB GH06-034
EF126659.1 5 葡萄柚（Citrus x paradisi）
voucher RJB GH06-051
EF126668.1 6 宜昌橙
（Citrus ichangensis）
AY115646.1
7 柠檬（Citrus limon） AY115650.1 8 绿檬（Citrus aurantiifolia） AY115640.1 9 箭叶柑（Citrus hystrix） AY115645.1
10 巴勒斯坦甜青柠
（Citrus limettioides）
AY115649.1 11 葡萄柚（Citrus x paradisi） AY115656.1 12 酸橙（Citrus aurantium） AF434803.1
13 莱姆（Citrus latifolia） AY115648.1 14 Citrus x limonia AY115651.1 15 红橘（Citrus reticulata） AY115657.1
16 香橙（Citrus junos） AY115661.1 17 橘柑（Citrus tachibana） AY115658.1 18 香橼（Citrus medica） AF434806.1
19 甜橙（Citrus sinensis） AF434809.1 20 Citrus sp. WSP-2005 DQ225928.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-0.1
荧
光
值
（
F1
）
0 2 40
循环数
4 226 8 10 12 14 16 18 20 2624 3028 3432 3836
biank
negative
positive
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
k
l
m
n
blank.空白；negative.牛肉；positve.大豆；a.柑桔；b.脐橙；c.柚子；d.柠檬；e.葡萄柚；f.贡柑；g.蜜桔；h.梨；i.苹果；
j.山楂；k.香蕉；l.草莓；m.葡萄；n.猕猴桃。
图 1 植物内参照基因 tRNA Leu基因引物对及探针对样品 DNA的 Taqman实时荧光 PCR扩增结果
Fig.1 Amplification results of 14 plants with plant universal primer and probe by Taqman real-time PCR method
检测分析梁宇斌，等：果汁中柑橘属成分实时荧光PCR检测方法
86
2.3 引物特异性
为确定所设计的引物 citrus-trnl F/R的特异性，用
引物 citrus-trnl F/R对梨、苹果、山楂、香蕉、草莓、葡萄
和猕猴桃 7种非柑橘属植物进行实时荧光 PCR扩增。
结果见图 3。
从图 3可知，引物对 citrus-trnl F/R对 7种非柑橘
属植物的实时荧光 PCR结果均为阴性，说明引物对
citrus-trnl F/R的特异性良好。
2.4 检测灵敏度
从图 4可见，随着 DNA浓度的降低，扩增曲线的
Ct值不断增大。DNA浓度为 10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、
10 pg/μL和 1 pg/μL 0.1 pg/μL时，样品的扩增结果为
阳性，扩增曲线的 Ct值分别为 15.77±0.01、19.90±0.03、
24.10±0.05、28.57±0.12 和 31.75±0.73；DNA 浓度为 0.1
pg/μL时，两个平行的结果均为 Ct值>36，扩增曲线呈明
显上升趋势，参考 SN/T1204-2003的结果判断方法认为
该扩增结果为阳性；DNA浓度为 0.01 pg/μL时，样品无
形成典型扩增曲线，其扩增结果为阴性。试验结果表
明，本研究所设计的引物对 citrus-trnl F/R的实时荧光
PCR方法的灵敏度达到 0.1 pg/μL柑橘属植物 DNA。
2.5 市售橙汁样品检测
对市售的橙汁及橙汁饮料按上述条件提取 DNA，
并进行实时荧光 PCR扩增，结果见图 5。
扩增结果显示，空白对照、阴性对照和阳性对照
均正常；4 种 100 %橙汁（A、B、C、D）和 6 种橙汁饮料
（E、F、G、H、I、J）样品的扩增结果均为阳性；溶解曲线
分析显示在（79.8±0.4）℃附近出现特征峰。扩增结果表
明，所建立的实时荧光 PCR方法能有效检测到果汁中
图 2 引物对 citrus-trnl F/R对 7种柑桔属果实的 SYBR Green实时荧光 PCR扩增结果
Fig.2 Amplification results of 7 citrus plants with citrus-trnl F/R primers by SYBR Green real-time PCR method
0.75
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
-0.05
荧
光
值
（
F1
）
0 2 40
循环数
4 226 8 10 12 14 16 18 20 2624 3028 3432 3836
biank
a
b
c
d
e
f
g
A
blank.空白；a.柑桔；b.脐橙；c.柚子；d.柠檬；e.葡萄柚；f.贡柑；g.蜜桔。
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
-0.01
荧
光
值
-d
（
F1
）
/d
T
温度/℃
biank
a
b
c
d
e
f
g
B Tm = 79.8±0.4℃
66.0 67.0 68.0 69.0 70.0 71.0 72.0 73.0 74.0 75.0 76.0 77.0 78.0 79.0 80.0 81.0 82.0 83.0 84.0 85.0 86.0 87.0 88.0
注：A.扩增曲线；B.溶解曲线。
检测分析 梁宇斌，等：果汁中柑橘属成分实时荧光PCR检测方法
87
图 3 引物对 citrus-trnl F/R对 7种非柑桔属果实的 SYBR Green实时荧光 PCR扩增结果
Fig.3 Amplification results of 7 non-citrus plants with citrus-trnl F/R primers by SYBR Green real-time PCR method
blank.空白；a.柑桔；b.梨；c.苹果；d.山楂；e.香蕉；f.草莓；g.葡萄；h.猕猴桃。
0.28
0.26
0.24
0.22
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
-0.02
荧
光
值
（
F1
）
0 2 40
循环数
4 226 8 10 12 14 16 18 20 2624 3028 3432 3836
biank
a
b
c
d
e
f
g
h
A
0.070
0.065
0.060
0.055
0.050
0.045
0.040
0.035
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
-0.005
-0.010
荧
光
值
-d
（
F1
）
/d
T
温度/℃
B
biank
a
b
c
d
e
f
g
h
66.0 68.0 70.0 72.0 74.0 76.0 78.0 80.0 82.0 84.0 86.0 93.088.0 90.0 92.0
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
荧
光
值
（
F1
）
0 2 40
循环数
4 226 8 10 12 14 16 18 20 2624 3028 3432 3836
biank
a
b
c
d
e
f
g
A
-0.02
注：A.扩增曲线；B.溶解曲线。
检测分析梁宇斌，等：果汁中柑橘属成分实时荧光PCR检测方法
88
blank.空白；negative.牛肉；positive.柑桔；A，B，C，D为 100 %橙汁；E，F，G，H，I，J为橙汁饮料。
图 5 果汁中柑桔属成分检测结果
Fig.5 Detection result of citrus component in fruit juice samples
注：A.扩增曲线；B.溶解曲线。
图 4 果汁中柑橘属植物成分实时荧光 PCR方法灵敏度的确定
Fig.4 Sensitivity of real-time PCR method for citrus component in fruit juice
blank.空白；a.10 ng/μL；b.1 ng/μL；c.100 pg/μL；d.10 pg/μL；e.1 pg/μL；f.0.1 pg/μL；g.0.01 pg/μL。
0.055
0.050
0.045
0.040
0.035
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
-0.005
荧
光
值
-d
（
F1
）
/d
T
温度/℃
biank
a
b
c
d
e
f
g
B
68.0 69.0 70.0 71.0 72.0 73.0 74.0 75.0 76.0 77.0 78.0 79.0 80.0 81.0 82.0 83.0 84.0 85.0 86.0 87.0 88.0
注：A.扩增曲线；B.溶解曲线。
0.24
0.22
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
-0.02
荧
光
值
（
F1
）
0 2 40
循环数
4 226 8 10 12 14 16 18 20 2624 3028 3432 3836
biank
negative
positive
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
A
0.040
0.035
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
-0.005
荧
光
值
-d
（
F1
）
/d
T
温度/℃
biank
negative
positive
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
B
67.068.069.070.071.072.073.074.075.076.077.078.079.080.081.082.083.084.085.086.087.088.0
检测分析 梁宇斌，等：果汁中柑橘属成分实时荧光PCR检测方法
89
的柑桔属成分。
3 结论
编码转运 RNA（Transfer RNA）的 trnL 基因位于
植物叶绿体 DNA的大单拷贝区。该基因内有一个长约
390 bp～615 bp的内含子。该序列的进化情况经深入研
究积累了深厚的研究背景[13-14]。同时，该内含子是植物
叶绿体 DNA中唯一的 I型内含子，其保守区与可变区
交替所形成了保守的二级结构[15]。由于该序列拥有较
高保守性，因此其常与相邻的 trnF基因一起用于系统
发育分析以及植物品种鉴定的研究[16-19]。本实验根据
柑桔属植物 trnL基因设计 citrus-trnl F/R特异性引物，
试验结果表明该引物具有良好的柑桔属植物通用性，
对柑桔、脐橙、柚子、柠檬、葡萄柚、贡柑和蜜桔 7种柑
橘属植物均可扩增出扩增曲线；同时，该引物具有良
好的物种特异性，对梨、苹果、山楂、香蕉、草莓、葡萄、
猕猴桃等 7种水果均无交叉反应。
所谓的实时荧光 PCR就是通过对 PCR扩增反应
中每一个循环产物荧光信号的实时检测，实现对起始
模板定性和定量的分析。实时荧光 PCR技术以其高特
异性、灵敏性、可定量、无污染等优点，得到了广泛的关
注，越来越多地被用于食品成分的检测中[20-22]。本实验
所建立的 SYB Green实时荧光 PCR方法的灵敏度达
到 0.1 pg/μL柑橘属植物 DNA，与刘伟红等[9]所建立的
PCR方法的灵敏度 10 pg/μL相比高出两个数量级，表
明该方法的灵敏度较高。
本试验利用 citrus-trnl F/R对 10种市售橙汁和橙
汁饮料样品中的柑橘属植物成分进行检测，所有样品
均能检测出果汁中的柑桔属成分。该方法具有特异性
强、敏度高等优点，可用于果汁和果汁饮料中柑橘属
植物成分鉴别，为果汁鉴伪研究提供技术参考。
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收稿日期：2013-12-05
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