全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（3）：390–396
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–09–14；修回日期：2010–02–12
基金项目：国家自然科学基金项目（30830078；30771482）
﹡ 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xxdeng@mail.hzau.edu.cn）
超表达草生欧文氏菌 crtB 基因促进转基因番茄
类胡萝卜素合成的研究
张建成，周文静，邓秀新*
（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070）
摘 要：利用重组 PCR 技术，将草生欧文细菌八氢番茄红素合成酶基因 crtB 与豌豆质体定位序列
ts-rbcS 融合，插入质粒载体 PMV 中，构建了植物表达载体 pBI-ts-rbcS-crtB，并通过根瘤农杆菌 EHA105
介导转化番茄。PCR 检测、Southern 杂交和 RT-PCR 分析表明，外源基因 crtB 已整合到番茄基因组中，
并在转基因植株中得到表达。转基因番茄果实中的类胡萝卜素总量增加 1.3 ~ 2.5 倍，八氢番茄红素、番
茄红素、–胡萝卜素和 α–胡萝卜素分别增加了 4.3、1.8、2.2 和 2.3 倍。转化株系中内源类胡萝卜素合
成基因的表达也受到广泛的影响。crtB 基因过量表达有效促进了番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。
关键词：番茄；草生欧文氏菌；八氢番茄红素合成酶；载体构建；遗传转化
中图分类号：S 641.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）03-0390-07

Overexpression of crtB Gene from Erwinia herbicola Improved Carotenoids
Synthesis in Transgenic Tomato
ZHANG Jian-cheng，ZHOU Wen-jing，and DENG Xiu-xin*
（National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，Huazhong Agriculture Univercity，Wuhan 430070，China）
Abstract：The fused pea ts-rbcS fragment and crtB gene from Erwinia herbicola was inserted into the
PMV plasmid vector, resulting the plant expression vector pBI-ts-rbcS-crtB，which was transformed into
tomato by Agrobacterium-mediated transformation. The result of PCR，Southern blot and RT-PCR
revealed that foreign crtB gene was integrated and expressed in the transgenic tomato lines. Total
carotenoids contents in the fruits of transgenic lines were 1.3–2.5 times higher than that of the control, the
phytoene, lycopene，β-carotene and α-carotene contents were 4.3，1.8，2.2，and 2.3 times higer respectively.
In addition，the expression of endogenous genes involved in carotenoid synthesis was affected in the
transgenic lines. These results suggested that overexpression of crtB significantly enhanced the carotenoids
biosynthesis and accumulation in transgenic tomato fruits.
Key words：tomato；Erwinia herbicola；phytoene synthease；construction of expression vector；
genetic transformation

类胡萝卜素具有广泛的生物功能（Bartley & Scolnik，1995；Tracewell et al.，2001；Fraser &
Bramley，2004）。通过对参与类胡萝卜素生物合成基因的遗传操作可改良植物品质（Shewmaker et al.,
1999；Ye et al.，2000；Botella-Pavia & Roariguez-Concepidn，2006；Giuliano et al.，2008）。

3 期 张建成等：超表达草生欧文氏菌 crtB 基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究 391

八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase，PSY）催化两个GGPP分子聚合成具40个碳原子的八
氢番茄红素，是植物类胡萝卜素生物合成途径中的一个限速酶，其编码基因已成为植物类胡萝卜素
基因工程的首选目的基因（朱长甫 等，2004）。在转基因番茄中，番茄PSY的cDNA组成型过量表达，
使转化植株类胡萝卜素合成增强，在种皮、子叶和胚轴等部位积累了较多的类胡萝卜素（Fray et al.，
1995）。植物PSY和细菌的八氢番茄红素合成酶（CrtB）均含有一个异戊二烯转移酶结构域，参与GGPP
合成八氢番茄红素的过程。此外，细菌的CrtB和植物PSY的氨基酸序列仅有30%的同源性，可减少
在转基因植物中经常出现的共抑制现象。因此，细菌crtB基因在植物类胡萝卜素基因工程中被广泛
应用。将番茄PSY1基因的有色体转运肽序列ts-PSY-1与噬夏孢欧文细菌（Erwinia uredovora）crtB基
因融合，在番茄果实特异性启动子驱动下导入番茄，转基因番茄植株中的类胡萝卜素含量较野生型
番茄增加2 ~ 4倍（Fraser et al.，2002）。同样，将噬夏孢欧文细菌（Erwinia uredovora）crtB基因导
入油菜种子、马铃薯块茎和亚麻种子中特异性过量表达，转基因株系中的类胡萝卜素含量均显著增
加（Shewmaker et al.，1999；Ducreux et al.，2005；Fujisawa et al.，2008）。
本试验中将豌豆转运肽ts-rbcS与草生欧文氏菌（Erwinia herbicola）八氢番茄红素合成酶基因crtB
融合，构建了crtB基因的植物表达载体，并通过根瘤农杆菌介导转化番茄，以期增加番茄果实中类
胡萝卜素的合成和积累，为进一步改善植物类胡萝卜素含量等相关研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与质粒
本试验于2006—2007年在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室进行。番茄（Lycopersicon
esculentum Mill.）‘中蔬5号’种子购于中国农业科学院蔬菜花卉研究所；质粒PSL525（携带crtB基因）
由台湾长庚大学Shih-Tung Liu教授馈赠；豌豆转运肽ts-rbcS的cDNA由本实验室克隆并保存在
pMD18-T载体质粒中；植物表达载体质粒PMV由pBI121改良（即将GUS片段缺失，引入含有
5′-XbaⅠ-XhoⅠ-SalⅠ-BamHⅠ-SacⅠ-3′多克隆酶切位点的片段）。
1.2 crtB基因植物表达载体的构建
根据豌豆ts-rbcS转运肽序列（X00806），草生欧文细菌crtB基因序列（M90698）和PMV载体质
粒上酶切位点，分别设计引物ts-rbcS-L：5′-CCGCTCGAGATGGCTTCTATGATATCCTC-3′（含XhoⅠ
酶切位点）和ts-rbcS-R：5′-AACAGCCATGCACTTTACTCTTCCAC-3′；crtB-L：5′-GTAAAGTGCATG
GCTGTTGGCTCGAA-3′和crtB-R：5′-CGCGGATCCCTAAATCGGGCGCTGCCAGAG-3′（含BamHⅠ
酶切位点），通过PCR技术构建融合基因ts-rbcS-crtB。重组PCR产物经电泳检测回收，然后用XhoⅠ
和BamHⅠ酶切，回收酶切片段与经同样酶切的PMV质粒载体连接，构建植物表达载体
pBI-ts-rbcS-crtB。PCR、酶切和测序鉴定后，电击法导入根瘤农杆菌EHA105中。
1.3 番茄的转化、PCR和Southern杂交、RT-PCR分析
番茄转化和再生参考叶志彪等（1994）的方法进行。番茄叶组织 DNA 提取采用 CTAB 法（王
关林和方宏筠，2003），以提取的番茄DNA为模板，相应的3对特异性引物（P-L1：5′-GACGAGGCAGCGC
GGCTAT-3′和P-R1：5′-AAGAAGGCGATAGAAGGCGA-3′；P-L2：5′-ATGGCTTCTATGATATCCTC-3′和P-R2：
5′-GCACTTTACTCTTCCAC-3′；P-L3：5′-ATGGCTGTTGGCTCGAA-3′和 P-R3：5′-CTAAATCGGGCGC
TGCCAGAG-3′）分别对 NPTⅡ基因、ts-rbcS 序列和 crtB 基因进行 PCR 扩增检测，同时设阳性和野
生型番茄作为对照。PCR 条件为 94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1.5
min，30 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。Southern 杂交采用 Roche 公司的“DIG High Prime DNA
392 园 艺 学 报 37 卷

Labelling and Detection Starter Kit Ⅱ”地高辛标记试剂盒的方法进行。此外，提取转基因番茄果实
RNA（Liu et al.，2006），利用 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（MBI 公司）合成 cDNA
第一链， RT-PCR 分析转基因植株中 crtB 基因的表达。其中 crtB 基因的扩增引物为
5′-TACGCGTTTGATCATCTGGA-3′和 5′-CCTTCACCCCAATTTTACGA-3′，内参基因 Ef-1α 的引物为
5′-ATGTTGGGTTCAATGTTAAG-3′和 5′-ATCACACTGCACAGTTCAC-3′。PCR 扩增条件：94 ℃预
变性 5 min，94 ℃变性 45 s，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，28 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。
1.4 crtB转基因番茄果实类胡萝卜素含量及合成基因表达分析
称取番茄冻干果肉粉末 0.3 g，每个样品重复 3 次。类胡萝卜素的提取和 HPLC 分析参考刘庆
（2008）的方法。类胡萝卜素标样八氢番茄红素、番茄红素、α–胡萝卜素、β–胡萝卜素和叶黄素
购自 Sigma 公司。
利用SYBR® GREEN PCR Master Mix（ABI公司）在ABI7500定量PCR仪对转基因番茄果实类胡
萝卜素合成基因的表达进行相对定量分析。选用Ef-1α基因为内参基因，用Primer Express® Software
v2.0（ABI公司）设计引物（表1）。反应体系10 µL：5 µL 2 × Buffer，0.4 µL 10 µm 特异PCR引物，
cDNA模板2 µL，加水至10 µL，反应程序为50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，以及40个循环的 95 ℃ 15 s，
60 ℃ 1 min，4次重复。基因表达的相对定量运用ABI Prism® 7500 SDS软件按照△△CT法进行分析。
表1 定量PCR分析转基因番茄果实内源类胡萝卜素合成基因表达引物
Table 1 List of primers used in quantitative RT-PCR analysis of the expression of endogenous carotenoid
biosynthetic genes in transgenic tomato fruits
2 结果与分析
2.1 pBI-ts-rbcS-crtB 植物表达载体的构建
利用 PCR 重组技术，将豌豆转运肽 ts-rbcS 和草生欧文细菌八氢番茄红素合成酶基因 crtB 融合，
然后，将融合基因 ts-rbcS-crtB 定向克隆到 PMV（改良 pBI121）质粒载体，构建了植物表达载体
pBI-ts-rbcS-crtB（图 1）。
基因 Genes 引物 Primer names 序列 Sequences 扩增大小/bp Size
PSY1-L ATCTTTGGTCTTGTACCGCAAA PSY1
PSY1-R GGCAGTTTTTGTAGGAGGCACA
149
PDS-L AAGGCGCTGTCTTATCAGGAAA PDS
PDS -R TAAACTACGCTTGCTTCCGACA
106
ZDS-L ACCGTACAA CTACGCTACAATGG ZDS
ZDS-R CATCTGGCGTATAGAGGAGATTG
109
CRTISO-L CCCAGGGCTTAAGTCATCTATTC CRTISO
CRTISO-R GGTCCATAGGTACCACTATCACG
93
LCYb-L GAGTTCTTCTGCTTCGGTATGGA LCYb
LCYb-R AAGAAGCCATGCCAATAACGAG
110
LCYe-L GCAGGGATTTCTTGGTTCAAGT LCYe
LCYe-R TGATCAAGCCTTTTCTCATGTCA
101
BCH-L GCTACATTCACTCTCTCGTTTGG BCH
BCH-R AAGGTCCTTCTCTTGGTCTATGG
130
ZEP-L CCTTGTAGGAGCTTGGAAAATG ZEP
ZEP-R CCCCAGAGTCAGTCTTCTCTGTA
109
EF-1α Ef-1α-L AGATGGTCAGACCCGTGAAC 104
Ef-1α-R TGGAGTACTTGGGGGTGGTA
3 期 张建成等：超表达草生欧文氏菌 crtB 基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究 393

图 1 质粒 pBI-ts-rbcS-crtB 结构
氨基酸序列中划线部分为豌豆 ts-rbcS 序列和草生欧文细菌 crtB 基因的起始密码子。
Fig. 1 Structure of plasmid pBI-ts-rbcS-crtB
The initiation codons for the pea ts-rbcS and the crtB gene from E. herbicola are underlined.
2.2 转 crtB 基因番茄植株的获得及分子鉴定
经过农杆菌EHA105介导获得16株长势良好的卡那霉素抗性株系，与对照相比，这些抗性植株
没有明显的形态学差异，均能正常开花结果（图2）。PCR检测表明，15株转基因株系经3对特异性引
物均可扩增出与阳性对照同样大小的片段，分别为ts-rbcS序列171 bp、crtB基因891 bp和NPTⅡ基因
591 bp，而未转化植株则无特异性扩增带（图3），初步表明ts-rbcS-crtB融合基因已转入番茄基因组
中，PCR阳性植株占抗性植株的比例为94%。
图2 转基因番茄植株的再生及开花结果
Fig. 2 Regeneration，flowering and fruit setting of transgenic plants
图 3 番茄转 crtB 基因再生植株的 PCR 鉴定
M 为 DNA marker；P 为 pBI-ts-rbcS-crtB 阳性对照；C 为未转基因番茄；1 ~ 14、16 为转基因番茄。
Fig. 3 PCR identification of tomato transformed with crtB gene
M：DNA marker；P：pBI-ts-rbcS-crtB plasmid as positive control；C：Non-transgenic tomatoes；1–14，16：Transgenic tomatoes.
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图 5 转基因番茄再生植株 RT-PCR 检测
C 为未转基因番茄；4、6、7、10、13、14、16 为转基因番茄。
Fig. 5 RT-PCR analysis of the expression of crtB and Ef-1α in
fruits of transgenic tomato plants
C：Non-transgenic tomatoes；4，6，7，10，13，
14，16：Transgenic tomatoes.
图 4 番茄转 crtB 基因植株 Southern 杂交分析
M 为 λ/Hind Ⅲ分子量标记；C 为未转基因番茄；4 ~ 8、10、
12 ~ 14、16 为转基因番茄。
Fig. 4 Southern blot analysis of tomato transformed with crtB gene
M：λ/Hind Ⅲ marker；C：Non-transgenictomatoes；4–8，10，
12–14，16：Transgenic tomatoes.
对部分PCR阳性植株进行Southern杂交表明，目标基因已经整合到基因组中，且多数为1 ~ 2个
拷贝插入（图4）。RT-PCR进一步分析表明，crtB基因在转基因植株 6、7、10、13、14和16中得到
表达（图5）。




2.3 转 crtB 基因番茄果实类胡萝卜素含量的变化
转基因株系（6，7，10，13，14，16）果实的类胡萝卜素含量分析结果（表 2）表明，转 crtB
基因番茄果实中类胡萝卜素含量显著增加，达到 928.19 ~ 1 739.13 µg · g-1DW，为未转化对照的 1.3 ~
2.6 倍。
与对照相比，转 crtB 基因番茄果实中八氢番茄红素含量增加最为显著，达到 78.40 ~ 284.43
µg · g-1DW，平均增加 4.3 倍。番茄红素、β–胡萝卜素和 α–胡萝卜素含量也有显著增加，分别为
604.65 ~ 1 181.08，238.61 ~ 500.90 和 2.53 ~ 6.05 µg · g-1DW，分别比对照增加 1.8、2.2 和 2.3 倍。
此外，除转基因植株 13 和 14 外，大部分转基因株系中叶黄素含量没有明显差异。
表 2 crtB 转基因番茄果实中类胡萝卜素的含量
Table 2 Carotenoids content of crtB transgenic ripe tomato fruits /（µg · g-1DW）
注：C 为未转基因对照；同列数值不同字母表示差异达 5%显著水平。
Note：NT，non-transgenic tomatoes；Different letters within the same column indicate significant differences at 5% level.
2.4 转 crtB 基因番茄果实类胡萝卜素合成基因表达分析
利用 real-time RT-PCR 分析表明，crtB 基因超量表达对转基因植株（6，7，10，13，14，16）
果实中类胡萝卜素合成内源基因的表达有明显影响（图 6）。转基因番茄果实中，PSY1、PDS、ZDS、
株系
Line
八氢番茄红素
Phy
番茄红素
Lyc
β–胡萝卜素
β–Car
α–胡萝卜素
α–Car
叶黄素
Lut
类胡萝卜素总量
Total
C 30.54 ± 0.75d 494.72 ± 16.38e 166.62 ± 1.64d 1.89 ± 0.12e 2.51 ± 0.68c 694.89e
6 78.40 ± 3.00c 604.65 ± 14.93d 238.61 ± 6.60c 2.53 ± 0.26d 4.00 ± 0.24c 928.19d
7 127.93 ± 8.32b 1 001.68 ± 36.47b 368.53 ± 7.83b 3.17 ± 0.06c 1.72 ± 0.11c 1 503.03b
10 132.11 ± 5.24b 1 002.25 ± 48.31b 500.90 ± 8.69a 5.55 ± 0.30a 4.44 ± 0.83c 1 645.25b
13 184.43 ± 24.41a 1 181.08 ± 89.26a 355.16 ± 21.35b 6.06 ± 0.50a 12.41 ± 2.31a 1 739.13a
14 107.77 ± 5.45b 783.83 ± 25.62c 235.90 ± 7.87c 4.13 ± 0.16b 9.05 ± 1.56b 1 140.68c
16 115.14 ± 4.31b 720.57 ± 17.83c 244.66 ± 4.25c 3.03 ± 0.18cd 2.91 ± 0.98c 1 086.31c
3 期 张建成等：超表达草生欧文氏菌 crtB 基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究 395

CRTISO、LCYb 基因被诱导表达，呈现明显的上升趋势，而 LCYe、BCH 和 ZEP 基因的表达在大部
分转基因株系中未发生明显变化。

图 6 转基因番茄果实内源类胡萝卜素生物合成基因的表达
表达水平由 Ef-1α 基因均一化，未转化番茄的表达量设为 1。数据为平均值 ± 标准误（n = 3）。
Fig. 6 Quantitative RT-PCR analysis of the expression of endogenous carotenoid
biosynthetic genes in transgenic tomato fruits
The levels of expression were normalized to Ef-1α relative to the non-transformed tomatoes which was set to 1.
Data are presented as means ± SE（n = 3）.
3 讨论
本研究将草生欧文细菌crtB基因和豌豆ts-rbcS序列融合，在CaMV35S启动子驱动下导入番茄，
使crtB基因在番茄中成功定位表达，转基因番茄果实中类胡萝卜素含量较野生型增加了1.3 ~ 2.5倍，
其中八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和α–胡萝卜素分别增加4.3、1.8、2.2和2.3倍。可见，
过量表达crtB基因成功增加了番茄果实中类胡萝卜素的含量，提高了番茄果实的营养价值。同时，
也为进一步改善果树、蔬菜或花卉等其它园艺植物类胡萝卜素的含量和组分奠定了基础。
植物类胡萝卜素生物合成主要受一系列酶和基因调控（Cunningham & Gantt，1998；Bramley，
2002）。类胡萝卜素合成酶催化活性改变或代谢中间物含量变化会影响其它类胡萝卜素合成内源基
因的表达（Fraser et al.，2002；Romer et al.，2002）。本研究表明 crtB 基因在番茄果实中超量表达
克服了 GGPP 生成八氢番茄红素这一代谢途径的“瓶颈”，伴随着转基因番茄果实中八氢番茄红素、
番茄红素、β–胡萝卜素和 α–胡萝卜素含量的增加，转基因番茄果实中类胡萝卜素合成内源基因的
表达也发生了变化，如 PSY1、PDS、ZDS、CRTISO、LCYb 表达呈明显上升趋势。这些结果表明，
crtB 超量表达克服了 PSY 酶的限速效应，同时也诱导了转基因植株中 PSY1、PDS、ZDS、CRTISO、
LCYb 等类胡萝卜素合成基因的表达，从而使转基因番茄果实中生成大量的番茄红素和 β–胡萝卜
素。
前人研究表明，在转基因番茄中，番茄PSY的cDNA组成型过量表达导致转基因植株矮化（Fray
et al.，1995）。这主要是由于PSY基因超量表达导致GGPP大量进入类胡萝卜素合成途径，而使赤霉
素（GA）合成减少的缘故。同样，烟草PSY基因组成型过量表达，也引起转基因烟草植株矮化、叶
形卷曲和色素积累发生变化等多种不良效应（Busch et al.，2002）。本研究中获得的15株组成型过量
表达crtB基因的番茄植株与野生型相比没有明显的形态学差异，均能正常开花结果。在转基因亚麻
中，crtB基因组成型超量表达提高了亚麻种子中类胡萝卜素含量，转基因亚麻植株与野生型相比也
没有明显形态学特征的差异（Fujisawa et al.，2008）。可见，在对PSY基因进行遗传操作时，转基因
植株的生长和发育因物种或基因（植物PSY和细菌crtB）亦会有所差异。但是，从长远观点来看，在
应用基因工程技术调控类胡萝卜素生物合成途径时，为了减少对非靶器官或组织生长的影响，组织
396 园 艺 学 报 37 卷

或器官特异性启动子（种子、块茎或果实特异启动子）的选择是重要的。

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