利用在全国大面积推广的8个大白菜良种亲本材料玉青、河头早A、河头早B、青麻叶C、青麻叶D、石特一号9-3、石特一号11-4、运农一号,以其无菌苗子叶为外植体,将抗菌肽基因导入再生系统中,获得了一系列转基因植株。
挑选籽粒饱满的种子,用70%的酒精消毒30~60 s,01%HgCl2溶液灭菌7~10 min,无菌水清洗4~5遍,播种在1/2MS固体培养基上,在25 ℃和16 h光照/8 h黑暗条件下培养,取3~4 d的无菌苗子叶为外植体。基本培养基为MS,添加不同浓度的BA、NAA和AgNO3。
所用的根癌农杆菌为LBA4404,含有质粒 pMOG411,携带有抗菌肽基因,该质粒含有抗卡那霉素(kanamycin, Km)筛选的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因,基因表达由启动子CaMV35S调控。
将根癌农杆菌单菌落接种于含有30 mg·L-1 Km和10 mg·L-1四环素的液体YEB培养基上,28 ℃条件下振荡(200 r·min-1)过夜培养24 h。第2天取农杆菌培养液于含相同浓度抗生素和200 μmol·L-1乙酰丁香酮的YEB培养基中继续振荡培养约12 h, 用MS液体培养基稀释后,感染经预培养2 d的无菌苗子叶, 取出外植体用无菌滤纸吸干,转入共培养基上,共培养2 d,最后转到选择培养基上培养。
提取转基因植株和对照植株的基因组DNA,取10 μg用EcoRI 和HindIII在37 ℃条件下消化16 h,作为PCR模板。DNA探针用EcoRI和HindIII消化质粒pMOG411得到,用地高辛标记。
PCR引物为5′GGTACCCTATTAACCCACAG 3′和 5′GAGTGCGCAAGACGTGACG 3′。PCR反应体系为25 μL,反应程序为:94 ℃10 min;然后94 ℃1 min;60 ℃1 min;72 ℃1 min;40个循环,最后72 ℃延伸10 min。取样10 μL在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳检测。
将转基因植株和对照植株的基因组DNA酶切片段用纸吸法转移到尼仑膜上,杂交、洗膜及信号检测。
用植物RNA微量提取试剂盒提取转基因植株和非转基因植株的总RNA,取5 μg总RNA在1.5%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳,RNA用EB染色检测后,将分离的RNA转移到尼仑膜上,进行探针标记、预杂交以及杂交。
对5个自交系的转基因植株和对照植株进行PCR扩增,结果显示,转化植株出现了870 bp的PCR扩增带,对照则没有。 Southern杂交显示出阳性结果,进一步证明了抗菌肽基因整合到了大白菜基因组中。通过电泳图谱可知,多数抗菌肽基因在大白菜基因组中以单拷贝形式存在,个别植株呈多拷贝,基因以单拷贝形式存在有利于该基因在后代中得到纯合体,在农业生产中有较大的应用价值。Northern杂交结果证实了抗菌肽基因在大白菜中成功表达。
本研究在培养基成分如激素、抗生素浓度等方面与以前的报道有所不同,使用的材料也不同。与其它的报道相同的是, 大白菜子叶再生时要求筛选培养基中较低浓度的卡那霉素(10 mg·L-1),这说明大白菜子叶对卡那霉素比较敏感。在农杆菌与外植体创伤面接触时,并不是所有的细胞都处于DNA吸收状态,这是引起植物转基因频率差异的原因之一。此外,苗龄、外植体类型、预培养与否、农杆菌状态以及共培养时间、添加乙酰丁香酮等都会影响外植体的分化过程。