全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (4) : 587 - 592
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 09 - 18; 修回日期 : 2009 - 02 - 06
基金项目 : 国家 ‘863’项目 (2006AA100108)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: fenghuiaaa@2631net)
菜用羽衣甘蓝的小孢子胚诱导和植株再生
冯 辉 3 , 郭 姝 , 冯建云 , 王玉书
(沈阳农业大学园艺学院 , 沈阳 110161)
摘 　要 : 以引自日本村田种苗公司的菜用羽衣甘蓝杂交种 ‘绿叶多汁 ’为试材 , 对小孢子胚诱导条
件、胚状体转接时间、生芽培养基和生根培养基进行了优化筛选。在 NLN213 + 011 mg·L - 1 62BA + 011
mg·L - 1 NAA和 NLN213 + 012 mg·L - 1 62BA + 012 mg·L - 1 NAA两种培养基上获得了胚状体 , 其发生率分
别为 1138胚 ·蕾 - 1和 0198胚 ·蕾 - 1 ; 转胚时间以接种培养后 25 d为宜 ; 适宜的胚状体生芽培养基为 MS +
210 mg·L - 1 62BA + 011 mg·L - 1 NAA + 3%蔗糖 + 017%琼脂 , 丛生芽诱导率为 56138% ; 生根培养基以
1 /2MS + 011 mg·L - 1 NAA + 3%蔗糖 + 017%琼脂为宜 , 生根率 100%。
关键词 : 羽衣甘蓝 ; 小孢子 ; 胚状体 ; 再生植株
中图分类号 : S 63519; Q 813　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0420587206
M icrospore2der ived Em bryos and Plan t Regenera tion in Ed ible Ka le ( B rassi2
ca ole racea L . var. acepha la DC. )
FENG Hui3 , GUO Shu, FENG J ian2yun, and WANG Yu2shu
(College of Horticulture, Shenyang A gricultural U niversity, Shenyang 110161, China)
Abstract: Plant regeneration was firstly reported by means of isolated m icrospore culture in edible kale.
A hybrid cultivar named‘Succulent Green Leaf’which was introduced from Japan was used for the experi2
ment. Several combinatory were screened in m icrospore2derived embryos, trans2embryos time, hormone con2
stitution on shooting and rooting in order to obtain the best way on the regenerative system. Embryos were at2
tained in the medium s of NLN213 + 011 mg·L - 1 62BA + 011 mg·L - 1 NAA ( embryo yield per bud was
1138) and NLN213 + 012 mg·L - 1 62BA + 012 mg·L - 1 NAA ( the yield was 0198). The suitable time for
transfer of the embryos was 25 days after inoculation; The best shooting medium wasMS + 210 mg·L - 1 62BA
+ 011 mg·L - 1 NAA + 3% sugar + 017% agarose. W ith the shoot induction rate was 56138% , the suitable
medium for rooting was 1 /2MS + 011 mg·L - 1 NAA + 3% sugar + 017% agarose and the root inducing rate
come up to 100%.
Key words: kale; m icrospore; embryo; p lant regeneration
羽衣甘蓝 (B rassica oleracea L. var. acepha la DC. ) 是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种 , 为两年
生草本植物 , 原产于地中海和北海沿岸。羽衣甘蓝一些品种可作蔬菜 , 另一些品种可作观叶植物。菜
用羽衣甘蓝叶片浅绿至绿色 , 以卷曲的羽状嫩叶为食 , 富含矿物质、维生素 C、β - 胡萝卜素及微量
元素硒 , 是一种营养丰富的蔬菜。
目前 , 我国生产所用的菜用羽衣甘蓝种子主要靠进口 , 选育具有自主知识产权的品种是亟待解决
的问题。
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
菜用羽衣甘蓝为绿体春化型植物 , 两年才能完成一个有性世代 , 育种周期长 , 适宜采用单倍体育
种途径加快育种进程。游离小孢子培养是芸薹属作物近年来开发的创制双单倍体的新技术。L ichter
(1989) 首先报道了通过游离小孢子培养获得了包括羽衣甘蓝在内的几种芸薹属植物的胚状体。姜凤
英等 (2005a; 2005b; 2006)、姜凤英和冯辉 (2006)、冯辉等 (2007a) 对影响观赏羽衣甘蓝小孢子
胚发生及成苗的因素进行了系统研究 , 在此基础上 , 建立了游离小孢子培养体系 (冯辉 等 , 2007b)。
迄今 , 菜用羽衣甘蓝小孢子培养还未见报道。
为了建立菜用羽衣甘蓝小孢子培养体系 , 加快品种改良步伐 , 作者在前期观赏羽衣甘蓝游离小孢
子培养研究的基础上 , 对菜用羽衣甘蓝小孢子胚诱导及植株再生条件进行了系统研究。
1　材料与方法
111　植物材料
试验于 2006—2008年在沈阳农业大学蔬菜遗传育种实验室进行。
供试品种为从日本村田种苗公司引进的菜用羽衣甘蓝杂交种 ‘绿叶多汁 ’, 分温室盆栽和露地栽
植两部分。
温室盆栽于 2006年 7月 15日穴盘播种育苗 , 2007年 1月现蕾后取材培养。露地栽植于 2007年
1月 5日播种于穴盘 , 经移栽 , 3月 25日移入大棚中感应低温 , 4月 25日定植于露地 , 5月中旬现蕾
后取材培养。
112　胚状体诱导
取花蕾长度 310～515 mm , 小孢子发育处于单核靠边期至双核早期的花蕾分离小孢子。小孢子分
离和培养参照姜凤英等 (2005a) 的方法。以 NLN213为基本培养基添加不同配比 62BA和 NAA。
113　小孢子胚继代培养
取出液体培养基中形成的胚状体 , 选择子叶型胚接种到 MS培养基上 , 于 ( 26 ±1) ℃, 12 h·
d - 1光照下培养。转胚 7 d后统计胚成活率和褐化率。
胚成活率 ( % ) =成活胚数 /转胚数 ×100;
胚褐化率 ( % ) =褐化胚数 /转胚数 ×100。
114　生芽培养基植物生长调节剂组合筛选
以 MS培养基为基本培养基 , 蔗糖浓度为 30 g·L - 1 , 琼脂浓度 7 g·L - 1。
设计 62BA浓度水平为 110和 210 mg·L - 1 , NAA的浓度水平为 0105、011、012和 014 mg·L - 1。
将培养基经 121 ℃高压灭菌 20 m in后接入成活变绿的胚状体 , 诱导生芽。14 d后选取有明显主茎的
小芽统计丛生芽率。
丛生芽诱导率 ( % ) =丛生芽发生的胚数 /转胚数 ×100。
115　生根培养基筛选
在 MS和 1 /2MS基本培养基上培养 , NAA的浓度水平分别为 0105、011、012和 014 mg·L - 1 ,
以无植物生长调节剂的 MS培养基为对照。将带有 3～4片真叶的再生芽接种在生根培养基中 , 每瓶 5
个 , 培养 15 d, 重复 3次。
生根率 ( % ) =生根株数 /接种株数 ×100。
116　试管苗移栽
试管苗生根后将瓶口打开炼苗 1～2 d, 取出根系发达 , 生长健壮的试管苗 , 洗净根部培养基 , 移
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　4期 冯 辉等 : 菜用羽衣甘蓝的小孢子胚诱导和植株再生 　
入装有基质的营养钵里 , 适量浇水 , 覆盖塑料膜 , 放在通风透光处。2周后移入温室中 , 1个月后统
计植株成活率。
植株成活率 ( % ) =成活植株数 /接种株数 ×100。
2　结果与分析
211　植物生长调节剂对小孢子胚状体诱导的影响
在 8种 (NLN213为基本培养基 ) 培养基上进行多次重复试验 , 每次接种培养的小孢子均取自 30
个花蕾 , 25 d后统计产胚数 , 计算胚诱导率 (胚 ·蕾 - 1 ) , 结果见表 1。
表 1　NL N213培养基中添加不同配比植物生长调节剂对菜用羽衣甘蓝小孢子胚诱导的影响
Table 1　Effect of plan t growth regula tors con stitution on the induction
of em bryo in ed ible ka le
编号
Code
62BA /
(mg·L - 1 )
NAA /
(mg·L - 1 )
胚诱导率 / (胚·蕾 - 1 )
Frequency of embryos
1 0 0 0
2 0105 0 0
3 0110 0 0
4 0120 0 0
5 0105 0105 0
6 0105 0110 0
7 0110 0110 1138
8 0120 0120 0198
由表 1可以看出 , 在 7号和 8号培养基上有胚状体形成 (图版 , 1) , 诱导率分别为 1138胚 ·
蕾 - 1和 0198胚 ·蕾 - 1。适宜的植物生长调节剂配比为 62BA 011 mg·L - 1 +NAA 011 mg·L - 1。
212　转胚时间对胚状体成活的影响
在液体培养基中形成的子叶形胚 , 转接到固体培养基上才能成苗。转胚接种后 , 一部分胚萌发 ,
3 d后子叶由黄变绿 , 其他胚状体变褐死亡。
由表 2可以看出 , 转胚时间对胚状体成活有很大影响。适宜的转胚时间为小孢子接种后 25 d, 胚
状体成活率达 79%。
表 2　转胚时间对菜用羽衣甘蓝胚状体成活的影响
Table 2　Effect of the tran sfer tim e on surv iva l of em bryos in ed ible ka le
转胚时间 / d
Transfer time
转胚数
Number of
embryos
成活胚数
Number of
survivals
胚褐化数
Number of
the brown
成活率 /%
Rate of
the survivals
褐化率 /%
Rate of
the brown
20 10 6 4 60 bB 40 dD
25 19 15 4 79 aA 21 eE
30 20 10 10 50 cC 50 cC
35 18 6 12 33 dD 67 bB
40 13 0 13 0 eE 100 aA
　　注 : 邓肯氏新复极差测验 , 不同大写字母为差异达极显著 , 不同小写字母为差异达显著水平。
Note: Duncanpis test. The same cap ital or small letter indicated no significance atα = 0101 orα = 0105 level.
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213　植物生长调节剂对胚状体生芽的影响
胚状体再生植株的关键是形成质量好且数量多的不定芽。基本培养基一定时 , 芽的产生取决于植
物生长调节剂配比。
由表 3可以看出 , 不同处理间丛生芽诱导率有很大差异 , 适宜的生芽培养基为 8号培养基 , 其配
方为 MS + 210 mg·L - 1 62BA + 011 mg·L - 1 NAA + 3%蔗糖 + 017%琼脂 , 其丛生芽诱导率达
56138%。
表 3　M S基本培养中植物生长调节剂配比对菜用羽衣甘蓝胚状体丛生芽诱导的影响
Table 3　Effect of plan t growth regula tors con stitution on induction
of m ultiple shoot clum ps in ed ible ka le
培养基代号
Code of medium
62BA /
(mg·L - 1 )
NAA /
( mg·L - 1 )
丛生芽诱导率 /%
Frequency of shoot
1 1100 0 12153 gF
2 1100 0105 37195 cC
3 1100 0110 36138 deD
4 1100 0130 22131 fE
5 1100 0150 0100 hG
6 2100 0 36146 dCD
7 2100 0105 41102 bB
8 2100 0110 56138 aA
9 2100 0130 34156 eD
10 2100 0150 12136 gF
　　注 : 邓肯氏新复极差测验 , 不同大写字母为差异达极显著 , 不同小写字母为差异达显著水平。
Note: Duncanpis test. The same cap ital or small letter indicated no significance atα = 0101 orα = 0105 level.
214　生根培养基的筛选
切取萌芽接种到生根培养基 (图版 , 2)。
由表 4可以看出 , 当生根培养基中不添加 NAA时 , 部分试管苗仍可以生根 , 生根率 75%。添加
表 4　培养基浓度和 NAA含量对菜用羽衣甘蓝小孢子植株生根的影响
Table 4　Effect of m ed ium concen tra tion and con ten t of NAA on root induc ing of
plan tlets from m icrospore in ed ible ka le
基本培养基
Medium
NAA /
(mg·L - 1 )
接种株数
Number of p lants
生根株数
Number of roots
植株成活数
Number of survival p lants
生根率 /%
Rate of rooting
植株成活率 /%
Rate of survival
1 /2 MS 0 20 15 8 75 bB 40 dD
0105 20 15 12 75 bB 60 bB
0110 25 25 25 100 aA 100 aA
0120 20 8 6 40 gF 30 eE
0140 20 3 1 15 hG 　5 gG
MS 0 35 19 8 54 fE 23 fF
0105 20 14 10 70 dC 50 cC
0110 25 18 16 72 cC 64 bB
0120 20 12 5 60 eD 25 fF
0140 20 0 0 　0 iH 　0 hH
　　注 : 邓肯氏新复极差测验 , 不同大写字母为差异达极显著 , 不同小写字母为差异达显著水平。
Note: Duncanpis test. The same cap ital or small letter indicated no significance atα = 0101 orα = 0105 level.
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　4期 冯 辉等 : 菜用羽衣甘蓝的小孢子胚诱导和植株再生 　
NAA后 , 生根率明显升高 , 当 NAA浓度为 011 mg·L - 1时 , 生根效果最好 , 根系长而粗 (图版 , 3) ,
生根率达 100% , 后续的植株成活率 100%。超过这个浓度生根率下降 , 根部产生愈伤组织。
生根培养基以 1 /2MS + 011 mg·L - 1 NAA + 3%蔗糖 + 017%琼脂为宜。同时 , 基本培养基为 1 /2
MS的生根效果要好于 MS。
215　小孢子植株倍性的鉴定
通过观测小孢子植株花粉生活力、长势、花粉母细胞减数分裂中的染色体行为以及小孢子植株自
交结籽情况 , 对其染色体的倍性进行了鉴定。试验获得的菜用羽衣甘蓝小孢子植株自然加倍率达
25% (图版 , 4)。
图版说明 : 1. 菜用羽衣甘蓝小孢子胚状体 ; 2. 菜用羽衣甘蓝小孢子胚萌芽 ; 3. 菜用羽衣甘蓝小孢子植株生根 ; 4. 菜用羽衣甘蓝双
单倍体植株。
Explana tion of pla tes: 1. M icrospore2derived embryos of edible kale; 2. Sp rout of the m icrospore2derived embryos of edible kale; 3. Root for2
mation of the m icrospore2derived p lantlet of edible kale; 4. DH p lant from m icrospore2derived embryos of edible kale.
3　讨论
试验结果表明 , 在 NLN213基本培养中添加一定量的生长素和细胞分裂素 , 可以诱导菜用羽衣甘
蓝品种 ‘绿叶多汁 ’的小孢子形成胚状体。接种后 25 d转胚 , 可以有效防止胚状体褐化 , 植株成活
率高 , 这与冯辉等 (2007b) 报道的观赏型羽衣甘蓝的适宜转胚期有所不同。取胚时间越晚 , 胚褐化
率越高 , 这与姜凤英等 (2005b) 在观赏型羽衣甘蓝上的试验结果是相同的。
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
　　胚状体萌芽需要植物生长调节剂参与 , 在培养基不添加植物生长调节剂的情况下 , 将产生大量的
愈伤组织 , 难以形成丛生芽。
幼苗生根培养后 , 在移栽过程中要注意外界的温度 , 在比较冷凉的季节移栽 , 成活率高 , 植株生
长状态好。
由于菜用羽衣甘蓝的自然加倍率较低 , 要获得大量的双单倍体植株 , 有必要进行加倍处理。适宜
的加倍处理方法有待于进一步研究。
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