全 文 ：园 艺 学 报 2009, 36 (1) : 39 - 44
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 08 - 18; 修回日期 : 2008 - 11 - 10
基金项目 : 河北省自然科学基金项目 (C2005000222) ; 河北农业大学将帅计划项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: shensx@hebau1edu1cn)
附加甘蓝 3号染色体的大白菜单体异附加系的获得
与研究
顾爱侠 1 , 郑宝智 2 , 王彦华 1 , 轩淑欣 1 , 罗双霞 1 , 申书兴 13
(1 河北农业大学园艺学院 , 河北保定 071001; 2 邢台市农业科学院 , 河北邢台 054000)
摘 要 : 以大白菜 —结球甘蓝异源三倍体杂交种 (AAC) 与二倍体大白菜 (AA ) 的回交一代为材料 ,
利用根尖体细胞核型分析法鉴定出大白菜 —结球甘蓝 3号单体异附加系 ; 利用甘蓝连锁群特异 SSR标记鉴
定表明 , 该单体异附加系中的外源染色体与甘蓝的 03连锁群相对应 ; 该单体异附加系植株矮小 , 花枝细弱
倒伏 , 花粉整齐度、花粉生活力和结籽率均较低 , 花粉母细胞减数分裂过程中存在染色体不均衡分离及染
色体落后等现象。
关键词 : 大白菜 ; 结球甘蓝 ; 单体异附加系 ; 核型分析 ; SSR
中图分类号 : S 63411 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2009) 0120039206
O bta in ing and Stud ies of Ch inese Cabbage M onosom ic A lien Add ition L ine
w ith Chrom osom e 3 of Cabbage
GU A i2xia1 , ZHENG Bao2zhi2 , WANG Yan2hua1 , XUAN Shu2xin1 , LUO Shuang2xia1 , and
SHEN Shu2xing13
(1 College of Horticulture, A gricultural U niversity of Hebei, B aoding, Hebei 071001, China; 2 X ingtai A cadem y of A gricu ltura l Sci2
ences, X ingtai, Hebei 054000, China)
Abstract: The BC1 p rogenies derived from allotrip loid hybrid (AAC ) and dip loid Chinese cabbage
(AA) were used materials. The Chinese cabbage - cabbage monosom ic alien addition line introducing chro2
mosome 3 of cabbage was identified by karyotype analysis of root tip. The results from specific SSR markers for
cabbage linkage group s compared with Chinese cabbage showed that the introduced cabbage chromosome in
Chinese cabbage - cabbage monosom ic alien addition line was grouped into linkage group 03. During rep ro2
ductive growth, the monosom ic alien addition line is short, the flowering branch is gracility and lodging, the
pollen regularity, the pollen activity and seed set ratio are low. And there are a series of abnormal phenomena
in meiosis of PMCs, such as chromosome unbalanced separation, backward chromosomes, and so on.
Key words: Chinese cabbage; cabbage; monosom ic alien addition line; karyotype analysis; SSR
已有研究表明芸薹属 A、C染色体组间具有同源性 , 从而为引进不同属种作物的优良性状、扩大
种质遗传背景提供了机会 (潘大仁 , 1999; 黄邦全 等 , 2002)。由于大白菜与结球甘蓝各具优点 , 国
内外育种者一直期望育成兼具大白菜和甘蓝优良性状的新种质。前人进行了大白菜和甘蓝种间杂交 ,
获得了双二倍体物种 “白蓝 ”, 该杂交种经济性状差 , 不能达到育种目标。
与携带整套外源染色体的双二倍体相比 , 单体异附加系携带的不利基因和非目的基因较少 , 便于
筛选具有外源有用性状的优良重组体 , 实现作物的品种改良。Quiros等 (1987)、栗根义等 ( 1996)
分别通过甘蓝型油菜与白菜杂交和回交得到了白菜 —甘蓝型油菜附加系。顾爱侠等 (2006) 已通过
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园 艺 学 报 36卷
胚挽救与回交方法得到了大白菜 —结球甘蓝异源三倍体及其衍生后代 BC1。本研究以 BC1为材料筛选
大白菜 —甘蓝单体异附加系 , 对其进行了细胞学和分子标记 ( SSR) 鉴定 , 并对单体异附加系的植株
性状、花粉特性以及减数分裂进行了研究。异附加系的获得为进一步创造具有外源有用性状 , 遗传稳
定的异代换系和易位系奠定了基础。
1 材料与方法
111 材料
供试材料为大白菜 —结球甘蓝异源三倍体杂交种 (AAC, 2n = 29) 与二倍体大白菜自交系 ‘冠
291’ (AA , 2n = 20) 回交的 BC1植株及其亲本 , 由河北农业大学园艺学院细胞生物学实验室提供。
112 根尖细胞染色体数鉴定及核型分析
2007年 3月将 BC1及其亲本种子表面消毒 , 接种于 MS培养基上建立无性系 , 再将该 BC1组培苗
转接于 1 /2MS培养基上生根培养。根长至 110～115 cm时切取根尖放入 01002 mol·L - 1的 8 - 羟基喹
啉中预处理 2 h, 转至卡诺氏液于 4 ℃固定 24 h, 再换至 70%乙醇中 4 ℃保存备用。根尖于 60 ℃下
1 mol·L - 1盐酸解离 8～10 m in, 采用 P IHCH (丙酸 —铁 —水合三氯乙醛 —苏木精法 ) 染色 , 常规压
片 , O lympusBH22显微镜下观察 , 确认体细胞染色体数为 21条的植株后 , 选择染色体分散良好、形
态和着丝点清晰的细胞照相。参照李懋学和张赞平 ( 1996) 的核型分析方法 , SPOTTM Advanced软
件进行臂长测量 , Photoshop软件进行同源染色体配对排列 , 除随体染色体外按染色体相对长度由大
到小排序。与二倍体大白菜和结球甘蓝的核型参数 (申书兴 等 , 2006; 张成合 等 , 2006) 对比分
析 , 结合镜检时染色体形态观察结果 , 鉴定染色体类别 , 确定附加染色体类型。
113 SSR鉴定
用 CTAB法提取异源三倍体杂交种及其亲本和体细胞染色体为 21条植株的基因组 DNA。利用河
北农业大学园艺学院细胞生物学实验室筛选出的甘蓝连锁群相对于大白菜特异的 25对 SSR引物 (01
连锁群 : Na10H03, N i4B10, Na12C08; 02连锁群 : O l13G05, sORA43, Na12C03, Na12H09; 03连
锁群 : O l11G11, BN12A; 04 连 锁 群 : Na12E05, O l10F12, O l11H08; 05 连 锁 群 : Na10D11,
Ra2A04; 06连锁群 : Ap1a5p r, Na14F11; 07连锁群 : O l10B01, BN72a, Na12F03, O l10H04; 08连
锁群 : O l12D05, O l12G04; 09连锁群 : O l12D09, Ra1F03, O l12A04) , 及来自甘蓝 03连锁群且在亲
本大白菜、结球甘蓝间存在差异的 3对 SSR引物 Na12F12, O l10B04, O l13H09, 分别对异源三倍体
杂交种及其亲本大白菜、结球甘蓝和单体异附加系进行 PCR扩增。每个反应体系为 20μL, 含模板
DNA 50 ng, 115 mmol·L - 1 Mg2 + , 1 ×缓冲液 , 200 μmol·L - 1 dNTP, 1U Taq酶 , 正反向引物各
012μmol·L - 1。94 ℃预变性 2 m in; 94 ℃变性 1 m in, 55～60 ℃复性 30 s, 72 ℃延伸 45 s, 35个循
环 ; 72 ℃延伸 5 m in, 4 ℃保存。扩增产物在 6%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离 , 银染法检测并照
相。
114 单体异附加系植株植物学性状调查
2008年 4月将春化处理的单体异附加系植株定植于河北农业大学试验园基地。盛花期选取 5株
生长良好的单体异附加系植株 , 并采集开花前 1 d的花蕾及套袋内的已开花为研究对象。
田间性状调查内容包括株形、生长势、分枝能力、叶形、叶色及花器官等。
花粉量测定 : 剥出花蕾中的花药并在试管中充分捣碎 , 加入 10 mL 10%的蔗糖溶液 , 充分振荡 ,
使花粉悬浮于溶液中 , 然后用血细胞计数板计数 , 单株重复 3次 , 取平均数。
正常花粉比例测定 : 将采集的花粉直接散到载玻片上 , 在 40 ×物镜下观察并记录畸形花粉数和
正常花粉数 , 每株分别记录 1 000个左右花粉粒 , 统计正常花粉所占比例。
花粉生活力测定 : 采用 TTC (2, 3, 5—氯化三苯基四氮锉 ) 染色法。每株分别记录 1 000个左
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1期 顾爱侠等 : 附加甘蓝 3号染色体的大白菜单体异附加系的获得与研究
右花粉粒 , 着色的为有生活力的花粉粒 , 统计有活力的花粉粒所占比例。
结籽能力测定 : 单体异附加系自交 , 和以单体异附加系为母本与二倍体大白菜 ‘冠 291’进行回
交 , 分别蕾期授粉 , 套袋隔离 , 记录授粉花数 , 待种荚成熟后 , 统计种子数和胎座数 , 求得该试材的
结籽率 [种子数 / (授粉花数 ×平均胎座 ) ×100% ]。
115 单体异附加系的减数分裂
于 9: 00—11: 00用卡诺固定液固定单体异附加系的幼小花序 24 h以上 , 再换至 70%乙醇中
4 ℃冰箱中保存。采用常规压片法 , 苏木精染色 , 显微镜下观察减数分裂各时期染色体行为。
2 结果与分析
211 单体异附加系 AA2C3 21的细胞学鉴定
通过根尖染色体数鉴定 , 筛选出染色体数为 21的 BC1 组培苗无性系 52229。52229由 5个中部着
丝点染色体 (1号、2号、4号、5号、7号 )、5个近中部着丝点染色体 ( 3号、6号、8号、9号、
11号 ) 和 1个近端部着丝点染色体 (10号 ) 组成。其中 10号为随体染色体 , 11号为附加染色体 ,
其形态特征及臂比值 (2123) 都与结球甘蓝 3号染色体 (臂比 2123) 非常相近 , 因此确定 52229为
附加结球甘蓝 3号染色体的大白菜 %结球甘蓝单体异附加系 , 核型 (图版 , A ) 公式为 2n = 2x + 1 =
10m + 8 sm + 2 st ( SAT) + 1 sm (表 1) , 用 AA2C3 21表示。
表 1 无性系 52229根尖细胞核型参数
Table 1 M a jor characters of karyotype of 52229 root tip a t m etapha se
染色体序号
No. of chromosome
染色体相对长度 (L + S) /%
Relative length of chromosome
臂比值 (L /S)
A rm ratio
着丝点类型
Centromere type
1 8167 + 6139 = 15106 1135 m
2 7153 + 5119 = 12172 1145 m
3 7112 + 3190 = 11102 1183 sm
4 5161 + 4155 = 10116 1123 m
5 5181 + 3197 = 9178 1149 m
6 5149 + 2185 = 8134 1193 sm
7 4194 + 3102 = 7196 1164 m
8 4167 + 2160 = 7127 1180 sm
9 4150 + 2155 = 7105 1176 sm
10 8118 + 2150 = 10168 3127 st ( SAT)
11 9185 + 4141 = 14126 2123 sm
注 : SAT为随体染色体 , 其相对长度和臂比为不带随体计入数据。
Note: SAT rep resents the satellite chromosome, and the values of relative length and arm ratio donpit include the length of satellites.
212 单体异附加系 AA2C3 21的 SSR鉴定
利用结球甘蓝相对于大白菜特异的 25对 SSR引物 , 对异源三倍体杂交种及其亲本大白菜、结球
甘蓝和 AA2C3 21进行扩增。结果表明 , 25对 SSR引物中 9对引物在结球甘蓝中有扩增产物而在大白
菜中无扩增产物 , 16对引物在大白菜和结球甘蓝中的扩增片段大小不同 ; AA2C3 21对位于甘蓝 03连
锁群的 2对 SSR引物 O l11G11、BN12A (表 2) 扩增结果与杂交种一致 (图 1) , 对位于其它连锁群的
表 2 来自甘蓝 03连锁群的特异 SSR引物
Table 2 Spec if ic pr im ers from linkage group 03 of cabbage
引物
Primers
5′引物序列
5′p rimer sequence
3′引物序列
3′p rimer sequence
O l11G11 GTTGCGGCGAAACAGAGAAG GAGTAGGCGATCAAACCGAG
BN12A GCCGTTCTAGGGTTTGTGGGA GAGGAAGTGAGAGCGGGAAATCA
Na12F12 CGTTCTCACCTCCGATAAGC TCCGATGTAGAATCAGCAGC
O l10B04 ATCTTCCTCCACGTTCATGC CGAATCTTGAAGTTCTGACCC
O l13H09 AAGGAGAGGAGTGATGGACG CACATTAAACACGGCACAGG
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23对引物扩增结果与大白菜一致 , 说明 AA2C3 21附加的染色体与甘蓝的 03连锁群相对应。同时利用
来自甘蓝 03连锁群 , 且在亲本大白菜与结球甘蓝间扩增出差异片段的其它 3对 SSR引物 Na12F12、
O l10B04、O l13H09 (表 2) 对其进行进一步检测 , AA2C3 21也扩增出与杂交种相同的片段 (图 1) ,
进一步证明了 AA2C3 21的外源染色体与甘蓝 03连锁群相对应。
图 1 甘蓝 03连锁群特异引物在杂交种及其亲本大白菜、结球甘蓝和 AA2C3 21中的扩增结果
1: 母本大白菜 ; 2: 父本结球甘蓝 ; 3: 杂交种 ; 4: AA2C3 21。
F ig. 1 Am plif ica tion results of spec if ic pr im ers of linkage group 03 of cabbage on fema le paren t Ch inese cabbage,
ma le paren t cabbage, a llotr iplo id hybr id, and m onosom ic a lien add ition line
1: Female parent Chinese cabbage; 2: Male parent cabbage; 3: Hybrid; 4: AA2C3 21.
213 单体异附加系 AA2C3 21的植株性状调查
AA2C3 21生殖生长期植株矮小 , 花枝细弱倒伏 (图版 , B ) , 叶片表面似甘蓝有蜡质 , 花蕾长卵
圆形 , 花器官较小 , 每个花蕾的花粉量为 418 ×105 , 花粉整齐度和生活力低 , 分别为 65%和 66% ,
自交结籽率为 3210% , 以 AA2C3 21为母本与二倍体大白菜回交的结籽率为 3618%。
214 单体异附加系 AA2C3 21的减数分裂观察
AA2C3 21花粉母细胞在减数分裂终变期形成 10个二价体和 1个单价体 (图版 , C、D ) , 少数细
胞内观察到 9个二价体和 1个三价体 ; 中期 Ⅰ染色体排列于赤道板 (图版 , E) ; 后期 Ⅰ以 10211分离
(图版 , F、G) 方式为主 , 少数细胞中以 1021210分离 (图版 , H、 I) ; 后期 Ⅱ大部分细胞以 102102
11211分离 (图版 , J) , 部分细胞中出现落后染色体 , 1021210210211分离 (图版 , K)。
3 讨论
311 回交在选育异附加系、异代换系、易位系等方面的作用
本研究结果表明 , 以 2x大白菜为父本对大白菜 —结球甘蓝异源三倍体杂种进行回交 , 可以比较
快速有效地选育异附加系。卢长明和加藤正弘 (1999) 等在油菜种间杂种的配子竞争力与染色体数
变异规律研究中指出 , 各种染色体数的配子都能参与受精并留下后代 , 但不同配子参与受精并留下后
代的能力并不相同 , 以甘蓝型油菜 (AACC) 与白菜 (AA ) 进行杂交获得的 F1杂种为母本 , 白菜
(AA) 为父本回交 , 可提高 n = 10～13配子的受精频率 , 且降低 n = 17～19配子的受精频率。这与本
研究所获得的 BC1植株染色体数主要为 20～24相一致。
312 大白菜 —结球甘蓝单体异附加系应用价值
以单体异附加系为材料可以获得易位系已在小麦等作物上得到了证实 , 徐惠君等 ( 1996) 在小
偃麦异附加系幼胚组织培养后代中选出了小片段易位系。任正隆和张怀琼 (1997) 设计了用单体异附
加材料作为工具诱导小麦 —黑麦染色体小片段易位的系统方法 , 并认为单体异附加材料可作为基因转
移的持久工具 , 异源染色体小片段可以插入受体染色体的不同部位 , 既诱导了较高频率的臂间易位 ,
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1期 顾爱侠等 : 附加甘蓝 3号染色体的大白菜单体异附加系的获得与研究
又有非臂间易位的发生。以单体异附系作为获得易位系的基础材料取得了很好的效果。
本研究中 , 由于在二倍体大白菜染色体组基础上附加了甘蓝染色体 , 不仅影响了减数分裂终变期
同源染色体配对 , 并在中期、后期 Ⅰ、后期 Ⅱ出现染色体提早分离或落后等不规则现象 , 这就为创制
异代换系、易位系提供了条件 , 这与在小麦 —簇毛麦单体异附加系和小麦 —多枝赖草单体异附加材料
减数分裂期观察到的现象 (赵茂林 等 , 2001; 李瑞芬 等 , 2002) 类似。以单体异附加系为材料不
仅可以诱导异源代换和易位 , 促进大白菜育种工作中对外源优良基因的利用 , 拓宽种质的遗传背景 ,
同时还可以开展基因定位、特定染色体文库构建等遗传理论研究。
图版说明 : A: 有丝分裂中期染色体和核型分析图 ; B: 生殖生长 ; C、D: 减数分裂终变期 , 形成 10Ⅱ + 1Ⅰ (箭头所指为单价体 ) ;
E: 中期Ⅰ, 所有染色体排列于赤道板 ; F、G: 后期Ⅰ10211分离 ; H、 I: 后期Ⅰ1021210 (箭头所指为落后染色体 ) ; J: 后期 Ⅱ102102
11211; K: 后期Ⅱ1021210210211 (箭头所指为落后染色体 )。
Explana tion of pla tes: A: M itotic chromosomes and karyotype atmetaphase; B: Rep roductive growth p lant; C, D: D iakinesis 10Ⅱ + 1Ⅰ ( uni2
valents were indicated by arrow) ; E: Chromosomes on equatorial p late at metaphaseⅠ; F, G: Anaphase Ⅰshowing 10211 segregation; H, I: An2
aphase Ⅰshowing 1021210 segregation ( lagging chromosome was indicated by arrow) ; J: Anaphase Ⅱshowing 10210211211 segregation; K: Ana2
phase Ⅱshowing 1021210210211 segregation ( lagging chromosome was indicated by arrow).
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