全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (7) : 953 - 958
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 12 - 26; 修回日期 : 2009 - 04 - 04
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671452; 30571285) , 高校博士点科研基金项目 (20050434009)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hqyang@ sdau1edu1cn; labft@ sdau1edu1cn)
生长素和细胞分裂素对平邑甜茶组培苗 PAs和 NO
含量的影响
张　龙 , 杨洪强 3 , 李　强 , 孙晓莉 , 乔海涛
(山东农业大学园艺科学与工程学院 , 作物生物学国家重点实验室 , 山东泰安 271018)
摘 　要 : 以平邑甜茶继代组培苗为试材 , 研究了 NAA、 IBA、ZT和 62BA作用下组培苗的生长、内源
多胺 ( PA s) 和一氧化氮 (NO) 含量的变化。结果表明 , 在 MS培养基中添加 0102～1100 mg·L - 1的 NAA
或 IBA后 , 外植体鲜样质量增加率和蛋白质含量以及多胺含量和一氧化氮含量均明显增加 , 其中浓度在
0110～0150 mg·L - 1时增加最高 ; 同样浓度下 , NAA处理的外植体鲜样质量增加率和腐胺含量高于 IBA。
在 0108～4100 mg·L - 1范围内 , 随着 ZT或 62BA浓度的升高 , 外植体鲜样质量增加率、可溶性蛋白含量、
多胺含量和一氧化氮含量均逐渐升高 ; 同样浓度下 , 62BA处理的外植体鲜样质量增率和腐胺含量高于 ZT。
生长素和细胞分裂素促进组培苗生长与促进内源 PA s和 NO的生成相伴随 , 组培苗生长动态与内源多胺和
一氧化氮含量的变化趋势一致。
关键词 : 平邑甜茶 ; 一氧化氮 ; 多胺 ; 生长素 ; 细胞分裂素
中图分类号 : S 661; Q 945　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0720953206
Effects of Aux in and Cytok in in on PA s Con ten t and NO Genera tion of M a lus
hupehensis Rehd1 in V itro
ZHANG Long, YANG Hong2qiang3 , L IQ iang, SUN Xiao2li, and Q iao Hai2tao
(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong A gricultural U niversity, S ta te Key Labora tory of C rop B iology,
Taipian, Shandong 271018, China)
Abstract: The effects of NAA, IBA, ZT and 62BA on the growth and the changes on endogenous levels
of PA s and nitric oxide were investigated by using regeneration system ofM alus hupehensis Rehd. in vitro. A s
a result, the increase rate of fresh weight and the contents of p rotein, polyam ines ( PA s) and nitric oxide
(NO) increased significantly in MS medium supp lemented with 0102 - 1100 mg·L - 1 NAA or IBA , and the
increases were the highest at concentrations of 0110 - 0150 mg·L - 1. One more thing, the effects of NAA on
the increase rate of fresh weight and putrescine contentwere higher than that of IBA at the same concentration.
W ith the increase concentration of ZT or 62BA at 0108 - 4100 mg·L - 1 , the increase rate of fresh weight,
p rotein, PA s and NO contents increased gradually. Moreover, the effects of 62BA on increase rate of fresh
weight and putrescine content were higher than those of ZT at the same concentration. Auxin and cytokinin
p romoted the growth accompanied with the elevated p roduction of PA s and NO, and the growth dynam ics
showed the sim ilar trend with the contents of PA s and NO in exp lants in vitro.
Key words: M a lus hupehensis Rehd. ; nitric oxide; polyam ine; auxin; cytokinin
据报道 , 生长素类物质 NAA可提高石竹内源多胺含量的升高 (桂仁意 等 , 2003) , 高水平的内
源 IAA则降低内源多胺的总体水平 ( Santa2Catarina et al. , 2006) ; 细胞分裂素诱导拟南芥一氧化氮的
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
产生 ( Tun et al. , 2001, 2008)。多胺和一氧化氮均为精氨酸的转化产物 (杨洪强和高华君 , 2007) ,
它们和激素对植物生长发育都有重要影响 (W eyers & Paterson, 2001; Kusano et al. , 2008) , 但在植物
生长调节剂作用下 , 内源多胺和一氧化氮的变化与组培苗生长的关系尚未见报道。
平邑甜茶是原产山东平邑县的优良苹果砧木资源 , NO外源供体可增加平邑甜茶新根数量 , 促进
实生苗新根生长 (高华君 等 , 2008b) , 还可促进平邑甜茶外植体增殖、诱导不定芽分化和组培苗生
根 (韩小娇 等 , 2008; Han et al. , 2009)。现以平邑甜茶继代组培苗带叶茎段为材料 , 研究生长素和
细胞分裂素作用下 , 组培苗的生长及生长过程中内源多胺和一氧化氮含量的变化 , 为进一步揭示生长
素和细胞分裂素促进植物生长的机理提供依据。
1　材料与方法
111　试材和处理
试验于 2008年冬季在山东农业大学园艺科学与工程学院组培室进行。以平邑甜茶继代组培苗的
带叶茎段 (012～013 g) 为外植体 , 在 MS基本培养基中加入不同浓度的生长素和细胞分裂素。生长
素选用 NAA和 IBA , 它们在培养基中的浓度分别设为 0 (对照 )、0102、0110、0150和 1100 mg·
L - 1 ; 细胞分裂素选用 ZT和 62BA, 浓度分别设为 0 (对照 )、0108、0140、2100和 4100 mg·L - 1。每
瓶中接种 3～4株外植体 , 每个处理重复 3次 (3瓶 ) , 培养 7 d取样测定。
112　测定方法
　　多胺含量测定 : 采用 Zhao和 Yang (2008) 改进的荧光 —薄层层析法 , 称取鲜样 , 在 5%高氯酸
中冰浴下匀浆 , 冰浴浸提 1 h (其间摇晃 2次 , 每 20 m in 1次 ) , 高速 (26 000 g) 冷冻离心 20 m in,
取上清液 , 用丹磺酰氯丹磺化后薄层层析 (展开剂为氯仿 ∶三乙胺 = 100 ∶20, 体积比 ) , 层析后硅胶
板在紫外分析仪下检出 (激发波长 350 nm) 丹磺酰化多胺 , 用乙酸乙酯溶解丹磺酰化多胺 , 在荧光
分光光度计 ( FL24500) 上定量 , Ex = 337nm, Em = 495 nm。
　　一氧化氮含量测定 : 采用高华君等 (2008a) 改进的鲁米诺 —H2O2化学发光法。新鲜植物材料在
无氧水冰浴中研磨 , 4 ℃下 12 000 g离心 20 m in, 取上清液作为提取液立即用 BPCL 超微弱发光测量
仪测定化学发光。向发光管中加入 160μL发光液 (50 mmol·L - 1碳酸盐缓冲液 , 含 10μmol·L - 1鲁
米诺、20 mmol·L - 1 H2 O2、2 mmol·L - 1 EDTA , 37 ℃时 pH 9172) , 快速注入 40μL提取液 , 记录波
长 635 nm时 6 s累计发光值。以每 g鲜样质量产生的化学发光量表示 NO相对含量 (1 ×106 counts·
g- 1 FW )。测量参数 : 调节高压为 800 V, 标准光源发光强度 7 000 counts·s- 1 , 本底强度 5 counts·
s
- 1
, 采样间隔时间 1 s, 测定温度 30 ℃。
　　蛋白质含量采用 B radford (1976) 的方法测定。培养 7 d时测定并计算外植体鲜样质量增加率。
　　采用 Excel 2003和 SAS 810软件进行数据分析 , 采用新复极差法进行显著性检验。
2　结果与分析
211　生长素和细胞分裂素对组培苗生长量的影响
由图 1, A可见 , 培养 7 d时 , MS培养基中添加 0102～1100 mg·L - 1的 NAA或 IBA的处理 , 外
植体鲜样质量增加率均显著增加 ( P < 0105) , 其中添加 0150 mg·L - 1时增加率最高 , 与对照差异达
到极显著水平 ( P < 0101) ; 同样浓度下 , NAA处理的外植体增重率高于 IBA处理 , 其中添加 0110
mg·L - 1时两处理差异达到极显著水平 ( P < 0101)。添加 ZT和 62BA也提高了外植体鲜样质量增加
率 , 在 0108～4100 mg·L - 1范围内 , 外植体质量增加率随着浓度的提高而增加 , 在添加 4100 mg·
L - 1时升高达到显著水平 ( P < 0105) ; 同样浓度下 , 62BA 质量增加效果高于 ZT处理 (图 1, B )。
如图 2所示 , 在 MS培养基中添加 0102～1100 mg·L - 1的 NAA或 IBA也增加了可溶性蛋白含量 ,
459
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　7期 张 　龙等 : 生长素和细胞分裂素对平邑甜茶组培苗 PA s和 NO含量的影响 　
其中添加 015 mg·L - 1时增加值最高 (图 2, A ) , 差异达到了极显著水平 ( P < 0101)。添加 0108～
4100 mg·L - 1的 ZT或 62BA, 蛋白含量随着 ZT和 62BA浓度的提高而增加 (图 2, B )。
212　生长素和细胞分裂素对组培苗内源多胺含量的影响
由图 3和图 4可知 , 在 MS培养基中添加 0102～1100 mg·L - 1的 NAA或 IBA后 , 组培苗内源腐
胺和亚精胺含量均明显增加 , 其中 0150 mg·L - 1时含量最高 ( P < 0101) ; 在 0102～0150 mg·L - 1范
围内 , 同样浓度 NAA的作用效果高于 IBA处理 ( P < 0101)。
图 3　 NAA、 IBA、ZT和 62BA对组培苗内源腐胺含量的影响
F ig. 3　Effects of NAA, IBA, ZT and 62BA on con ten t of free putresc ine in vitro
559
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
图 4　NAA、 IBA、ZT和 62BA对组培苗内源亚精胺含量的影响
F ig. 4　Effects of NAA, IBA, ZT and 62BA on con ten t of free sperm id ine in vitro
添加 ZT和 62BA也增加了组培苗内源腐胺和亚精胺含量 (图 3和图 4) , 在 0108～4100 mg·L - 1
范围内 , 内源腐胺和亚精胺含量随着浓度的升高而增加 , 在添加 410 mg·L - 1时处理和对照差异都达
到极显著水平 ( P < 0101)。同样浓度下 , 62BA增加内源腐胺效果显著高于 ZT ( P < 0105) ; 但除添
加 0140 mg·L - 1时外 , ZT和 62BA对内源亚精胺含量的影响差异不显著。
添加 0102～1100 mg·L - 1的 NAA或 IBA同样增加了组培苗内源精胺的含量 (图 5, A ) , 其中添
加 0150 mg·L - 1 NAA 处理后组培苗内源精胺含量最高 , 处理和对照差异达到极显著水平 ( P <
0101) ; 但同样浓度下 , NAA和 IBA两者对内源精胺含量的影响差异不显著。添加 ZT和 62BA同样增
加了组培苗内源精胺含量 (图 5, B ) ; 在 0108～4100 mg·L - 1范围内 , 随着 ZT和 62BA浓度的提高 ,
组培苗内源精胺含量逐渐增加 ; 同样浓度下 , ZT和 62BA两者的作用效果没有明显差别。
图 5　NAA、 IBA、ZT和 62BA对组培苗内源精胺含量的影响
F ig. 5　Effects of NAA, IBA, ZT and 62BA on con ten t of free sperm ine in vitro
213　生长素和细胞分裂素对组培苗一氧化氮含量的影响
如图 6, A所示 , 在 MS培养基中添加 0102～110 mg·L - 1的 NAA或 IBA后 , 组培苗一氧化氮含量
均明显增加 ; NAA 0102～ 0150 mg·L - 1和 IBA 0110～1100 mg·L - 1时 , 组培苗一氧化氮含量增加都达到
显著水平 (P < 0105) , 但 NAA浓度超过 0110 mg·L - 1、 IBA超过 0150 mg·L - 1时 , 组培苗一氧化氮含
量的增加程度下降 ; 低浓度时 (0102和 0110 mg·L - 1 ) , NAA处理效果显著高于 IBA ( P < 0105)。
ZT和 62BA也增加了组培苗一氧化氮含量 , 在 0108～4100 mg·L - 1范围内 , 组培苗一氧化氮含量
随着浓度的提高而增加 , 且处理和对照差异达到显著水平 ( P < 0105) ; 低浓度时 ( 0108～ 2100 mg
·L - 1 ) , ZT的处理效果高于 62BA, 但在浓度为 4100 mg·L - 1时 , ZT处理后组培苗一氧化氮含量低
于 62BA处理 (图 6, B ) , 两者差异达到显著水平 ( P < 0105)。
659
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　7期 张 　龙等 : 生长素和细胞分裂素对平邑甜茶组培苗 PA s和 NO含量的影响 　
图 6　NAA、 IBA、ZT和 62BA对组培苗一氧化氮含量的影响
F ig. 6　Effects of NAA, IBA, ZT and 62BA on con ten t of n itr ic ox ide in vitro
3　讨论
适宜浓度的生长素对平邑甜茶继代组培苗的生长呈现促进效应。但在生长素诱导的组培苗生长过
程中 , 组培苗内源多胺含量随着生长素浓度升高而逐渐升高 , 生长素浓度超过 0150 mg·L - 1时 , 多
胺积累量下降 , 与组培苗生长量的变化趋势几乎完全一样。这一方面表明生长素在促进组培苗生长的
同时也促进了多胺积累 , 另一方面也表明较高浓度的生长素不利于多胺积累。 Santa2Catarin等
(2006) 在 O cotea ca tharinensis也发现高水平的内源 IAA抑制内源多胺总水平的提高。事实上 , 高浓
度生长素会诱导乙烯的生成 , 而多胺和乙烯的合成需要共同的合成前体 S - 腺苷蛋氨酸 , 两者产生量
呈显著负相关 (L i & W ang, 2004) , 这应是较高浓度生长素不利于多胺积累的重要原因。
本试验结果显示 , 细胞分裂素同生长素一样 , 也明显促进组培苗的生长和内源多胺的积累。多胺
能够调节 DNA的复制以及转录和翻译等 ( Kusano et al. , 2008) , DNA的复制是细胞开始分裂的前提 ,
生长素和细胞分裂素主要作用是促进细胞分裂 , 而组培苗的生长需要细胞分裂作基础 , 因此 , 生长素
和细胞分裂素对组培苗生长的调节 , 很可能通过多胺对 DNA的复制和基因表达的调节而实现。
一氧化氮作为一种信使分子 , 参与激素对植物生长发育的调节过程 (Beligni & Lamattina, 1999;
Correa2A ragunde et al. , 2006)。本研究结果显示 , NAA、 IBA、ZT和 62BA都明显促进了一氧化氮的
生成 , 这与它们促进组培苗快速生长紧密关联 , 因为在快速生长的器官中 NO含量都很高 (高华君
等 , 2008a)。一氧化氮与多胺不同 , 它是一种活性氮 , 和活性氧类似 , 寿命比较短 , 不能像多胺那样
直接调节 DNA, 而主要作为信使分子传递外界刺激 (Lamattina et al. , 2003) , 因此 , 在本试验中一氧
化氮应当作为 NAA、 IBA、ZT和 62BA的信使分子而调节组培苗的生长。
多胺和一氧化氮都可以利用精氨酸为生物合成前体 , 在两者都以精氨酸为惟一合成前体且精氨酸
供应有限的情况下 , 激素诱导的多胺和一氧化氮合成会相互抑制。但是植物内源一氧化氮除了以精氨
酸为底物 , 通过一氧化氮合成酶途径产生外 ( Guo et al. , 2003) , 还可以硝酸盐为底物 , 通过硝酸还
原酶途径 ( Yamasaki et al. , 1999) 合成。MS培养基中含有硝酸盐 , 除可提供底物外 , 还能够诱导硝
酸还原酶 , 这有利于避免一氧化氮与多胺竞争底物精氨酸。而且生长素和细胞分裂素对胡椒硝酸还原
酶有激活作用 (Ruiz et al. , 2003) ; 最近 Kolbert等 (2008) 在拟南芥根系中发现 , 生长素能够诱导
一氧化氮通过硝酸还原而产生。由此可推测 , 生长素和细胞分裂素也可能通过诱导硝酸还原而促进组
培苗内源 NO生成。此外 , Tun等 (2006) 发现多胺能够诱导拟南芥一氧化氮的生物合成 , 这样生长
素和细胞分裂素诱导组培苗生成的内源多胺 (图 3; 图 4; 图 5) 也可能会促进一氧化氮的生物合成 ,
从而使平邑甜茶组培苗内源多胺和一氧化氮在生长素和细胞分裂素处理下表现出相似的变化趋势。
759
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
References
BeligniM V, Lamattina L. 1999. N itric oxide: A non2traditional regulator of p lant growth. Trends in Plant Science, 6: 508 - 509.
B radford M M. 1976. A rap id and sensitive method for the quantitation of m icrogram quantities of p rotein utilizing the p rincip le of p rotein2dye bind2
ing. Analytical B iochem istry, 72: 248 - 254.
Correa2A ragunde N, Graziano M, Chevalier C, Lamattina L. 2006. N itric oxide modulates the exp ression of cell cycle regulatory genes during
lateral root formation in tomato. Journal of Experimental Botany, 57: 581 - 588.
Gao Hua2jun, Yang Hong2qiang, Du Fang2ling, Zhao Hai2zhou. 2008a. Changes in arginine and nitric oxide levels in M alus hupehensis Rehd.
seedlings during p lant development. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 14 (4) : 774 - 778. ( in Chinese)
高华君 , 杨洪强 , 杜方岭 , 赵海洲. 2008a. 平邑甜茶幼苗生长过程中精氨酸和一氧化氮水平的变化. 植物营养与肥料学报 , 14
(4) : 774 - 778.
Gao Hua2jun, Yang Hong2qiang, ZhangW ei. 2008b. Effects of nitric oxide on lateral root formation induced by IBA in M alus hupehensis Rehd.
seedlings. Acta Horticulturae Sinica, 35 (2) : 157 - 162. ( in Chinese)
高华君 , 杨洪强 , 张　伟. 2008b. 一氧化氮在吲哚丁酸诱导平邑甜茶幼苗侧根形成中的作用. 园艺学报 , 35 (2) : 157 - 162.
Gui Ren2yi, Cao Fu2liang, Shen Hui2juan, Xie Yin2feng. 2003. Effects of p lant growth regulators on flowering and changes of contents of endoge2
nous hormones and polyam ines during flowering of D ianthus chinensis L. Journal of Nanjing Forestry University: Natural Sciences Edition, 27:
6 - 10. ( in Chinese)
桂仁意 , 曹福亮 , 沈惠娟 , 谢寅峰. 2003. 植物生长调节剂对石竹试管成花及内源激素与多胺的影响. 南京林业大学学报 : 自然科
学版 , 27: 6 - 10.
Guo F, Okamoto M, Crawford N M. 2003. Identification of a plant nitric oxide synthase gene involved in hormonal signaling. Science, 302: 100 - 103.
Han X J, Yang H Q, Duan K X, Zhang X R, Zhao H Z, You S Z, J iang Q Q. 2009. Sodium nitrop russide p romotesmultip lication and regenera2
tion of M alus hupehensis in vitro p lantlets. Plant Cell, Tissue and O rgan Culture, 96: 29 - 34.
Han Xiao2jiao, Yang Hong2qiang, You Shu2zhen, Duan Kai2xuan, Zhang Xin2rong, Zhao Hai2zhou. 2008. Adventitious shoot regeneration from
leaves of M alus hupehensis and effects of nitric oxide. Acta Horticulturae Sinica, 35 (3) : 419 - 422. ( in Chinese)
韩小娇 , 杨洪强 , 由淑贞 , 段凯旋 , 张鑫荣 , 赵海洲. 2008. 平邑甜茶叶片不定芽再生及 NO的效应. 园艺学报 , 35 (3) : 419 - 422.
Kolbert Z, Bartha B, Erdei L. 2008. Exogenous auxin2induced NO synthesis is nitrate reductase2associated in A rabidopsis thaliana root p rimordia.
Journal of Plant Physiology, 165: 967 - 975.
Kusano T, Berberich T, Tateda C, Takahashi Y. 2008. Polyam ines: Essential factors for growth and survival. Planta, 228: 367 - 381.
Lamattina L, Garcìa2Mata C, Graziano M, Pagnussat G. 2003. N itric oxide: The versatility of an extensive signal molecule. Annual Review of
Plant B iology, 54: 109 - 136.
L i C Z, W ang G X. 2004. Interactions between reactive oxygen species, ethylene and polyam ines in leaves of Glycyrrhyza infla ta seedlings under
root osmotic stress. Plant Growth Regulation, 42: 552 - 560.
Ruiz J M, Castilla N, Romero L. 2000. N itrogen metabolism in pepper p lants app lied with different bioregulators. Journal ofAgricultural and Food
Chem istry, 48 (7) : 2925 - 2929.
Santa2Catarina C, Silveira V, Tiago S B. 2006. IAA, ABA, polyam ines and free am ino acids associated with zygotic embryo development of O cot2
ea catharinensis. Plant Growth Regulation, 49: 237 - 247.
Tun N N, Holk A, Scherer G F E. 2001. Rap id increase of NO release in p lant cell cultures induced by cytokinin. FEBS Letters, 509: 174 - 176.
Tun N N, L ivaja M, Kieber J J, Scherer G F. 2008. Zeatin2induced nitric oxide (NO) biosynthesis in A rabidopsis thaliana mutants of NO biosyn2
thesis and of two2component signaling genes. New Phytologist, 178: 515 - 531.
Tun N N, Santa2Catarina C, Begum T, Silveira V, Handro W , Floh E I, Scherer G F. 2006. Polyam ines induce rap id biosynthesis of nitric oxide
(NO) in A rabidopsis tha liana seedlings. Plant and Cell Physiology, 47 (3) : 346 - 354.
W eyers J D B, Paterson N W. 2001. Plant hormones and the control of physiological p rocesses. New Phytologist, 152: 375 - 407.
Yamasaki H, Sakihama Y, Takahashi S. 1999. An alternative pathway for nitric oxide p roduction in p lants: New features of an old enzyme.
Trends in Plant Science, 4: 128 - 129.
Yang Hong2qiang, Gao Hua2jun. 2007. Physiological function of arginine and its metabolites in p lants. Journal of Plant Physiology and Molecular
B iology, 33 (1) : 1 - 8. ( in Chinese)
杨洪强 , 高华君. 2007. 植物精氨酸及其代谢产物的生理功能. 植物生理与分子生物学学报 , 33 (1) : 1 - 8.
Zhao H Z, Yang H Q. 2008. Exogenous polyam ines alleviate the lip id peroxidation induced by cadm ium chloride stress in M alus hupehensis Rehd.
Scientia Horticulturae, 116: 442 - 447.
859