全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (6) : 911 - 922
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 01 - 11; 修回日期 : 2009 - 03 - 02
基金项目 : 国家 ‘863’项目 (2007AA100503) ; 国家自然科学基金项目 (30871722) ; 上海市国内科技合作项目 ( 073158202) ;
上海市重点学科建设项目 (B209)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lxzhao@ sjtu1edu1cn)
番茄叶霉菌及番茄抗性基因分子生物学研究进展
芦丽亚 , 杨　宁 , 赵凌侠 3
(上海交通大学农业与生物学院植物生物技术研究中心 , 上海 200240)
摘 　要 : 叶霉菌 (C ladosporium fulvum ) 是番茄 (Solanum lycopersicum ) 叶霉病致病真菌 , 严重地威胁
着番茄生产 ; 二者互作遵循 “基因对基因 ”假说 , 是目前研究植物与病原菌互作模式系统。本文简要地回
顾了番茄叶霉菌和抗性基因 (Cf) 研究历史 ; 概述了叶霉菌侵染特征、效应因子的类型、功能和特性 ; 对
番茄 Cf基因的类型、定位、进化、结构和功能研究进展加以综述 , 特别是对 Cf /A vr互作的分子机制、信号
转导和抗性基因自激活等最新研究成果加以重点阐述 ; 同时 , 对今后番茄抗叶霉病研究所面临问题、研究
热点和解决策略进行了讨论。以期为番茄抗叶霉病或植物抗真菌病研究提供一些有用信息。
关键词 : 番茄 ; 叶霉菌 ; Cf基因 ; A vr基因 ; 自激活蛋白
中图分类号 : S 64112; S 43211; Q 74　文献标识码 : A　文章编号 : 05132353X (2009) 0620911212
Progress on the M olecular B iology of the C ladosporium fu lvum and Its Resis2
tance Genes in Toma to
LU L i2ya, YANG N ing, and ZHAO L ing2xia3
( P lant B iotechnology Research Center, School of A gricu lture and B iology, Shangha i J iao Tong U niversity, Shanghai 200240,
Ch ina)
Abstract: C ladosporium fu lvum ( syn. Passa lora fu lva) is a fungal pathogen that causes tomato (Sola2
num lycopersicum ) leaf mold disease, and threat commercial tomato p roduction seriously. The C. fu lvum 2to2
mato interaction strictly fits the gene2for2gene p rincip le, and has become a model system for studying p lant2
pathogen interaction. In this paper, the research history of C. fu lvum and Cf genes resistant to C. fu lvum
were reviewed. Subsequently, the current p rogresseswere summarized on the infection behaviors of C. fu lvum
as well as the types, characters and functions of effector p roteins derived C. fu lvum. Meanwhile, the research
p rogresses were also reviewed on the types, evolution, structures and functions of Cf genes. Especially, the
recent p rogresses were emphatically reviewed on the molecular mechanism of Cf /A vr interaction, signal trans2
duction depended on Cf /A vr and the autoactivity of Cf genes. Finally, we discussed the faced questions, re2
search hotspots and strategies on the resistance of tomato to C. fu lvum so as to p rovide some available informa2
tion for further investigating tomatopis resistance to C. fu lvum or p lants’resistance to fungus.
Key words: Solanum lycopersicum ; C ladosporium fu lvum ; C. fu lvum resistant genes; avirulence
gene; autoactive p rotein
自从 Cooke (1883) 发现叶霉菌 ( C ladosporium fu lvum , 又名 Passa lora fu lva ) 和 Norton ( 1914)
发现番茄 (Solanum lycopersicum ) 叶霉菌抗性基因 Cf以来 , 二者协同进化和互作研究一直是植物抗
病研究的热点 ( de W it et al. , 2002)。迄今为止 , 至少有 24个 C. fu lvum 生理小种被确认和 10个效
应因子基因被克隆 (A vr2, A vr4, A vr4E, A vr9, Ecp1, Ecp2, Ecp4, Ecp5, Ecp6和 Ecp7) ( van Kan et
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al. , 1991; van den Ackerveken et al. , 1993; Joosten et al. , 1994; Laugéet al. , 1997, 1998a, 2000;
Luderer et al. , 2002; W esterink et al. , 2004; Stergiopoulos et al. , 2007; Bolton et al. , 2008)。24个
Cf基因被定位在番茄 12条染色体上 ( Kanwar et al. , 1980) , 并有 9个 Cf基因 〔Cf22 ( Hcr222B ,
Hcr222C)、Cf25、Cf24 (Hcr924D )、Cf24E、Hcr929B、Cf29 (Hcr929C)、9DC2和 Hcr92M205〕 (Jones et
al. , 1994; D ixon et al. , 1995, 1996, 1998; Thomas et al. , 1997; Laugéet al. , 1998b; Kruijt et al. ,
2005a; Barker et al. , 2006 ) 和 4个 Cf2Ecp基因 ( Cf2Ecp1、Cf2Ecp2、Cf2Ecp3和 Cf2Ecp5 ) 被克隆
(Laugéet al. , 1997; Joosten & de W it, 1999; Laugéet al. , 2000)。
自 1933年有番茄育种记录以来 , Cf基因就不断从近缘野生种被转育到商用番茄 (R ivas & Thom2
as, 2005) ; 抗病品种筛选 , 促进了 C. fu lvum 小种分化 , 甚至分化出广谱或复合毒性的小种 ; C.
fu lvum 新小种反过来又征服番茄抗病品种使之成为感病品种 (R ivas & Thomas, 2005; Stergiopoulos et
al. , 2007)。C. fu lvum 和 Cf基因的功能在协同进化和互作过程中得以保持 , 目前已成为研究植物与
病原菌互作的模式系统 ( de W it, 1992; Joosten & de W it, 1999; Thomma et al. , 2005; Stergiopoulos
et al. , 2007)。基于此 , 作者对叶霉菌和番茄 Cf基因分子生物学研究成果和新进展加以综述 , 以期
为二者互作机理阐明、番茄抗叶霉病育种及其他植物与真菌互作研究提供可借鉴参考。
1　叶霉菌
111　叶霉菌分类地位和侵染特征
叶霉菌 (C. fu lvum ) 是球腔菌科 (Mycosphaerellaceae) 真菌 , 此前作为有性真菌处理 , 依据核
糖体 RNA基因 ITSs ( internal transcribed spacers) 证据最近被归入无性真菌 , 并命名为 Passa lora fu lva
(B raun et al. , 2003)。C. fu lvum (非专性、无性繁殖、活体营养型 ) 以番茄及其茄属 ( Solanum )
近缘野生种为寄主 , 主要从叶片远轴 (背面 ) 气孔侵入 , 借助吸器汲取叶肉细胞营养并在质外体中
快速繁殖 , 在 20～25 ℃和相对湿度 80% ～95%条件下易于侵染和发病 ( Thomma et al. , 2005)。被
侵染叶片一周后出现褪绿或黄色斑点 (栅栏细胞死亡 ) , 随后叶背面出现白色、橄榄绿或褐色霉斑 ;
发病后期 , 气孔被大量增殖 C. fu lvum 分生孢子阻塞而丧失呼吸通道功能 , 导致叶片萎蔫、落花甚至
全株死亡 ( Thomma et al. , 2005)。C. fu lvum 也可以从萼片或花梗气孔侵入 , 潜伏在子房或种皮上 ,
有时以菌丝体或菌丝块形式在病株残体内越冬 , 次年分生孢子借助气流传播病害再次流行 ( Thomma
et al. , 2005)。
112　叶霉菌效应蛋白
C. fu lvum 侵染番茄后 , 将小分子效应蛋白 (3～15 kD ) 分泌到寄主细胞的质外体中 , 在携带相
应 Cf基因番茄中激发防御反应 , 而在无相应 Cf基因番茄中有促进真菌生长功能 ( Stergiopoulos et al. ,
2007)。C. fu lvum 效应蛋白是一类含有信号肽的分泌蛋白 , 包括 A vrs ( avirulence p roteins) 和 Ecps
( extracellular p roteins) (W esterink et al. , 2004; R ivas & Thomas, 2005) , 均含有偶数 (4～8个 ) 半
胱氨酸 , 形成二硫键以保持效应蛋白稳定性 ( van der Hoorn et al. , 2001a; van den Hooven et al. ,
2001)。
迄今为止 , 已有 10个 C. fu lvum 效应蛋白基因 (4个 A vrs和 6个 Ecps) 被克隆 ( Stergiopoulos et
al. , 2007; Bolton et al. , 2008)。Avr2、Avr4、A vr4E和 Avr9分别在携带 Cf22、Cf24、Hcr924E ( Cf2
4E) 和 Cf29番茄中诱导超敏反应 ( hypersensitive reaction, HR ) ( van Kan et al. , 1991; Luderer et
al. , 2002; W esterink et al. , 2004)。A vr基因同源性较低 (Luderer & Joosten, 2001) , A vr缺失或突
变对 C. fu lvum 致病性影响较小 , 说明 A vr毒性较小 ( Stergiopoulos et al. , 2007) ; 不过最近研究显
示 , A vr2是 C. fu lvum 的一个真正致病性因子 (Bolton et al. , 2008)。
A vr9和 Avr4是 Cf29和 Cf24识别配基 ( Joosten et al. , 1994; van den Ackerveken et al. , 1992)。
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　6期 芦丽亚等 : 番茄叶霉菌及番茄抗性基因分子生物学研究进展 　
Avr蛋白在寄主细胞质外体中被加工 , 成熟 A vr9 ( 28个氨基酸 ) 形成稳定三级结构 , 包括 3个二硫
键、3个反向平行β片层和 2个暴露在外亲水环 , 二硫键形成胱氨酸结 , 半胱氨酸突变将导致 A vr9功
能丧失 ( Kooman2Gersmann et al. , 1997; Vervoort et al. , 1997; van den Hooven et al. , 2001)。成熟
A vr4 (86个氨基酸 ) 三级结构尚未被确定 , 含有 8个半胱氨酸 , 可以提供胱氨酸结 ( Joosten et al. ,
1994, 1997)。含有胱氨酸结的动物蛋白参与信号发送 , 含胱氨酸结的真菌 A vr也可能为特定氨基酸
残基靶定于胞外受体提供稳定结构 ( Thomas et al. , 1997)。
A vr有可能由于 DNA改变 (点突变、转座子插入或缺失 ) 而变成致病基因 ; 在相应 Cf番茄中 ,
往往因 A vr缺失或产物改变无法诱导 HR致使 C. fu lvum 表现为致病 (W esterink et al. , 2004)。
研究显示 , C. fu lvum 均携带 Ecps基因 ; Ecps蛋白与 C. fu lvum 在寄主中生长和致病性密切相关 ,
同时在带有相应 C. fu lvum 2Ecp番茄野生种中诱导 HR (Laugéet al. , 1997, 1998a, 2000)。7个 Ecps
( Ecp1～ Ecp7) 基因有 6个被克隆 ( Ecp3除外 ) ( van den Ackerveken et al. , 1993; Laugéet al. ,
2000; Thomma et al. , 2005; Bolton et al. , 2008) ; 成熟 Ecp6 (199氨基酸 ) 是 C. fu lvum 含量最丰
富分泌蛋白 , 包括 3个细胞溶解酶区域 (LysM domains) ; 成熟 Ecp7 (100氨基酸 ) 包含 6个半胱氨
酸 (Bolton et al. , 2008)。
与 A vr不同 , Ecps进化相对保守 , 碱基置换或修饰多发生于非编码区 , 目前尚未有关于真菌 Ecps
基因 DNA被修饰的报道 , 可能与缺乏识别 Ecps的 R蛋白对 C. fu lvum 筛选有关 ( Yinan et al. , 2002;
Stergiopoulos et al. , 2007)。同时 , Ecps基因及其产物保守性还暗示了某些真菌可能源于共同祖先 ,
也支持了 Ecps是真菌主要致病因子的观点 ( Stergiopoulos et al. , 2007)。Ecp s蛋白有双重功能 , 其无
毒功能与 Avr相同 , 作为效应蛋白在番茄中与 C. fu lvum 2Ecps产物互作诱导 HR, 其毒性功能可以增
强病原菌适应性 (Laugéet al. , 2000) ; Ecp2是目前研究最深入、毒性最强的 Ecp s蛋白 (Laugéet
al. , 1997)。
除 A vr和 Ecps外 , N rfs ( nitrogen response regulators) 和 Aox (A lcohol oxidase) 也是 C. fu lvum 的
致病因子 , N rf1通过降低 A vr9表达水平而降低 C. fu lvum 毒性 ( Thomma et al. , 2006) , 饥饿诱导
Aox1可以促进宿主植物迅速生长 ( Segers et al. , 2001)。
2　番茄叶霉菌抗性基因
211　C f基因家族及其定位
21111　Cf基因 　在番茄基因组中主要以基因簇形式存在 , Hcr2s ( homologs of C. fu lvum resis2tance
gene Cf22) 和 Hcr9s ( homologs of C. fu lvum resistance gene Cf29) 是研究比较深入 2个 Cf基因家族。
Hcr2s基因家族包括 3个基因簇 Cf20、Cf22和 Cf25, 均位于番茄 6号染色体短臂上 (D ickinson et
al. , 1993)。Cf20基因簇包括同源基因 Hcr220A和 Hcr220B ( Thomas et al. , 1998) ; Cf22基因簇源自
S. pim pinellifolium , 包括 3个 Hcr2同源基因 , 其中 Hcr222A 无功能 , Hcr222B ( Cf2211) 和 Hcr222C
(Cf2212) 均识别 A vr2 (D ixon et al. , 1995, 1996; Luderer et al. , 2002)。Cf25基因簇源自 S. lycop2
ersicum var. cerasiform e, 包括 4个 Hcr2同源基因 (Hcr225A～Hcr225D ) , Hcr225C便是具有介导叶霉菌
抗性功能的 Cf25基因 (D ixon et al. , 1998)。尽管 Hcr2s家族的 3个基因簇测序工作尚未完成 , Hcr22
0A、Hcr222A与 Hcr225A定向进化结果显示 , Hcr2s基因家族复制和分歧事件发生于物种形成之前
(D ixon et al. , 1998)。
Hcr9s基因家族包括 3个基因簇 Cf20, Cf24和 Cf29, 位于番茄 1号染色体短臂 , 并被定位于 MW
(M ilky W ay) 基因座上 (Jones et al. , 1993; Balint2Kurti et al. , 1994; Parniske et al. , 1999)。Cf20
基因簇源于 S. lycopersicum , 仅包括 1个功能未知 Hcr920A。Cf24基因簇源于 S. habrocha ites, 包括 5
个 Hcr9同源基因 ( Hcr924A ～Hcr924E) , 其中 Hcr924D ( Cf24 ) 和 Hcr924E ( Cf24E) 产物分别识别
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Avr4和 Avr4E, Hcr924A、Hcr924B 和 Hcr924C无功能 ( Thomas et al. , 1997; Takken et al. , 1998;
W esterink et al. , 2004)。Cf29基因簇源于 S. pim pinellifolium , 有 5个 Hcr9同源基因 (Hcr929A～Hcr92
9E) , 其中 Hcr929C (Cf29) 产物识别 Avr9, Hcr929B产物可能识别尚未被确定的 Avr9B (Jones et al. ,
1994; Thomas et al. , 1997; Parniske et al. , 1997, 1999; Parniske & Jones, 1999)。
Parniske和 Jones (1999) 在 S. lycopersicum 基因组 MW基因座末梢和近端还发现了另外 2个 Hcr9
同源基因座 : NL (Northern L ights) 和 SC ( Southern Cross)。NL基因座有 5个基因 : ψNL0A (ψ表示
假基因 )、ψNL0B、NL0C、NL0D和 NL0E , 仅 NL0C与 Hcr9s基因家族类似 , 认为是 MW与 NL异常重
组产物 , 其余 4个基因与 Hcr9s基因家族属于不同亚类。 SC基因座包括 2个基因 , SC0A 和ψSC0B。
NL基因座被物理隔离事件可能发生于 MW 与 SC基因座分开之前 ( Parniske & Jones, 1999; Kruijt et
al. , 2005b)。
Cf21源自栽培番茄 (S. lycopersicum cv. ‘Stirling Castle’) , 也位于 Cf24 /Cf29位点 ( Thomas et al. ,
1998)。最近 , 在 D s (D issociation) 番茄突变体中发现了一个新基因 Hcr92M205, 由 Hcr929A的 5′编
码区和 Cf29的 3′编码区融合而成 (仅有 2个核苷酸差异 ) ; 转基因烟草叶片失绿和 Hcr92M205转录物
积累并不依赖于 A vr9表达 , 暗示该基因产物有可能是一个自激活蛋白 (Barker et al. , 2006)。
21112　9DC基因簇 　9DC基因簇是 Cf29和 Hcr929D在基因内或基因间不均衡重排产物 , 也位于番茄
1号染色体 MW基因座上。对克隆自 S. pim pinellifolium (LA1301) 9DC基因簇 5个全长基因测序发
现 , 位于 9DC两侧的 2个基因与 Cf29基因簇的 Hcr929A和 Hcr929E同源 , 中间的 3个基因 ( Hcr92
9DC1、Hcr929DC2和 Hcr929DC3) 是由 Cf29和 Hcr929D基因重排而成 , 其中 9DC2产物具有识别 A vr9
功能 ( Kruijt et al. , 2004a)。
21113　Cf2Ecps基因 　研究发现 , 某些番茄野生种 HR诱导依赖于 Ecps, 其编码基因 Cf2Ecps与 Hcr9s
其分离 , 也位于染色体 1 短臂上 , 推测可能属于 Hcr9s基因家族 ( Haanstra et al. , 1999, 2000;
Soumpourou et al. , 2007)。目前已克隆 6个 Cf2Ecps基因 (Cf2Ecp1～Cf2Ecp6) , Cf2Ecp1和 Cf2Ecp4位
于 MW基因座靠近 Cf4 /Cf9位点 ( Soumpourou et al. , 2007) ; Cf2Ecp2和 Cf2Ecp3位于 O rion (OR) 基
因座 (Haanstra et al. , 1999; Yinan et al. , 2002) ; Cf2Ecp5位于 Aurora (AU ) 基因座 ( Haanstra et
al. , 2000)。OR基因座的 Cf2Ecp2位点包括 3个基因 , OR2A、OR2B和 OR2C; Cf2Ecp3位点包括 2个
基因 , Cf2Ecp3A和 Cf2Ecpψ3B; OR基因座还包括 1个 Cf20 (S. lycopersicum ) 和 Cf2Ecp5 ( de Kock et
al. , 2005, Kruijt et al. , 2005b)。目前仅在番茄野生种中发现了 Cf2Ecps基因 , 还未在商用番茄中应
用 ; 研究发现 , Cf2Ecp2产物可以在野生番茄中识别 C. fu lvum 的 Ecp2诱导 HR (Laugéet al. , 1998a,
1998b)。
迄今为止 , 已克隆 C. fu lvum 抗性基因包括 6个 Hcr9s基因 (Cf24、Cf24E、Hcr929B、Cf29、9DC
和 Hcr92M205)、3个 Hcr2s基因 (Cf2211、Cf2212和 Cf25) 和 6个 Cf2Ecps基因 (Cf2Ecp1～Cf2Ecp6)。
212　C f基因进化
植物抗性基因 ( resistance gene, R ) 在种间存在高度多态性 (Bergelson et al. , 2001; Caicedo et
al. , 2004a) , 基因重组、转换、突变以及转座子插入是 R基因进化主要动力 , 频繁或瞬时筛选也有
利于 R基因进化 ( Parniske et al. , 1997; Luck et al. , 1998; Noёl et al. , 1999; Chin et al. , 2001;
Sun et al. , 2001; Bakker et al. , 2006)。M ichelmore和 Meyers (1998) 对番茄 P to基因 ( Pseudom onas
syringae pv. tomato) 和生菜 Dm 3 ( downy m ildew resistance gene) 基因加以分析并提出 R基因 “生和
死 ” ( birth and death) 假说 , 认为复制使 R基因 “生 ”, 删除或突变使 R基因 “死 ”。
研究结果显示 , Cf基因源于番茄物种形成前同一祖先 , 重组、置换、复制、移位和点突变也是
Cf基因进化主要动力。Cf基因在相同染色体上 , 首尾衔接以重复同源体形式存在 , 仅少数编码功能
蛋白 , 多数作为基因变异或产生新 Cf基因储备。在番茄种间 , Cf基因同源体核酸差异较大 , 而功能
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Cf基因却高度保守性 (D ixon et al. , 1998; Kruijt et al. , 2005a)。位于 Cf24 /Cf29和 Cf22 /Cf25位点的
基因 , 同源序列首尾相连和 LRR串联重复序列存在 , 减数分裂期容易发生错配、甚至 LRR数目改
变 , 也促进了该位点的 Cf基因进化 ( Kruijt, 2004b)。
Hcr9s和 Hcr2s是染色体置换导致物理隔离而独立进化的 2个 Cf基因家族 (D ickinson et al. ,
1993; Jones et al. , 1993)。Hcr9s基因家族中 , 不同位点基因表现出定向进化 , 序列拼接事件时有发
生 ( Parniske & Jones, 1999; W ulff et al. , 2004a) ; 相同位点 (如 Cf24或 Cf29) 水平进化的同源基因
核酸序列差异主要由序列交换所致 ( Parniske et al. , 1997; Thomas et al. , 1998)。Hcr2s基因家族的
每个基因均含有独立开放读码框 , 最近经历了快速进化过程 , 可能与某种筛选压的存在有关 (D ixon
et al. , 1998)。尽管 Hcr9s和 Hcr2s存在明显差异 , Hcr9s的 3′非翻译区的内含子在 Hcr2s类似位置也
被发现 , 为二者源自同一祖先提供了证据 (D ixon et al. , 1996, 1998; Kruijt et al. , 2005a)。
Hcr基因簇或基因家族的进化研究目前主要集中于同一染色体上 , 染色体间研究还刚刚开始
( Kruijt, 2004b)。Cf2Ecps基因进化比较保守 , 有关 Cf2Ecps进化研究也较少 ( Stergiopoulos et al. ,
2007; Bolton et al. , 2008)。
213　C f基因产物结构与功能
21311　Cf蛋白构成 　胞外富含亮氨酸重复序列 ( extracellular Leu2rich repeats, eLRR s) 蛋白作为信
号识别受体 , 在植物防御和发育过程中扮演着重要角色 , 包括 PGIP (polygalacturonase inhibiting p ro2
tein) , LRX2like ( is required for root hair morphogenesis) , RLP ( recep tor2like p roteins ) 和 RLK ( recep2
tor2like kinases) 4类 ( van der Hoorn et al. , 2005)。
番茄 Cf基因产物属于 RLP类的跨膜糖蛋白 , 通过识别相应叶霉菌诱导子 ( elicitors) 激活 HR,
Cf蛋白 LRR均由 24个氨基酸残基组成 (R ivas & Thomas, 2002)。除 Hcr924B (23个 LRR s) 和 Cf24
( 25个 LRR s) 外 , Hcr9s基因家族产物均包含 27个 LRR s ( Thomas et al. , 1997) ; Cf24 (25个 LRR s,
806氨基酸 ) 与 Cf29 (27个 LRR s, 863氨基酸 ) 同源性为 9115% ( Thomas et al. , 1998)。Hcr2s基
因家族编码 eLRR s蛋白 LRR s数目介于 25 ( Hcr222A ) 和 38 (Cf22) 之间 , Cf22 (38个 LRR s, 1 112
氨基酸 ) 与 Cf25 (32个 LRR s, 968氨基酸 ) 同源性为 90% (D ixon et al. , 1988)。
21312　Cf蛋白结构与功能 　Cf蛋白有 7个功能区 (A～G) : A区是信号肽 , 胞外靶向功能 ; B区富
含半胱氨酸、功能不详 ; C区为胞外 LRR区域 , 包括 1个内部环出结构 ; D区无显著特征 ; E区由酸
性氨基酸构成 ; F区为跨膜区 ; G区较短、呈碱性 , 位于膜内 ( Kruijt et al. , 2005b)。
Cf蛋白具有相同结构域 , 氨基酸序列同源性也较高 , 不过所识别 Avr分子却有较大差别 , 可能
与其 N -端多态性有关。Cf蛋白 N - 端氨基酸和 LRR数量多态性决定其对 Avr特异识别 , 与植物抗
病性有关 ; C - 端高度保守 , 通过与配基识别和结合发送信号而激活植物防御反应 (D ixon et al. ,
1998; W ulff et al. , 2001)。Hcr2s和 Hcr9s所编码蛋白多样性主要存在于 N - 端 B区和前 17个 LRR
内 , C -端 LRR s相对保守 ( van der Hoorn et al. , 2005)。Cf24和 Cf29蛋白 N - 端氨基酸组成决定其
对 A vr4和 A vr9特异识别 ( Thomas et al. , 1997) ; Cf24蛋白 N -端 B区 10个特异氨基酸和 C1区 3个
LRR s (11, 12和 14) 是 A vr4特异识别和介导 HR决定区 , 而 Cf29特异识别区却分布在较广泛 LRR s
区域内 ; Cf24和 Cf29蛋白 C -端特别是最后 915个 LRR s氨基酸序列高度同源 ( van der Hoorn et al. ,
2001a, 2005; W ulff et al. , 2001)。Cf蛋白胞外 LRR s共有序列 (LxxLxLxx) 形成β链 /β转角结构 ,
在蛋白识别和互作中发挥着重要作用 , 平行β片层是亲水表面 , 凹面β片层为蛋白识别提供作用面 ,
氨基酸置换或序列改变都将对配基特异识别和结合产生影响 (Buchanan & Gay, 1996; Kobe & Deis2
enhofer, 1994)。Cf29和 Cf24蛋白特异识别氨基酸残基位于 eLRR蛋白亲水内凹区域 (W ulff et al. ,
2001; van der Hoorn et al. , 2005)。
C -端带有双赖氨酸基序 ( KKXX) 膜蛋白在酵母或哺乳动物中可以被内质网捕获 , Cf29蛋白
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C -端包含 KKRY基序却位于质膜上 , 暗示 KKRY基序对 Cf29和 Cf24定位可能是非必需的 ( van der
Hoorn et al. , 2001b)。有学者认为 , Cf24和 Cf29保守 C -端与亚细胞定位有关 , 不过目前尚无充分的
证据 (R ivas & Thomas, 2002)。内吞作用信号基序 YXXΦ (Φ疏水、X任意氨基酸 ) 可以选择性地
捕获配基 , YXXΦ基序通过调控质膜上的 Hcr2 s和 Hcr9 s浓度来控制二者与配基识别和结合 ( Kruijt
et al. , 2005b)。糖基修饰也会影响到 Cf蛋白活性 , β转角天冬酰胺因糖基化而凸出到疏水核心区 ,
Cf蛋白空间构象和识别特性发生改变 , 妨碍了与配体蛋白结合 (Buchanan & Gay, 1996; van der
Hoorn et al. , 2005)。
Hcr9s基因家族有 6个基因 (Cf24、Cf24E、Hcr929B、Cf29、Hcr929DC2和 Hcr92M205) 产物可以
特异识别 Avr, 其中 Cf24和 Cf24E识别 Avr4和 Avr4E ( Thomas et al. , 1997; W esterink et al. , 2004) ,
Hcr929B、Cf29、Hcr929DC2识别 Avr9 (Jones et al. , 1994) , Hcr92M205产物表现为自激活 (Barker et
al. , 2006)。Hcr2s基因家族 Hcr222B (Cf2211)、Hcr222C (Cf2212) 和 Hcr225C (Cf25) 产物特异识别
Avr, Cf2211和 Cf2212有 3个氨基酸差异 , 识别 Avr2; 推测 Cf25可能识别尚未确定的 Avr5 (D ixon et
al. , 1996, 1998; Luderer et al. , 2002)。
3　番茄 Cf基因抗病分子机制
311　C f /A vr互作
Cf /Avr互作符合 “基因对基因 ” ( gene2for2gene) 假说 ( Flor, 1971; Thomma et al. , 2005) , 机
制尚不清楚。Cf蛋白无明显信号转运区 , 暗示植物防御应答除 Cf蛋白外还有其他蛋白参与 , Cf24和
Cf29识别复合体分别为 400 kD和 420 kD , 小分子分泌蛋白 CLV3 (CLAVATA3) 是棒状识别复合体的
配基 (R ivas & Thomas, 2002; R ivas et al. , 2002a, 2002b)。目前普遍认为 Cf蛋白是 A vr识别复合体
组成部分 (Martin et al. , 2003; Heese et al. , 2005) 或作为 A vr靶标 “警卫 ” ( guards) 间接发挥作
用 ( van der Hoorn et al. , 2002)。
对 Cf基因突变研究发现 , Cf29介导叶霉菌抗性必需有 Rcr21和 Rcr22 (Required for C ladosporium
resistance) 参与 (Hammond2Kosack et al. , 1994)。Cf22介导叶霉菌抗性必需有 Rcr3参与 , 通过识别
Rcr3 /Avr2复合体中 Rcr3激活植物防御应答 ; Rcr3促进半胱氨酸蛋白酶分泌和参与 Avr2加工 , 与
Avr2和 Cf22构成识别复合体 (D ixon et al. , 2000; Krüger et al. , 2002; Rooney et al. , 2005)。也有
学者认为 , R蛋白通过保卫蛋白分子识别 A vr诱导植物防御反应 (Dangl & Jones, 2001)。酵母双杂交
结果显示 , 番茄 P to / avrP to和水稻 Pita /A vr直接互作 , 细菌性斑点病 ( Pseudom onas syringae pv. toma2
to) 和白叶枯病 ( X anthom onas oryzae pv. oryzae) 抗性诱导无需 “保卫 ”蛋白参与 ( Tang et al. ,
1996; J ia et al. , 2000) ; 而 Cf与 A vr是否可以直接互作目前尚无定论 , 推测需要其他蛋白参与 (Lu2
derer et al. , 2001)。
在番茄或茄属 ( Solanum ) 某些植物质膜上发现有 A vr9高亲合位点 ( high2affinity binding site,
HABS) , Cf29诱导 HR 能力与 HABS和 A vr9 亲合性有关 , 而 HABS存在却与是否携带 Cf29 无关
( Kooman2Gersmann et al. , 1996; 1998) ; 番茄中尚未发现 A vr4的 HABS (W esterink et al. , 2002)。
312　C f启动下游信号
番茄应答 C. fu lvum 的侵染可以分为 3个阶段 : 早期包括蛋白激酶激活 ( Romeis et al. , 1999,
2000)、活性氧分子 ( reactive oxygen species, ROS) 产生 (May et al. , 1996; Piedras et al. , 1998)、
膜质氧化和谷胱甘肽积累 (May et al. , 1996) ; 中期包括脂肪氧化酶增加 (May et al. , 1996)、电解
液渗漏 (Hammond2Kosack et al. , 1996 ) 和防御基因表达 (A shfield et al. , 1994; W ubben et al. ,
1996; Pontier et al. , 1998; ) ; 后期包括水杨酸积累、病征出现和细胞程序性死亡 (Hammond2Kosack
et al. , 1996)。
619
　6期 芦丽亚等 : 番茄叶霉菌及番茄抗性基因分子生物学研究进展 　
表达 Cf29茄属 ( Solanum ) 植物 , A vr9迅速诱导离子流改变 (B latt et al. , 1999 )、ROS合成
( Piedras et al. , 1998)、W IPK (Wound2Inducible Protein Kinase, 46 kD )、SIPK ( Salicylic acid2Induc2
ible Protein Kinase, 48 kD) (Romeis et al. , 1999) 和 CDPK (Calcium 2Dependent Protein Kinases) 激
活 (Romeis et al. , 2000, 2001)。ROS合成是植物早期防御反应特征之一 , 与细胞壁加固和信号发
送有关 (Dat et al. , 2000; V ranováet al. , 2002) , 还可以促进 k+离子通道形成、胞外 Ca2 +增加、
W IPK和 SIPK激活 (R ivas & Thomas, 2002)。同时 , 许多独立于 ROS的基因在应答早期也被诱导表
达或 mRNA积累 , 参与信号发送、蛋白激酶诱导和磷酸化的 ACRE ( for genes2A vr9 / Cf29 Rap idly Elic2
ited) 在植物应答中也被激活 (Durrant et al. , 2000; R ivas & Thomas, 2002)。
在转 Cf24烟草细胞中添加 A vr4, PLC (phospholipase C) 激活早于 ROS合成 , 作为 PLC / DG信号
激活因子之一的 PA ( lip id second messenger phosphatidic acid) 也表现出瞬间快速积累 ( de Jong et al. ,
2004) , CDPK在 5m in内也被诱导 (Romeis et al. , 2000)。研究发现 , A vr具有识别蛋白激酶 (MAPK
和 CDPK)、PA和活性钙信号功能 (Romeis et al. , 1999, 2001; de Jong et al. , 2004)。
参与 Cf /A vr信号转导基因分为 4类 : MAP激酶 W IPK和 SIPK, 钙依赖蛋白激酶基因 N tCD PK2
(N icotiana tabacum CDPK2) 和 SGT1, 硫氧还蛋白基因 C ITRX (Cf292interacting thioredoxin) 和丝 /苏氨
酸蛋白激酶基因 L eAC IK1 (L ycopersicon escu len tum A vr9 /Cf29 induced kinase 1) ( Susana et al. , 2004;
Rowland et al. , 2005)。蛋白磷酸化在 A vr9 /Cf29信号转导过程中也扮演着重要角色 , W IPK、SIPK和
N tCDPK2 ( calcium2dependent p rotein kinase) 是目前发现的 3个磷酸化靶点。Cf29识别 A vr9后 , 突触
融合蛋白 ( syntaxin) 快速磷酸化 , 参与内吞转运小泡和膜靶向融合过程 (L in & Scheller, 2000;
Fasshauer, 2003; Heese et al. , 2005)。
γ2氨基丁酸 (γ2am inobutyric acid, GABA ) 在动物体中扮演神经传递素角色 ; C. fu lvum 侵染番
茄后 , GABA代谢转移酶和番茄 GABA合成酶 (谷氨酸脱羧酶 ) 均被诱导 , 番茄中 GABA含量增加
3～4倍 ( Solomon & O liver, 2002; Thomma et al. , 2006) ; 暗示 C. fu lvum 以寄主 GABA作为营养 ,
因而通过调控寄主营养水平可以对 C. fu lvum 增殖加以控制。许多研究还显示 , 植物 R蛋白通过特异
识别 A vr介导防御反应需要有一定的水杨酸水平 (Delaney et al. , 1994) , 暗示植物防御过程是高度
综合信号网络和精细调控系统 (Hammond2Kosack et al. , 1998)。
313　R蛋白自激活
Kruijt (2004b) 模拟植物自然进化进程 , 通过基因重排创造新抗性基因 (R ) , 发现有自动激发
HR现象。NBS2LRR s ( nucleotide binding site leucine rich repeats) 蛋白在保守 NBS或 LRR区域氨基酸
突变或区域交换表现出自激活 ( Hwang & W illiam son, 2003; Zhang et al. , 2003; Howles et al. ,
2005) ; R蛋白当缺乏可识别的配基、分子间或分子内互作被抑制便表现出自激活 , 而当负调控被解
除 , R蛋白自激活将被抑制 (Mackey et al. , 2003 ; Barker et al. , 2006)。某些植物 R基因有时也表
现出自激活 (Bendahmane et al. , 2002; Frost et al. , 2004; W ulff et al. , 2004b)
Hcr9s基因家族 shuffling产物和野生番茄 RLP类抗性基因自激活诱导 HR现象最早在转基因烟草
中被发现 , 当 Hcr9s被超量表达时即使无 A vr9存在也可以诱导 HR (W ulff et al. , 2004b)。Hcr9自激
活普遍存在于 Cf29介导信号转导途径中 , 不过诱导 HR能力在烟草种间存在差异 , 这可能与烟草种间
内源诱导子功能和参与 Cf29级联信号转导成分差异有关 ( Kruijt et al. , 2005b)。R蛋白自激活现象
超越了 R /Avr“保卫 ”假说范畴 , 为抗性蛋白功能研究、番茄 Cf /Avr互作机理阐明提供了新思路。
4　讨论
叶霉菌 (C. fu lvum ) 小种分化快 , 抗性不断丧失是目前番茄抗叶霉病育种面临难题之一 , Cf /
A vr互作机制阐明为该问题解决带来希望。Cf与 A vr识别、植物防御应答、下游信号发送和传递以及
719
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
病原菌侵染致使宿主细胞凋亡 (p rogrammed cell death, PCD ) 分子机制研究将为 Cf /A vr互作机制阐
明提供重要参考 , 也将成为未来研究热点 (Rowland et al. , 2005; W ang et al. , 2005; van den Burg et
al. , 2008)。特别是基于 Cf和 A vr已有研究成果 , 结合传统基因突变策略、利用 V IGS ( virus induced
gene silencing) 快速基因筛查技术、Cf蛋白及其相关蛋白生化分析和鉴定技术 , 将加速研究进程。
R基因在异源物种中成功表达 , 使多个 Cf基因聚合番茄种质创制和因叶霉菌生理小种分化快、
Cf抗性丧失难题解决成为可能 ; 不过 , Cf基因过度利用或抗病品种过度开发 , 使分化出广谱和复合
毒性叶霉菌生理小种风险增加。因而 , 在番茄抗叶霉病育种实践中 , 多类型 Cf /A vr种质混用、在时
间和空间上加以控制策略也值得考虑。
抗性基因自激活对番茄抗叶霉菌育种提供了新思路 , 通过突变 (Barker et al. , 2006) 和 DNA
shuffling技术或基于番茄野生资源通过基因克隆技术获得具有自激活功能叶霉菌抗性基因 , 通过基因
工程手段将目标基因导入商业化番茄 , 有可能成为以后番茄抗叶霉病育种一条捷径。
许多研究结果显示 , C. fu lvum 的 A vr和 Epc分别通过 Cf或 Cf2Ecp诱导 HR, 而有关 Cf /A vr和 Cf2
Ecp /Epc在番茄防御系统特别是下游信号发送和传递中所扮演角色尚未见报道 , 可见对该问题探究也
将成为今后一个很有趣的科学问题。
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