全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (10) : 1437 - 1442
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 05 - 25; 修回日期 : 2009 - 08 - 24
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30760134) ; 中央级科研院所基本科研业务费项目 ( ITBBZD0732) ; 海南省自然科学基金项
目 (808186)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhp6301@1261com; Tel: + 86 - 0898 - 66988564)
番木瓜 eIF ( iso) 4E基因克隆及其结构和表达分析
言　普 , 沈文涛 , 高新征 , 李亚丽 , 周　鹏 3
(中国热带农业科学院热带生物技术研究所 , 农业部热带作物生物技术重点实验室 , 海口 571101)
摘 　要 : eIF4E ( eukaryotic translation initiation factor 4E) 家族基因在多种病毒侵染植物过程中起重要作
用。应用 RT2PCR和 RACE方法在番木瓜中克隆了 cDNA全长为 995 bp的 eIF4E异构体基因 , 命名为 CP2
eIF ( iso) 4E ( GenBank登录号为 FJ595992)。其编码的蛋白含有 206个氨基酸 , 蛋白一级结构中的活性部
位位点高度保守 , 三维结构中可能的抗性位点位于帽结合区域 ( cap2binding pocket) 表面。半定量 RT2PCR
结果表明 , CP2eIF ( iso) 4E在番木瓜叶片中表达较弱 , 在花瓣中表达最强。
关键词 : 番木瓜 ; eIF ( iso) 4E; 结构分析 ; 基因表达
中图分类号 : S 66719; Q 78　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1021437206
eIF ( iso) 4E Full Sequence C lon ing and Structure and Expression Ana lyz ing
in Papaya
YAN Pu, SHEN W en2tao, GAO Xin2zheng, L I Ya2li, and ZHOU Peng3
( Key Laboratory of Tropica l C rop B iotechnology, M inistry of A griculture, Institu te of Tropica l B ioscience and B iotechnology,
Chinese A cadem y of Tropica l A gricultural Sciences, Haikou 571101, Ch ina)
Abstract: eIF4E ( eukaryotic translation initiation factor 4E) fam ily genes p lay important roles against
virus from infecting p lants. A comp lete cDNA of 995 bp from papaya was cloned using the method of RT2PCR
and RACE. It was a isoform eIF4E , so it was named CP2eIF ( iso) 4E ( GenBank accession No. FJ595992).
The p redicted CP2eIF ( iso) 4E p rotein had 206 am ino acids, in which the active site was high conservative
in p rimary structure, and the p redicted virus2resistance site was located on the surface of cap2binding pocket in
32D structure. Sem i2quantitative RT2PCR analysis indicated that CP2eIF ( iso) 4E exp ression was lower in
leaf and higher in petal of papaya.
Key words: papaya; eIF ( iso) 4E; structure analysis; gene exp ression
eIF4E是真核翻译起始因子 ( eukaryotic translation initiation factor 4E) , 能够与 mRNA的 m7 GpppN
帽子结构或帽子同系物特异地交叉结合 , 在蛋白质合成起始起关键作用 ( Tobias et al. , 2004)。在植
物中 eIF4E家族成员包括 eIF4E及其异构体 eIF ( iso) 4E (Leonard et al. , 2002)。最近研究发现 , 植
物的 eIF4E参与植物与病毒的互作 , 是多种 RNA病毒侵染植物的必需因子。已有研究发现在多种马
铃薯 Y病毒属病毒侵染植物过程中 , 病毒与 eIF4E之间的互作起关键作用 (W ittmann et al. , 1997;
Leonard et al. , 2000; Schaad et al. , 2000; M iyoshi et al. , 2006; Roudet2Tavert et al. , 2007)。 eIF4E上
氨基酸的改变能阻断其与病毒互作 , 其植株对病毒具有抗性 , 并且通过基因工程手段导入 eIF4E抗病
基因可以使植株获得抗性 ( Kang et al. , 2007; Yeam et al. , 2007)。
番木瓜环斑病毒 ( Papaya ringspot virus, PRSV ) 是马铃薯 Y病毒属 ( Potyviruses) 的成员之一 ,
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它引起的毁灭性病害严重威胁着各国番木瓜种植业和加工产业。目前还无法通过化学药剂防治
PRSV, 并且番木瓜抗病种质资源匮乏 , 常规抗病品种选育难度大 ( Tripathi et al. , 2008)。 eIF4E与
病毒的互作在病毒侵染植物中所起的重要作用 , 给我们提供了一种新的病毒防治策略 , 即以 eIF4E为
靶点 , 通过转基因超表达 eIF4E突变基因以及干扰 eIF4E感病基因表达 , 以阻断它与病毒之间的互
作 , 就有可能控制病毒的侵染。本研究通过克隆番木瓜 eIF ( iso) 4E全长基因序列 , 并分析其与病
毒互作的关键位点 , 为以番木瓜 eIF ( iso) 4E为靶点进行番木瓜抗 PRSV研究奠定了基础。
1　材料与方法
111　材料
番木瓜品种 ‘苏罗 Ⅰ号 ’, 种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所实验基地。大肠杆菌
( Escherich ia coli) DH5α菌株由本实验室保存 , T载体购自 Takara公司。 TaqDNA高保真聚合酶购自
MB I公司 ; Trizol购自 Invitrogen公司 ; SMART PCR cDNA Synthesis Kit购自 Clontech公司 ; 质粒抽提
和凝胶回收试剂盒购自 OMEGA公司。
112　方法
11211　总 RNA提取和 cDNA合成　
以番木瓜叶片为材料 , 采用常规 Trizol法提取总 RNA。 cDNA合成采用 SMART试剂盒 , 将 2μL
的 RNA (1μg) 与 1μL的 3′CDS Primer和 1μL的 SMART Ⅱ oligo混合均匀 , 72 ℃放置 2 m in后冰浴
2 m in, 短暂离心 ; 随后加入 2μL的 5 ×First2Strand Buffer, 1μL的 dNTP M ix (各 10 mmol·L - 1 ) 和
2μL的 DTT (100 mmol·L - 1 ) , 混匀后再加入 1μL的 Power2Scrip t Reverse Transcrip tase, 42 ℃下反应
60 m in。
11212　引物设计 　
先对水稻、拟南芥、辣椒、番茄、莴苣、甜瓜等物种中已发表的 eIF4E家族基因序列进行比对 ,
在保守区域设计一对简并引物 P1和 P2, 其中 P1为 5′ACTTTCKMYACYGTYGARGA 3′, P2为 5′
TSCTTCCAYTKYTTNCCAAT 3′; P1和 P2扩增得到的片段克隆测序后 , 根据序列设计 3′RACE引物
( P3、P4) 和 5′RACE引物 ( P5、P6) , 其中 P3为 5′CCAAATGGGAGGATCCTGAGTGCG 3′, P4为 5′
GGACTAAGACAGCAGCAAATG 3′, P5为 5′CATTTGCTGCTGTCT TAGTCC 3′, P6为 5′ACTCAGGATC2
CTCCCATTTGG 3′。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。
11213　PCR扩增 　
先以简并引物 P1和 P2扩增番木瓜 eIF4E基因的中间片段 , PCR 反应参数为 : 94 ℃预变性 5
m in, 随后 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环后 , 72 ℃再延伸 10 m in。再以 3′RACE引物
( P3、P4) 和 oligo dT进行巢式 PCR扩增 3′端序列 , 最后以 5′RACE引物 ( P5、 P6) 和接头引物
SMART Ⅱ oligo进行巢式 PCR扩增 5′端序列。巢式 PCR程序为 , 先以 P3和 oligo dT (3′RACE) 或
P5和 SMART Ⅱ oligo (5′RACE) 为引物进行第一轮 PCR, 反应参数为 : 94 ℃预变性 5 m in, 随后 94
℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 25个循环后 , 72 ℃再延伸 10 m in; 再以 1μL PCR产物为模板 , 以 P4
和 oligo dT (3′RACE) 或 P6和 SMART Ⅱ oligo (5′RACE) 为引物进行第二轮 PCR, 反应参数为 :
94 ℃预变性 5 m in, 随后 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 25个循环后 , 72 ℃再延伸 10 m in。PCR扩
增得到的片段连入 T载体后委托 Takara公司测序。
11214　序列分析 　
3个片段测序后把序列提交 BLAST进行检索 , 确认为 eIF ( iso) 4E基因的同源序列后 , 拼接得
到番木瓜的 eIF ( iso) 4E全长基因序列 , 并命名为 CP2eIF ( iso) 4E。利用 VECTOR N IT 9软件将
CP2eIF ( iso) 4E和其它物种中的 eIF4E (包括植物中抗病的 eIF4E以及小麦、人、小鼠、酵母中已
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　10期 言 　普等 : 番木瓜 eIF ( iso) 4E基因克隆及其结构和表达分析 　
知晶体结构的 eIF4E) 进行蛋白序列比对 , 并利用 Swiss2Model软件预测其三维结构 , 分析其与病毒
互作的关键位点。
11215　CP2eIF ( iso) 4E在番木瓜中的组织表达分析　
以半定量 RT2PCR法分析 CP2eIF ( iso) 4E在番木瓜不同组织部位的转录表达水平。分别提取番
木瓜叶片、花瓣和成熟果实的 RNA, 并设计 CP2eIF ( iso) 4E的特异引物 : 5′atggcgagtgaggtagcgat 3′
和 5′gaggttacacattgtatcgact 3′。RT2PCR的扩增程序为 94 ℃预变性 5 m in, 随后 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s,
72 ℃ 45 s, 30个循环后 , 72 ℃再延伸 7 m in。以番木瓜 actin基因为内参 , 引物分别为 : 5′gagct2
gaaagattccgttgc 3′和 5′tctccttgctcactcggtct 3′, 扩增参数同 CP2eIF ( iso) 4E。
2　结果与分析
211　番木瓜 eIF 4E全长基因序列的克隆
先以简并引物 P1和 P2扩增番木瓜 eIF4E基因的中间片段 , 扩增结果为 3～4条非特异带 , 但在
预期大小约 350 bp位置有一条亮带 (图 1, A ) , 回收此条带 , 经克隆测序后把序列提交 BLAST进行
检索 , 发现此片段为 eIF4E异构体 e IF ( iso) 4E的同源片段。根据此片段序列设计 3′RACE引物和
5′RACE引物 , 成功扩增得到了 3′末端和 5′末端片段 , 其中图 1, B为 3′RACE产物 , 在约 400 bp
处有预期大小的目的条带 ; 图 1, C为 5′RACE产物 , 在约 500 bp处有预期大小的目的条带。3′末端
和 5′末端目标片段回收后克隆测序 , 序列提交 BLAST进行检索 , 确认两个片段均为 eIF4E异构体 eIF
( iso) 4E的同源片段。
图 1　番木瓜 eIF ( iso) 4E全长基因序列的克隆
A: 简并引物扩增结果 ; B: 3′RACE结果 ; C: 5′RACE结果。
F ig. 1　C lon ing the full sequece of eIF ( iso) 4E in papaya
A: Amp lified p roducts with degenerate p rimer; B: Product in 3′RACE; C: Product in 5′RACE.
将得到的 3个片段序列拼接 , 得到了番木瓜的 eIF4E全长基因序列 , 并命名为 CP2eIF ( iso) 4E
( GenBank登录号为 FJ595992)。CP2eIF ( iso) 4E全长 995 bp, 其中开放阅读框为 618 bp (42～659
bp) , 编码 206个氨基酸。
212　CP2e IF ( iso) 4结构分析
采用利用 VECTOR N IT 9软件将 CP2e IF ( iso) 4E与其它物种 (人、小鼠、酵母、小麦 ) 中已知
晶体结构的 eIF4E进行蛋白序列比对 , 结果见图 2。 e IF4E在不同物种中均较保守 , 其中人与小鼠的
e IF4E的相似性高达 98% , 而 CP2e IF ( iso) 与小麦 e IF4E的相似性最高 , 为 53% , 适合根据小麦的
e IF4E晶体结构通过同源建模预测的 CP2e IF ( iso) 4E三维结构。 e IF4E的主要功能是与 mRNA的帽
子结构结合 , 同时结合 e IF4G蛋白构成 e IF4F复合体起始翻译过程。通过蛋白序列比对发现 , e IF4E
与帽子结构以及 e IF4G作用的位点 (图 2箭头所示色氨酸 ) , 在番木瓜和其它物种中均高度保守。
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图 2　CP2e IF ( iso) 4E与其它物种中已知晶体结构的 eIF4E的蛋白序列比对
箭头所示色氨酸 (W ) 为 e IF4E与帽子结构及 e IF4G作用的保守位点。
F ig. 2　Prote in a lignm en t of CP2e IF ( iso) 4E and other e IF4E known crysta l structure
The arrows indicate conservative loci of e IF4G and interaction with the cap of mRNA.
在辣椒 ( Ruffer et al. , 2002 )、豌豆 ( Gao et al. , 2004 )、番茄 ( Ruffel et al. , 2005 )、莴苣
(N icaise et al. , 2003)、甜瓜 (N ieto et al. , 2006) 等植物中 , 已经分离和鉴定了对病毒具有抗性的
eIF4E突变基因 ( pvr1、pvr6、 sbm 1、pot1、m o1、nsv) , 这些基因只发生一个或少数几个位点的突变
就可以使植株产生抗性。将 CP2eIF ( iso) 4E与这些植物中的 eIF4E突变基因编码的蛋白进行序列比
对 , 把抗性位点定位在 CP2e IF ( iso) 4E的相应位置 , 结果如图 3。番木瓜 e IF ( iso) 4E蛋白上的
42、43、54、81、82、199等位置上的氨基酸与抗性位点相对应。因此这些位点可能在番木瓜抗
PRSV侵染过程中起关键作用。
图 3　CP2e IF ( iso) 4E与其它植物中的抗性 eIF4E的蛋白序列比对
箭头所示为 CP2e IF ( iso) 4E上与抗性位点对应的氨基酸。
F ig. 3　Prote in a lignm en t of CP2e IF ( iso) 4E and resistance e IF4E in other plan ts
The arrows indicate the am ino acids in CP2e IF ( iso) 4E homologous to those in resistance e IF4E.
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　10期 言 　普等 : 番木瓜 eIF ( iso) 4E基因克隆及其结构和表达分析 　
由于 CP2e IF4E与小麦 e IF4E的蛋白序列相似性高达 53% , 而小麦 e IF4E的晶体结构已经探明 ,
因此 , 以小麦 e IF4E晶体结构为模板 , 通过同源建模能够较好地预测 CP2e IF ( iso) 4E的三维结构 ,
结果如图 4。从三维结构发现 , 通过一级结构比对预测的抗性位点均位于 CP2e IF ( iso) 4E的帽结合
区域 ( cap2binding pocket) 表面 (图 4, B灰色部分 ) , 这进一步说明了这些位点的重要性。
图 4　CP2e IF ( iso) 4E的三维结构预测
A: 骨架结构 ; B: 表面结构。图中灰色部分为 CP2eIF ( iso) 4E上与
抗性位点对应的氨基酸 (同图 3中箭头所示 ) 在三维结构上的定位。
F ig. 4　32D structure pred iction of CP2e IF ( iso) 4E
A: R ibbon model; B: Surface model. The am ino acids in grey are homologous to those in resistance eIF4E.
213　C P 2eIF ( iso) 4E在番木瓜中的组织表达分
析
以半定量 RT2PCR法分析 CP2eIF ( iso) 4E在
番木瓜不同组织部位的转录水平表达 , 结果如图
5所示。CP2eIF ( iso) 4E在番木瓜的叶片、花瓣
和果实中均有表达 , 但在叶中表达较弱 , 而在花
瓣中的表达最强。 图 5　CP2eIF ( iso) 4E在番木瓜组织中的表达分析
F ig. 5　Expression ana lysis of CP 2eIF ( iso) 4E in papaya
3　讨论
随着对植物病毒基因组结构和功能研究的不断深入 , 发现植物病毒蛋白与寄主蛋白之间的相互识
别与作用在病毒感染和致病过程中起关键作用 ( Yeam et al. , 2007) , 因此鉴定病毒必需的寄主蛋白
并以其为靶点阻断它与病毒之间的互作 , 有望控制病毒的侵染。已有研究发现 , eIF4E家族参与植物
与病毒的互作 , 是多种 RNA病毒侵染植物的必需因子。Kang等 (2007) 发现转 prv1番茄植株获得了
对辣椒斑点病毒 ( Pepper m ottle virus) 和烟草蚀纹病毒 ( Tobacco etch virus) 等病毒的抗性。这为以
e IF4E为靶点进行植物抗病毒研究提供了借鉴。
本研究获得了番木瓜的 eIF ( iso) 4E全长基因序列 ( GenBank 登录号为 FJ595992 ) , CP2e IF
( iso) 4E上与 mRNA帽子及 4G作用的活性部位氨基酸与其它 eIF4E的高度保守 , 在执行 eIF4E功能
中起重要作用 , 因此这两个活性部位的氨基酸可能影响 eIF4E与病毒的互作 , 通过突变这些位点构建
eIF4E突变基因 , 就有可能获得不能与病毒作用的 e IF4E突变蛋白 , 从而植株产生对病毒的抗性。另
外 , 通过将 CP2eIF ( iso) 4E与其它植物中的 eIF4E抗性基因进行蛋白序列比对 , 把抗性位点定位在
CP2e IF ( iso) 4E的相应位置 , 并通过三维结构预测发现这些抗性位点均位于 CP2e IF ( iso) 4E的帽
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结合区域 ( cap2binding pocket) 表面。帽结合区域是 e IF4E的重要活性部位 , 这表明这些抗性位点同
样可能在番木瓜与病毒互作中起重要作用。因此 , 这些位点是进行番木瓜抗病毒研究的又一靶点。
同源建模是一种能够从蛋白质的氨基酸序列出发 , 建立 3D模型的计算方法。建立一个成功的模
型需要至少一个已经通过实验测定的蛋白质 3D结构 (模板 ) , 并且该蛋白质的氨基酸序列应与目标
序列有显著的相似性。本研究中由于小麦 e IF4E的晶体结构已经探明 , 而 CP2e IF4E与小麦 e IF4E的
蛋白序列相似性高达 53% , 因此 , 以小麦 e IF4E晶体结构为模板 , 同源建模能够较好地预测 CP2e IF
( iso) 4E的三维结构 , 提高了 CP2e IF ( iso) 4E上关键位点的分析结果的可靠性。
CP2eIF ( iso) 4E在番木瓜叶中表达较弱 , 而在花瓣中的表达较强 , 这与已有研究 ( Plante et
al. , 2004) 报道的 eIF ( iso) 4E主要分布在花及幼嫩的器官里的结果相一致 , 但对于这种组织表达
差异的原因未见报道。作者所在实验室将继续研究 CP2eIF ( iso) 4E与 PRSV的互作及其在抗病中的
作用 , 这将有助于解释 CP2eIF ( iso) 4E在不同组织差异表达的原因。
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