全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (3) : 399 - 404
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 08; 修回日期 : 2009 - 02 - 20
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30371015, 30500394)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: mzbao@mail1edu1cn)
悬铃木下胚轴及叶片再生不定芽的影响因素分析
刘国锋 , 包满珠 3
(华中农业大学园艺林学学院 , 园艺植物生物学教育部重点实验室 , 武汉 430070)
摘 　要 : 以悬铃木的下胚轴和离体叶片为材料 , 研究了基因型、植物生长调节剂、光照条件、外植体
部位等因素对其不定芽分化的影响。结果表明 : 1) 62BA与 IBA的浓度比对下胚轴不定芽的分化影响较大 ,
以 62BA ∶IBA小于 20 ∶1较为合适 ; 而叶片的不定芽再生受基因型的影响显著 , 在 4种供试材料中 , PH2的
再生能力最强 , 但 011～110 mg·L - 1 TDZ不利于其不定芽再生。2) 黑暗培养对下胚轴的不定芽分化有一
定的促进作用 , 但不利于叶片的不定芽再生 , 50～100 lx的弱光有利于叶片的不定芽分化。3) 不同部位的
下胚轴切段及叶片的再生能力差异显著 , 其中靠近子叶的下胚轴切段和试管苗顶端的 2枚叶片再生能力较
强。此外 , 刻伤叶片的再生效果明显优于叶片切块 , 说明悬铃木的叶片与下胚轴的离体培养存在明显的生
物全息现象。
关键词 : 悬铃木 ; 叶片 ; 下胚轴 ; 不定芽分化 ; 组织培养 ; 全息现象
中图分类号 : S 68711　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0320399206
Factors Affecting Shoot Regenera tion from L eaf and Hypocotyl Explan ts of
P la tanus acerifo lia W illd.
L IU Guo2feng and BAO Man2zhu3
( Key Laboratory of Horticu ltura l P lan t B iology, M inistry of Education, College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong
A gricultural U niversity, W uhan 430070, China)
Abstract: Effects of different genotypes, PGR s, illum ination conditions and position of exp lants on ad2
ventitious shoot regeneration from hypocotyl and /or leaf of P la tanus acerifolia were investigated. The results
indicated that the ratio of 62BA to IBA in the medium influenced shoot regeneration of hypocotyl segments and
62BA ∶IBA < 20 ∶1 gave a better effect; Shoot regeneration from leaf exp lants was significantly different among
four different genotypes investigated, with the highest regeneration rate obtained for leaf exp lants of genotype
PH2, and TDZ was less effective than 62BA to induce shoot regeneration from PH2 leaves. Maintaining the
cultures in darkness for the first month p romoted shoot regeneration of hypocotyl exp lants to some extent, but
leaves incubated in darkness regenerated less shoots evidently; L ight intensity of 50 - 100 lx was favorable to
shoot regeneration. Significant differences of regeneration capability existed among different sections of hypo2
cotyl and position of leaves, and the hypocotyl section adjacent to the cotyledons and the uppermost two leaves
of the shoots showed better regeneration capability than the lower sections and leaves. Furthermore, shoot re2
generation of the intact leaves wounded by three cuts was more efficient than that of severed leaf segments, in2
dicating that the EC IWO /holographic phenomenon existed during in vitro culture of hypocotyls and leaves of
P. acerifolia.
Key words: P la tanus acerifolia; leaf exp lant; hypocotyl exp lant; shoot regeneration; tissue culture;
holographic phenomenon
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
悬铃木 ( P la tanus acerifolia W illd. ) 在全球范围内被广泛用作行道树和庭荫树。针对悬铃木落果
飞毛问题 , 园林科研工作者先后从诱变育种、修剪控果、选育少果品系等多方面展开了研究 , 但至今
仍未能从根本上解决问题。近年来 , 通过转基因创造不育已经成功地应用于多种植物 (B runner et
al. , 2007) , 该技术为无果 (毛 ) 悬铃木的培育提供了快捷、可靠的途径。
本实验室分别以二球悬铃木的下胚轴和叶片作外植体 , 成功地建立了其植株再生体系 (L iu et
al. , 2002; L iu & Bao, 2003) ; 最近又建立了二球悬铃木的遗传转化技术体系 (L i et al. , 2007)。另
外 , 王磊等 (2004)、李红双等 (2006) 也分别报道了二球悬铃木植株再生体系的建立及遗传转化研
究 ; 范国强等 ( 2003, 2006 ) 报道了三球悬铃木的植株再生及遗传转化研究 ; 邹永梅和施季森
(2005) 报道了一球悬铃木遗传转化体系统的建立。尽管目前关于悬铃木的植株再生和遗传转化已有
多篇报道 , 但研究仍不系统 , 且研究结果存在较大差异 , 转化效率低。为此 , 作者在已建立的再生体
系基础上 , 进一步探讨植物生长调节剂、光照、外植体部位、基因型等多种因素对悬铃木下胚轴和叶
片再生不定芽的影响 , 旨在完善并建立高效的悬铃木再生体系 , 为提高其转化效率奠定基础。
1　材料与方法
111　植物材料
悬铃木的种子采自华中农业大学校园内一株成年优树 (基因型命名为 PC)。2003—2005年每年
12月 —翌年 1月期间 , 采集成熟球果 , 剥离种子并除净种毛 , 晾干后 4 ℃低温贮藏备用。
离体叶片取自本实验室增殖保存的试管苗 , 包括 4种不同的基因型 ( PC、PH1、PH2和 PH6) ,
其中 PC由优树的柄下芽萌发增殖而来 , PH1、PH2和 PH6则分别为 3个不同实生苗的下胚轴经再生
扩繁而来的无性系 (L iu et al. , 2002)。试管苗于增殖培养基 MS + 62BA 013 (单位 : mg·L - 1 , 下同 )
中继代保存 , 每 2～3个月继代 1次。
112　下胚轴再生不定芽的影响因素试验
种子发芽后 , 取长 2～3 cm的幼苗 , 按 L iu等 (2002) 的方法消毒后将下胚轴切成 5～7 mm的小
段 , 用于接种。
①下胚轴切段不分部位接种于 6种不同植物生长调节剂组合 (表 1) 的培养基中 , 于 ( 25 ±1)
℃条件下培养。设光照培养 (光照强度 1 000～1 200 lx, 每天光照 14 h) 和先黑暗培养 1个月再转到
光下培养两种处理。
②将下胚轴分成上 (靠近胚芽 )、中、下 (靠近胚根 ) 3个区段 , 分别接种于 MS + 62BA 410 +
IBA 015诱导培养基 (L iu et al. , 2002) , 于 (25 ±1) ℃、光照条件下培养。
培养基中均添加 3%的蔗糖 , 7 g·L - 1琼脂粉 , pH值调至 518～610, 于 121 ℃, 111 kg·cm - 2压
力下灭菌 20 m in (下同 )。每处理接种 5个培养皿 , 每皿接入 10个外植体 ; 定期观察 , 2个月后统计
结果 ; 试验重复 2次。
113　叶片再生不定芽的影响因素试验
①基因型 : 在无菌条件下剪取 PC、PH1、PH2和 PH6的 2月龄试管苗顶部 3～4枚完全展开的叶
片 , 切去叶尖和叶柄 , 并用锋利刀片于叶背垂直主脉方向均匀割划 3～4刀 (不切断叶片 ) , 分别接
种于 MS + 62BA 610 + IBA 015诱导培养基 (L iu & Bao, 2003) , 于 (25 ±1) ℃、弱光条件 (50～100
lx, 14 h·d - 1 ) 下培养。每处理接种 6个培养皿 , 每皿接入 10个外植体 ; 定期观察 , 2个月后统计
结果 ; 试验重复 2次 ; 下同。
②光照强度 : 根据不同基因型的试验结果 , 选择再生效果好的 PH2为材料 (下同 ) , 将其 2月龄
试管苗的叶片割伤后接种于 MS + 62BA 610 + IBA 015, 分别置于黑暗 ( 0 lx)、弱光 ( 50～100 lx)、
正常光 (1 000～1 500 lx)、强光 (2 000～2 500 lx) 下 , (25 ±1) ℃培养。
004
　3期 刘国锋等 : 悬铃木下胚轴及叶片再生不定芽的影响因素分析 　
③叶片着生部位 : 取 PH2试管苗顶部完全展开的 4枚叶片 , 割伤后按由上往下的着生次序 (即
第 1、第 2、第 3 和第 4 叶 ) 依次接种于编号为 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的培养皿中 (培养基为 MS +
62BA 610 + IBA 015) , 每培养皿接种 10个着生部位相同的叶片 ; (25 ±1) ℃、弱光条件下培养。
④叶片切割方式 : 以 PH2为材料 , 采用割伤 (同上 ) 和切块 (将叶片切成完全分开的 3～4段 )
处理叶片后 , 分别接种于诱导培养基 MS + 62BA 610 + IBA 015; (25 ±1) ℃、弱光条件下培养。
⑤TDZ: 以 PH2为试料 , 将其叶片刻伤后分别接种于含有不同浓度 TDZ ( 011, 015, 110 mg·
L - 1 ) 与 IBA (0, 015 mg·L - 1 ) 组合的 MS培养基 , 定期观察叶片生长及不定芽的诱导情况。
114　数据统计与分析
培养 2个月后 , 对不同处理按每个培养皿 (看作 1个重复 ) 统计不定芽的诱导率 (再生不定芽
的外植体数 /外植体总数 ×100% ) , 以及平均每外植体诱导芽丛数 (诱导芽丛数 /诱导出芽外植体
数 )。所得数据采用 SAS软件进行方差分析和多重比较分析 (Duncan’s法 )。百分数和计数数据分别
经反正弦 ( y = arcsin x1 /2 ) 和对数 [ y = lg ( x + 1) ] 转换后 , 再进行统计分析。
2　结果与分析
211　影响悬铃木下胚轴不定芽再生的因素
21111　植物生长调节剂配比与光照条件 　试验结果 (表 1) 表明 , 在光下培养 , 添加不同浓度 62BA
和 IBA的培养基中下胚轴的不定芽再生差异明显 , 最高和最低再生频率分别为 4510% (图版 , A )
和 1313%。其中当 62BA浓度一定时 , IBA 015 mg·L - 1比 011 mg·L - 1更有利于不定芽分化 , 且随着
62BA浓度升高 , 表现更为明显 ; 62BA浓度增加时 , 不定芽的诱导率趋于下降 , 且当 IBA浓度相对较
低 (011 mg·L - 1 ) 时表现更为明显。当 62BA ∶IBA小于 20 ∶1时不定芽的诱导率变化不大 , 而当超
过 40 ∶1时诱导率显著下降。不同 62BA与 IBA配比对平均每外植体再生芽丛数的影响相对较小。
先黑暗培养 1个月再转至光下培养可明显改善下胚轴的不定芽分化 , 在 6种测试培养基中 , 4种
培养基上存在显著差异 ; 但黑暗培养对每外植体的出芽数并无显著影响。经过 1个月的黑暗培养 , 不
同植物生长调节剂配比间的差异由显著变为不显著 , 不定芽的诱导率均超过 40%。
表 1　不同 62BA与 IBA配比和光照条件对悬铃木下胚轴不定芽再生的影响
Table 1　 Influences of 62BA and IBA com b ina tion s and illum ina tion cond ition s
on shoot regenera tion from hypocotyl explan ts of P. acerifo lia
光照条件
L ight condition
生长调节剂组合 / (mg·L - 1 ) PGR combination
62BA IBA 不定芽再生频率 /%Frequency of shoot regeneration 平均每外植体出芽丛数No. of shoots per regenerating exp lant
光照 L ight 210 011 3216 ±418 ba3 216 ±013 ba
015 4510 ±614 a 213 ±013 ba
410 011 2117 ±418 cb3 310 ±013 a
015 3010 ±411 ba3 215 ±014 ba
610 011 1313 ±215 c3 212 ±011 ba
015 3117 ±613 ba 119 ±012 b
黑暗→光照 210 011 4810 ±317 a 217 ±013 a
Dark→L ight 015 5610 ±511 a 215 ±014 a
410 011 4117 ±410 a 313 ±014 a
015 5313 ±412 a 215 ±013 a
610 011 4117 ±311 a 214 ±014 a
015 4510 ±716 a 213 ±012 a
　　注 : 表中数据为平均值 ±标准误 ; 相同培养条件下同一栏中不同英文字母表示数据间差异显著 ( P = 0105) ; 3 表示不同光照条
件之间存在显著差异 ( P = 0105)。
Note: Values rep resent the means ±SE. Means followed by different letterswithin the same column of same light condition are significantly dif2
ferent at P = 0105; 3 indicates significant differences between light conditions at P = 0105.
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
21112　下胚轴部位 　如表 2所示 , 下胚轴上部切
段再生能力最强 , 出芽率为 50% , 平均每外植体
出芽 2～3丛 (图版 , B ) ; 下部切段再生能力最
差 ; 中部切段介于两者之间。
212　影响悬铃木叶片不定芽再生的因素
21211　基因型 　表 3表明 , 不同基因型间的再生
频率及平均每叶片出芽数均达到极显著差异 ( P
< 01001) , 其中 PH2的再生能力最强 , 其次为
PH6, PH1和 PC最低。
21212　光照条件 　叶片在弱光 (50～100 lx) 下
培养再生效果最佳 (表 4; 图版 , C) ; 随光照增
强再生频率急剧下降 , 光照达 2 000～2 500 lx时
叶片基本丧失再生能力 (图版 , D ) ; 黑暗中叶片
的再生频率与正常光下没有显著差异 , 但正常光
下叶片生长缓慢 , 并在培养初期形成大量花青素 ,
然后在切口部位 (尤其是主脉处 ) 形成一些致密
表 2　不同部位下胚轴切段不定芽再生能力的差异
Table 2　D ifferences of shoot regenera tion capab ility
of d ifferen t position of hypocotyl segm en ts
下胚轴部位
Position of
hypocotyl section
再生频率 /%
Frequency of shoot
regeneration
平均每外植体出芽丛数
Number of shoots per
regenerating exp lant
上部 Upper 5010 ±415 a 216 ±012 a
中部 M iddle 3010 ±312 b 117 ±012 b
下部 Lower 1010 ±312 c 113 ±012 b
表 3　不同基因型对悬铃木叶片不定芽再生的影响
Table 3　Effect of d ifferen t genotypes on shoot regenera tion
from leaves of P. acerifolia
基因型
Genotype
再生频率 /%
Frequency of shoot
regeneration
平均每叶片出芽丛数
Number of shoots per
regenerating leaf
PH1 1010 ±317 c 114 ±012 c
PH2 7510 ±413 a 315 ±013 a
PH6 4117 ±514 b 212 ±012 b
PC 617 ±313 c 113 ±012 c
的绿色愈伤组织 , 不定芽分化相对较晚 ; 黑暗中
叶片膨大迅速并形成较多的淡黄近白色疏松愈伤 ,
不定芽的分化较早。
21213　叶片着生部位 　位于试管苗顶端的 2枚叶
片再生能力最强 (表 5) , 然后依次为第 3和第 4
叶 (图版 , E) , 即着生部位越低再生能力越差。
21214　叶片切割方式 　采用刻伤处理的叶片不定
芽的诱导率在 70%以上 , 平均每外植体出芽 3～4
丛 ; 而完全切断的叶块的不定芽诱导率仅为 20%
左右 , 平均每外植体出芽 1～2丛 (图版 , F)。
可见 , 将悬铃木的叶片切成多块对再生十分不利。
21215　TDZ　含 110 mg·L - 1 TDZ以及 015 mg·
L - 1 IBA的培养基均可诱导部分叶片形成不定芽 ,
但分化频率很低 (617% ～20% ) , 不定芽多呈畸
形 , 或难以继续生长成正常小苗 ; 培养 1个月后 ,
多数培养基中的外植体逐渐发黑 , 呈水渍状死亡 ,
且 TDZ浓度越高 , 表现越明显。
表 4　不同光照强度对悬铃木叶片不定芽再生的影响
Table 4　Effect of light in ten sity on shoot regenera tion
from leaves of P. acerifolia
光照强度 / lx
L ight intensity
再生频率 /%
Frequency of
shoot regeneration
平均每叶片出芽丛数
Number of shoots per
regenerating leaf
黑暗 Dark 3313 ±314 b 211 ±012 b
50～100 7215 ±418 a 314 ±014 a
1 000～1 500 2114 ±417 b 311 ±015 a
2 000～2 500 613 ±318 c 110 ±010 c
表 5　着生部位对悬铃木叶片不定芽再生的影响
Table 5　Effect of d ifferen t position s of leaves on
shoot regenera tion in P. acerifo lia
叶片着生次序
Position of leaves
再生频率 /%
Frequency of
shoot regeneration
平均每叶片出芽丛数
Number of shoots per
regenerating leaf
第 1叶 First leaf 9313 ±313 a 413 ±014 a
第 2叶 Second leaf 8510 ±612 a 412 ±016 ab
第 3叶 Third leaf 6617 ±419 b 312 ±015 ab
第 4叶 Fourth leaf 4617 ±412 c 217 ±014 b
3　讨论
本研究结果表明 , 除植物生长调节剂配比外 , 光照对悬铃木下胚轴不定芽分化也有较大影响。一
般认为暗处理可减少外植体酚类物质的释放 , 从而利于不定芽分化。本研究中当植物生长调节剂配比
不利于下胚轴分化芽时 , 先黑暗培养 1个月可以显著提高不定芽的分化频率 ; 而当芽的诱导率相对较
高 ( > 30% ) 时 , 黑暗培养对不定芽的分化却没有显著影响 , 可能是因为其分化频率已接近上限。
基因型是影响悬铃木叶片再生的关键因素 , 本研究中 4种遗传背景不同的材料中仅 PH2的再生
效果相对较好 (表 3)。叶片的着生部位也很重要 , 其中处于试管苗顶端的第 1枚叶片最容易分化不
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　3期 刘国锋等 : 悬铃木下胚轴及叶片再生不定芽的影响因素分析 　
定芽 , 这是因为位于植株上部的叶片仍处于生长阶段 , 细胞分裂活跃 , 对离体诱导的反应比较敏感 ,
而下部的叶片已基本停止生长 , 对离体诱导的反应迟钝。然而 , 饶红宇 ( 2000) 在杨树研究中发现
下部 (第 4、5枚 ) 叶片的分化频率较高 , 说明不同物种间存在差异。光照条件同样有着重要的影
响 , 强光不仅不利于芽的分化 , 而且会抑制愈伤组织的形成与生长 , 这与 Yepes和 A ldwinckle
(1994) 在研究苹果叶片再生时的报道是一致的。
据 Huetteman和 Preece (1993) 报道 , TDZ是木本植物离体培养中活性最强的细胞分裂素类似物
质 , 但本研究表明 TDZ并不适宜于悬铃木叶片的植株再生。邹永梅和施季森 ( 2005) 在进行一球悬
铃木叶片不定芽分化研究时也发现 , TDZ不管是单独作为细胞分裂素使用还是与 62BA合用 , 均不能
促进不定芽分化 ; Pawlicki和 W elander (1994)、Caboni等 (1999) 也曾分别报道 TDZ对部分苹果品
种和野生梨的离体再生表现不利 , 说明 TDZ并非对所有木本植物均能表现出良好的离体诱导效果。
倪德祥 (1986)、汤朝起等 (1996)、陈火英等 ( 1999)、周根余等 (2000)、宋英今等 ( 2007)
先后以大蒜鳞茎、黄瓜子叶、番茄下胚轴、洋桔梗叶片和生菜子叶为外植体 , 证实了组织培养过程中器
官形态发生的生物全息律。本研究结果显示 , 悬铃木下胚轴从上到下各段的不定芽诱导能力依次减小
(表 2) , 这种梯度变化与陈火英等 (1999) 用番茄下胚轴培养时所得的规律一致 , 体现了生物全息律的
全息对应关系 ; 在悬铃木的叶片培养中 , 刻伤的叶片比切块具有更强的再生能力 , 而且无论是刻伤还是
切段的叶片 , 不定芽的再生主要发生在外植体的近基端 (即刻伤叶片的基部和叶片切块的下段 ) , 这也
是生物全息律的重要体现。根据全息胚学说 , 叶片切段后 , 任何一段都是一个全息胚 , 它们的生理生化
特性应和整体相对应 ; 且全息胚的级越低 , 独立性越大 , 与整体的联系就越小 , 器官再生就越困难。
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图版说明 : A、B. 悬铃木下胚轴切段的不定芽再生 (MS + 210 mg·L - 1 62BA + 015 mg·L - 1 IBA) ; C、D. 50～100 lx (C) 和 2 000
～2 500 lx (D) 条件下叶片的离体培养 (MS + 610 mg·L - 1 62BA + 015 mg·L - 1 IBA) ; E. 试管苗第 4叶片的不定芽再生 ; F. 叶片
切块的不定芽再生。
Explana tion of pla tes: A, B. Shoot regeneration from hypocotyl segments of Platanus acerifolia, after 50 d of cultivation on MS + 210 mg·L - 1
62BA + 015 mg·L - 1 IBA; C, D. Leaf exp lants cultured on MS + 610 mg·L - 1 62BA + 015 mg·L - 1 IBA under light intensity of 50 - 100 lx
( C) and 2 000 - 2 500 lx (D) for 60 d; E. Shoot regeneration of the fourth leaf on MS + 610 mg·L - 1 62BA + 015 mg·L - 1 IBA; F. Shoot re2
generation of leaf segments cultured on MS + 610 mg·L - 1 62BA + 015 mg·L - 1 IBA under low light intensity (50 - 100 lx) .
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