全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (9) : 1339 - 1344
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 05 - 18; 修回日期 : 2009 - 07 - 27
基金项目 : 福建省自然科学基金项目 (C0410040 )3 E2mail: fp liu5334@ sina1com
过氧化氢与蝴蝶兰胚性愈伤组织诱导
刘福平 3 , 陈　淳 , 许传俊
(福建省亚热带植物研究所 , 福建厦门 361006)
摘 　要 : 从蝴蝶兰类原球茎切块诱导胚性愈伤组织 , 诱导期间培养物 DNA甲基化程度持续下降 , 与
H2O2含量变化呈极显著负相关。在降低 62BA浓度的培养基中添加 H2O2可提高愈伤组织诱导率 , 在诱导培
养基中添加 H2O2淬灭剂二甲基硫脲降低了愈伤组织诱导率 , H2O2可能是诱导胚性愈伤组织的信号分子之
一。愈伤组织诱导期间 SOD活性对 H2O2水平变化起主导作用。
关键词 : 蝴蝶兰 ; 胚性愈伤组织 ; H2O2 ; DNA甲基化 ; 抗氧化酶
中图分类号 : S 682131; Q 94311 　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0921339206
H2O2 and Em bryogen ic Ca llus Induction of Pha laenopsis spp.
L IU Fu2p ing3 , CHEN Chun, and XU Chuan2jun
( Fujian Institu te of Subtropical B otany, X iam en, Fujian 361006, Ch ina)
Abstract: Embryogenic callus was induced from PLB ( p rotocorm2like body) cubes of Phalaenopsis
spp. During callus induction, DNA methylation levels in cultures declined continuously and had a very sig2
nificant negative correlation with the change of H2 O2 content. Supp lemented H2 O2 in the medium containing
lower concentration of growth regulator ( 62BA ) , the induction rate of callus increased, and this indicated
that exogenous H2 O2 could be used to rep lace part of growth regulator for embryogenic callus induction. The
induction rate of embryogenic callus decreased when supp lemented dimethylthiourea, a quencher of H2 O2 , in
culture medium. H2 O2 was possibly a signal molecule that mediated the induction of embryogenic callus. In
callus induction period, SOD activity p layed an important role in the change of H2O2 content in cultures.
Key words: Phalaenopsis spp. ; embryogenic callus; H2 O2 ; DNA methylation; antioxidas
有研究表明 , 植物的愈伤组织诱导与其 H2 O2水平有关 , 邹华文等 ( 2005 ) 报道在诱导魔芋
(Am orphopha llus a lbus) 的愈伤组织过程中 , 催化积累 H2 O2的超氧化物歧化酶 ( SOD ) 活性一直处于
较高水平 , 而催化分解 H2 O2的过氧化物酶 ( POD ) 和过氧化氢酶 (CAT) 的活性都较低 , 推测适当
高水平的 H2 O2可以诱导愈伤组织的发生 ; 田敏等 (2004) 和禹艳红等 (2005) 报道愈伤组织的诱导
或分化都伴随内源 H2 O2水平的提高。枸杞 (L ycium barbarum L. ) 胚性愈伤组织的内源 H2 O2含量也远
远高于继代愈伤组织 , 而将继代愈伤组织转入含一定浓度外源 H2 O2的分化培养基时 , 体细胞胚发生
频率明显提高 (Cui et al. , 1999)。胚性细胞的形成过程也是细胞分化的过程 , H2 O2有可能通过细胞
信号传递系统影响基因调控表达 , 从而诱导胚性细胞的形成 (崔凯荣和戴若兰 , 2000)。
兰科植物离体培养所诱导的类原球茎 ( PLB s) 是体细胞胚的表现形式 , 在蝴蝶兰 ( Phalaenopsis
spp. ) 叶和 PLB诱导的愈伤组织中观察到了胚性细胞 (刘福平和陈移亮 , 2007; 吕晓辉 等 , 2007)。
作者分析诱导蝴蝶兰愈伤组织期间培养物活性氧变化与 DNA甲基化水平的关系 , 以外源 H2 O2部
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分替代生长调节剂诱导胚性愈伤组织 , 了解 H2 O2淬灭剂对愈伤组织诱导的影响 , 并就培养物 H2 O2代
谢的生化基础进行初步研究。
1　材料与方法
111　胚性愈伤组织诱导及其活性氧水平和 D NA甲基化测定
试验于 2006—2007年在福建省亚热带植物研究所进行。选用的浅紫红色大花蝴蝶兰 YZ45取自本所
组培室。以初代 PLB切块诱导出的 PLB s (刘福平 等 , 2007) 为材料。培养基为 1 /2 MS (大量元素 ) +
510 mg·L - 1 62BA + 20%椰汁 + 2%蔗糖 , 每粒 PLB s切成 3～5约 115 mm的小块 , 每瓶放置 25～35块 ,
每处理 5瓶以上 , 培养温度 24～26 ℃, 光照强度 1 500 lx左右 , 12 h·d - 1。在诱导 0、4、11、18、25、
32 d取培养物分析活性氧水平、DNA甲基化水平、抗氧化酶活性等指标 , 重复 3次。
羟自由基 (OH·) 相对含量的测定参照 Popham和 Novacky (1991) 及徐向荣等 (1999) 的方法
稍修改。培养物 OH·相对含量以每克鲜样反应后在 420 nm处的光吸收值表示。
超氧阴离子 (O -·2 ) 生成速率参照汤章成 (1999) 的方法测定 , 以 mmol·m in - 1 ·g - 1 FW表示。
培养物加入预冷的丙酮及样品鲜样质量 20%的活性炭 , 冰浴研磨 , 4 ℃ 10 000 ×g离心 15 m in,
参考沈文飚等 (1997) 的方法测定 H2O2含量 , 结果以μmol·g - 1 FW表示。
DNA 提取采用 CTAB法 , 分别在 280 、260和 230 nm比色 , A260 /A280 = ±118, A260 /A230 > 210,
进行 DNA纯度测定。DNA水解及甲基化水平测定参照贾峰等 (2007) 的方法 , 在风干的 DNA中加
入 70%高氯酸 50μL, 于沸水浴中水解 1 h , 然后用 5 mol·L - 1的 KOH调至 pH 3～4, 形成沉淀后于
12 000 r·m in - 1离心 10 m in, 收集上清液 , 经 0145μm微孔滤膜加压过滤 , 在 25 ℃下注入 HPLC (东
芝 T2000P) 的 Hypersil BDS C18柱 (200 mm ×410 mm, 5μm , 大连伊利特分析仪器有限公司提供 )
分离 , 柱温 25 ℃。流动相由甲醇、10 mmol·L - 1戊烷磺酸钠、三乙胺按体积比 6∶90∶012配成 , pH
410, 流速 015 mL·m in - 1。胞嘧啶 (C) 及 5 -甲基胞嘧啶 (5mC) 购自 SIGMA 公司 , 检测波长 273
nm, 根据样品 DNA 水解产物中 C 和 5mC 的洗脱峰面积 , 计算样品中 C 和 5mC 的克分子数 ,
DNA甲基化水平 ( % ) = 5mC / (C + 5mC) ×100。
112　外源 H2O2对胚性愈伤组织的诱导试
在已高压消毒的培养基 1 /2 MS + 210 mg·L - 1 62BA + 20%椰子汁 + 2%蔗糖中加入 H2 O2溶液 , 使
培养基所含 H2 O2终浓度分别为 50、100、200、400、800μmol·L - 1 , 以不加 H2O2的为对照 , 接入
PLB切块 , 培养条件同 111, 一个月后计算愈伤组织诱导率。
113　二甲基硫脲对胚性愈伤组织的诱导试验
H2O2淬灭剂二甲基硫脲 (DMTU) 溶液经过滤灭菌加入已高压消毒的诱导培养基 (同 111) 中 ,
使培养基所含 DMTU终浓度分别是 0 (对照 )、011、012、110、510、1010 mmol·L - 1 , 接入 PLB切
块 , 培养条件同 111, 一个月后计算愈伤组织诱导率。
114　H2 O2代谢相关抗氧化酶活力测定
以 0105 mol·L - 1 PBS液 (含 011 mmol·L - 1 EDTA、4% PVP, pH 718) 冰浴研磨培养物 , 4 ℃
10 000 ×g离心 20 m in, 取上清液测定酶超氧化物歧化酶 ( SOD) 活性 (汤章成 , 1999)。
以 011 mol·L - 1 PBS液 (pH 710) 冰浴研磨培养物 , 4 ℃ 5 000 ×g离心 , 定容 , 愈创木酚显色
法测定过氧化物酶 ( POD ) 活性 (张志良 , 1990)。
采用碘量法测定过氧化氢酶 ( CAT) 活性 , 酶提取方法同 POD , PBS液 pH 714 (张志良 ,
1990)。
参照李惠华和赖钟雄 (2006) 及汤章成 (1999) 方法 , 培养物研磨后离心 ( 4 ℃ 15 000 ×g 15
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m in) , 吸取上清粗酶液 , 加入反应液 , 测 290 nm吸光值 , 随后加入 011 mmol·L - 1 H2 O2启动反应 ,
40 s内每 10 s连续记录吸光值的变化 , 测定抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 活性 , 室温下每 m in氧化 1
μmol抗坏血酸的酶量为一个酶活性单位 (U )。
2　结果与分析
211　活性氧水平与基因组 D NA甲基化程度的关系
在胚性愈伤组织形成过程中 , 培养物 DNA甲基化程度持续下降 , 即去甲基化程度持续升高 (表
1)。由于所分析的 3种活性氧在细胞中是否都对 DNA甲基化产生效应仍不清楚 , 求它们各自与 DNA
甲基化程度的密切程度分别计算简单相关系数和偏相关系数。O -·2 产生速率与 DNA甲基化程度的简单
相关系数和偏相关系数分别为 - 01339和 - 01379, OH·相对含量与 DNA甲基化程度的两个相关系数
分别为 01173和 01083, 均不显著。内源 H2 O2含量在诱导初始下降 , 第 4天后才持续升高 , 与 DNA
甲基化程度变化相反 , 两者简单相关系数为 - 01781, 偏相关系数为 - 01790, 绝对值均大于临界值
( r0101 = 01590和 r0101 = 01737) , 即培养物 H2 O2含量与 DNA甲基化程度的相关性达极显著水平。可见 ,
相对其他两种活性氧变化 , H2O2与基因组 DNA去甲基化程度有较明显关系。
表 1　诱导期间培养物活性氧、D NA甲基化程度以及相关酶活性的变化
Table 1　Change of RO S indexes and D NA m ethyla tion level in cultures dur ing induction per iod
诱导时间 / d
Inducing time
DNA甲基化程度 / %
DNA methylation level
O -·2 产生速率
/ (μmol·m in - 1 ·g - 1 FW )
Producing rate of O -·2
OH·相对含量
/ (A420 ·g - 1 FW )
Relative content of OH·
H2O2 含量
/ (μmol· g - 1 FW )
H2O2 content
0 20170 ±1151 aA 1176 ±0108 cCD 0157 ±01011 cC 14210 ±3112 dD
4 11139 ±0158 bB 2109 ±0110 bB 0161 ±01009 bB 7513 ±1120 eE
11 8155 ±0158 cC 3130 ±0114 aA 0150 ±01004 dD 36212 ±9162 cC
18 7184 ±0168 cCD 3134 ±0106 aA 0150 ±01013 dD 61214 ±11104 bB
25 6145 ±0128 dDE 2112 ±0108 bB 0145 ±01012 eE 61910 ±21106 bB
32 4151 ±0117 eE 1192 ±0108 cBC 0164 ±01014 aA 83913 ±26151 aA
　　注 : 数据按邓肯氏新复极差测验 , 不同大写和小写字母分别表示α= 0101和α= 0105水平下差异显著性。
　　Note: Data were analyzed by Duncanpismultip le new range test and the different cap ital and small letters indicate significant differences atα=
0101 andα= 0105 levels, respectively.
212　外源 H2O2和二甲基硫脲对胚性愈伤组织诱导的影响
为了了解外源 H2 O2对胚性愈伤组织诱导的效应 , 把诱导培养基中的 62BA浓度从 510 mg·L - 1
(最适浓度 ) 调低到 210 mg·L - 1 , 并加入外源 H2 O2 , 当 H2 O2浓度达 100μmol·L - 1时诱导率提高到
5 9 % ,与对照 ( 48 % )差异达到极显著水平 (表 2 ) ,说明外源 H2 O2可部分替代 6 2BA诱导蝴蝶兰愈
表 2　外源 H2O 2和二甲基硫脲对愈伤组织诱导的影响
Table 2　Effect of exogenous H2O 2 and DM TU on ca llus induction ra te
62BA
/ (mg·L - 1 )
H2O2
/ (μmol·L - 1 )
诱导率 /%
Induction rate
62BA
/ (mg·L - 1 )
DMTU
/ (mmol·L - 1 )
诱导率 /%
Induction rate
210 0 (对照 Control) 48 ±410 510 0 (对照 Control) 82 ±518
210 50 54 ±311 510 011 73 ±6123
210 100 59 ±5183 3 510 012 59 ±4173 3
210 200 57 ±5173 510 110 51 ±2183 3
210 400 47 ±419 510 510 30 ±3183 3
210 800 41 ±4193 510 1010 7 ±3183 3
　　注 : 数据按 Dunnett最小显著差数 (DLSD) 测验法 , 3 3 和 3 分别表示α= 0101和α= 0105水平下差异显著性。
　　Note: Data were analyzed with Dunnett method (DLSD) , 3 3 and 3 indicate different significance atα= 0101 andα= 0105 levels, re2
spectively.
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伤组织 , 但 H2 O2浓度过高则抑制了愈伤组织的诱导。在 62BA浓度为 510 mg·L - 1的培养基中添加
H2 O2淬灭剂 DMTU, 愈伤组织诱导率显著降低 , 而且诱导出的愈伤组织较小 , 说明 DMTU消除培养
物的内源 H2 O2 , 可降低愈伤组织诱导率。
213　H2 O2代谢的生物化学基础
在本试验的诱导过程中 , SOD、POD、CAT、APX等 4种抗氧化酶活力与内源 H2O2水平变化关系
见表 3。
由表 3可以看出诱导 0～25 d, SOD活性与 H2O2含量变化趋势基本相同 , 25～32 d, SOD活性下
降 , 但 H2 O2上升 , 可能与 POD、CAT活性急剧下降 , 减少了底物 (H2 O2 ) 消耗有关。通过求偏相关
系数的方法比较 4种酶对 H2 02水平影响的相对重要性。SOD、POD、CAT、APX活性与 H2 O2水平的偏
相关系数分别为 01606、 - 01682、01740和 01769, SOD活性和 POD活性分别与 H2 O2水平呈正、负相
关 , 符合这两种酶的主要催化功能。CAT和 APX以 H2 O2为底物 , 但它们的偏相关系数均为正值 , 与
CAT、APX的主要催化功能相反 , 说明在愈伤组织诱导期间 CAT、APX活性对 H2 O2水平的效应很小。
为避免 CAT、APX活性数据对其他酶与 H2 O2水平关系统计分析的干扰 , 首先淘汰偏相关系数较大的
APX活性数据 , 对剩余 4组数据进行分析 , 得 CAT活性与 H2 O2水平的偏相关系数为 01618, 仍呈正
相关 , 再淘汰 CAT活性数据 , 就 SOD活性、POD活性分别与 H2 O2水平求偏相关系数 , 分别得 01674
和 - 01189, SOD活力与 H2 O2水平偏相关系数大于临界值 ( r0101 = 01662) , 即诱导期间培养物 SOD活
性与 H2O2水平的相关性达极显著水平 , POD活性与 H2O2水平则相关不显著。
表 3　诱导期间培养物 H2O 2 含量变化与 SOD、POD、CAT和 APX活性的关系
Table 3　Correla tion s between H2O 2 con ten t and SOD, POD, CAT, APX activ ity in cultures dur ing induction per iod
诱导时间 / d
Inducing time
H2O2
/ (μmol· g - 1 FW )
超氧化物歧化酶
/ (U·h - 1 ·g - 1 FW )
SOD
过氧化物酶
/ (U·m in - 1 ·g - 1 FW )
POD
过氧化氢酶
/ (μmol·m in - 1 ·
g - 1 FW ) CAT
抗坏血酸酶
/ (△A260·m in - 1 ·
g - 1 FW ) APX
0 14210 ±3112 dD 46124 ±0195 eE 617 ±0158 eE 38101 ±3134 eE 3117 ±0108 eD
4 7513 ±1120 eE 38118 ±0198 eE 1711 ±0142 bB 105196 ±9196 dD 4144 ±0118 dD
11 36212 ±9162 cC 101106 ±4170 dD 1513 ±1134 cC 121158 ±8154 cC 10188 ±0197 bBC
18 61214 ±11104 bB 207104 ±5161 bB 1218 ±1106 dD 40166 ±4112 eE 13113 ±0197 aA
25 61910 ±21106 bB 229170 ±9183 aA 2516 ±1122 aA 235173 ±9146 aA 9135 ±0118 cC
32 83913 ±26151 aA 116106 ±4196 cC 1415 ±0152 cC 152109 ±10170 bB 11193 ±0150 bAB
　　注 : 数据按邓肯氏新复极差测验 , 不同大写和小写字母分别表示α= 0101和α= 0105水平下差异显著性。
　　Note: Data were analyzed by Duncanpismultip le new range test and the different cap ital and small letters indicate significant differences atα=
0101 andα= 0105 levels, respectively.
3　讨论
DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式 , 在生物的细胞分化和生长发育中起着重要的调节作用。
目前植物体细胞胚发生与细胞 DNA甲基化程度关系的研究较少。Okkels (1988) 和 Heman (1991)
指出体细胞去甲基化处理可获得胚性。Hao和 Deng (2002) 对纽荷尔脐橙 (Citrus sinensis) 研究发
现 , 具有体细胞胚发生能力的愈伤组织的甲基化水平较失去体细胞胚发生能力的低。崔凯荣和戴若兰
(2000) 认为 , 细胞 DNA甲基化程度降低 , 胚性相关基因表达 , 胚性细胞形成 , 体细胞胚发生并进
一步发育。本试验发现在胚性愈伤组织的形成过程中 , 培养物 DNA甲基化程度单边下行 , 即去甲基
化程度持续升高 , 显然 , 蝴蝶兰胚性愈伤组织的形成过程是一个减少遗传修饰 , 消除基因沉默的过
程。
相对超氧负离子和羟自由基相对含量指标 , 胚性愈伤组织诱导期间 H2 O2水平与 DNA甲基化程度
明显相关。总的说来内源 H2 O2水平与 DNA甲基化程度变化趋势基本相反 , 达到极显著负相关 , 但在
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接种诱导的前 4天 H2O2含量稍微下降 , 即与 DNA甲基化程度变化趋势相同。禹艳红等 (2005) 用常
规方法诱导烟草愈伤组织期间内源 H2 O2水平也是前期下降而后平稳上升。接种初期的 H2 O2水平下降
可能与切割外植体造成机械损伤有关。降低诱导培养基中 62BA浓度 , 添加一定浓度的外源 H2O2可提
高愈伤组织诱导率 , 说明 H2 O2可替代部分外源生长调节物质的作用 , 在诱导培养基添加 H2 O2淬灭剂
DMTU降低了愈伤组织诱导率 , 推测 H2 O2是诱导蝴蝶兰胚性愈伤组织的信号分子之一。
关于植物愈伤组织诱导期间培养物 H2 O2积累的代谢机制研究并不多。田敏等 (2004) 发现草莓
愈伤组织 SOD活性变化与 H2 O2含量变化基本一致。本试验中诱导的 0～25 d培养物 SOD活性与 H2 O2
含量变化趋势也基本一致。Cui等 (1999) 检测表明继代愈伤组织形成胚性细胞时伴随 H2 O2的含量的
增高 , 用 SOD抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸钠 (DDC) 抑制了体细胞胚发生的频率 , CAT的抑制剂
氨基三唑 (AT) 则不呈抑制效应 , 说明 SOD在诱导胚性愈伤组织中起关键作用。本试验发现 , 整个
诱导期间培养物 H2 O2水平与 SOD 酶活性呈极显著正相关 , 与 POD 酶活性呈不显著负相关 , CAT、
APX活性与 H2O2水平呈正相关 , 即 CAT、APX活性的提高并不能导致培养物 H2 O2水平的下降 , 这是
由于 SOD和 POD活性 (尤其是前者 ) 在决定 H2 O2水平起主导作用 , CAT、APX酶的作用极小以致无
法显现。但 CAT与 APX酶分解 H2 O2的作用是客观存在的 , 诱导期间 H2 O2水平提高伴随 CAT、APX
酶活性提高 , 这两种酶在抑制胞内 H2 O2过度积累是否起积极作用仍不得而知。
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