全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(7)：959—966
Acta Horticulturae Sinica
发根农杆菌介导山定子遗传转化及发根再生植株
武 姣，孔 瑾，王 忆，韩振海，许雪峰
(中国农业大学果树逆境生理与分子生物学实验室，北京 100094)
摘 要：为了提高山定子的生根能力，用发根农杆菌转化山定子，诱导产生发根，并由发根诱导出再
生植株。通过对不同发根农杆菌株系、培养基 、共培养时间以及添加乙酰丁香酮 (AS)的研究，优化了发
根农杆菌转化体系。植株切段用添加 AS(100 I~mol·L )的菌液侵染30 min，共培养 3 d，以在无植物生
长调节剂的固体 1／4MS培养基上的发根诱导率最高，达到 88．89％。将发根根段置于 MS+BA 2．0 mg·L
+IBA 0．1 mg·L +GA 0．1 mg·L 再生培养基上，通过愈伤组织的诱导可得到再生植株，再生率达
3％ 。
关键词：山定子；发根农杆菌；转化；再生
中图分类号：S 661 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2008)07-0959-08
Agrobacterium rhizogenes-mediated Transformation and Hairy Root Regener-
ation of Malus baccata(L．)Borkh．
W U Jiao，KONG Jin，WANG Yi，HAN Zhen—hai，and XU Xue—feng
(Stress Physiology and Molecular Biology Laboratory of Fruit Trees，China Agricultural University，Beijing 1 00094，China)
Abstract：To enhance the rooting ability of Malus baccata(L．)Borkh．，hairy roots were induced from
cuttings of Malus baccata (L．) Borkh．explants CO—cultured with Agrobacterium rhizogenes(8 1 96 and
R1601)．Shoots were regenerated from hairy roots．Diferent strains of A．rhizogenes，medium，time of CO—cul—
tivation and usage of acetosyringone (AS)were researched．It indicated that the highest rooting rate
(88．89％)was obtained when explants were infected by the 8 196 bacterium suspension with AS (100
Ixmol·L )，CO．cultured for 3 days and cultured on 1／4MS medium．Regeneration system was established by
screening different plant growth regulator recombination．Adventitious shoots were regenerated from calli that
were induced from hairy roots in medium with 2．0 mg·L～ BA，0．1 mg·L～ IBA and 0．1 mg·L～ GA1．
Regeneration frequency was 3％ ．Rooting ability of regeneration shoots increased significantly． It is a very
promising method for M．baccata(L．)Borkh．transformation．
Key words：Malus baccata(L．)Borkh．；Agrobacterium rhizogenes；transformation；regeneration
发根是整株植物或植株某一器官、组织 (包括愈伤组织)单个细胞甚至原生质体受发根农杆菌的
侵染所产生的毛状根 (David et a1．，1988)。发根农杆菌所含 Ri质粒的T．DNA通过整合植物基因组，
稳定表达引起宿主植物发根的生长 (Chihon et a1．，1982)。发根具有生长迅速、遗传稳定、起源于
单个细胞等特点 (Maknight et a1．，1987)。因此用含改造型 Ri质粒的发根农杆菌侵染植物细胞可将
目的基因导入植物组织并再生转基因植物，为通过遗传工程改良植物抗性和品质提供有效途径 (Xu
& Jia，1997)
收稿日期：2008一Ol一10；修回日期：2008—05—26
基金项目：国家自然科学基金项 目 (30671441；30600416)
通讯作者Author for correspondence(E-mail：xuefengx@cau．edu．cn)
维普资讯 http://www.cqvip.com
园 艺 学 报 35卷
Chilton等 (1982)首次报道了发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)可以诱导植物产生发根
(hairy root)，发现其具有生长速度快、分化程度高等特点。Pawlicki—Julian等 (2002)用发根农杆菌
8196转化苹果砧木 Jork 9并获得了转基因植株。这些转化植物生根能力获得了极大的改善，一些木
本植物转化的再生植株移栽 田间后生根能力明显增强，表现出根系更为发达，抗旱性提高 (梁机
等，2002)。但是发根农杆菌对果树砧木转化的研究还很少，尤其是对中国特有主栽砧木的转化仍是
一 个空白。
山定子 [Malus bacata(L．)Borkh．]属于蔷薇科苹果属植物，在东北、华北等地广泛使用，是
苹果和花红的优良砧木 (曲泽州和孙云蔚，1990)，具有生长势强，抗腐烂病，耐寒力强等特性。但
其抗旱性较弱 (叶乃好 等，2004)，对盐碱地的适应性较差 (曲泽洲和孙云蔚，1990)，易发生缺铁
黄化，使其在国内的推广受限。因而对山定子进行遗传改良尤为重要。发根农杆菌 Ri质粒介导的基
因转移系统是植物基因工程中有效的基因转移方法，而有关发根农杆菌介导山定子遗传转化的研究还
未见报道。
本试验以山定子为对象，系统研究了影响发根农杆菌转化山定子诱导发根的诸多因素，找出适合
条件，建立了稳定、高效的山定子发根转化系统并获得了发根再生植株，为今后利用 Ri质粒作载体
转入外源目的基因奠定基础。
1 材料与方法
1．1 培养基
生长培养基：MS附加0．5 mg·L IBA和0．2 mg·L～6-BA。
增殖培养基：MS附加0．5 mg·L IBA和0．5 mg·L 6一BA。
生根培养基：MS附加 1．0 mg·L～IBA。
YEB培养基：5 g·L 牛肉浸膏，1 g·L 酵母提取物，5 g·L 蛋白胨，5 g·L 蔗糖，0．3
g·L～MgSO ·7H20，pH 7．2(固体培养基加琼脂 15 g·L )。
每个 100 mL三角瓶中加入50 mL培养基 (植物生长调节剂在灭菌前加入)，120 oC高压灭菌 20
mino
1．2 植物材料和细菌菌株
苹果砧木山定子试管苗来 自中国农业大学果树系组培室。将生长一个月的试管苗在增殖培养基上
进行培养，培养条件为光照 12 h·d～，光强 2 000 lx，温度 (25±1)℃。
将带GUS基因的发根农杆菌 8196和 R1601在含 100 mg·L 卡那霉素的液体 YEB培养基中培
养，120 r·min～，28℃培养至0D 为0．6～0．8，将菌体5 000 r·min 离心沉淀，重悬于2倍体积
的液体 MS培养基 (Murashige&Skoog，1962)中，用于转化。
1．3 山定子转化及发根的诱导
选取高度 1．5 cm的植株从基部切下，浸入重悬菌液中，轻摇浸泡30 min后取出，用滤纸吸干多
余菌液，在增殖培养基上于黑暗条件下共培养。之后转接到附加500 mg·L 头孢霉素的无植物生长
调节剂的固体培养基上诱导发根。一个月后统计发根诱导率。
发根诱导率 (％) =产生发根的外植体数／接种外植体总数 ×100。
针对共培养时间、诱导发根的培养基以及重悬菌液 3种因素对发根诱导率的影响进行了试验。共
培养时间设4个处理：1、3、5、7 d；诱导发根的培养基设4个处理：MS、1／2MS、1／4MS、1／8MS：
重悬菌液设2个处理：加入 100 p,mol·L 乙酰丁香酮 (AS)与不加AS。
维普资讯 http://www.cqvip.com
7期 武 姣等：发根农杆菌介导山定子遗传转化及发根再生植株 961
每处理接种外植体30个，每瓶接种 3个，重复3次。一个月后统计发根诱导率。
1．4 发根的组织化学检测
将生长半个月的发根切离母体，用无菌水洗数次，并用滤纸吸干，根据王关林和方宏筠 (1998)
的方法，将发根放入 X．glue溶液中，置于37℃下保温 12 h，观察显色反应，呈现蓝色的为GUS阳性
克隆。
1．5 植株再生
将生长一个月的发根从根尖部位切取约 1 em的根段，平放接种到3种不同配比的再生培养基上，
暗培养 1个月，之后在 12 h·d 光照下培养。接种数 100个，每半个月观察一次愈伤及再生芽分化
状况，统计出愈率、再生率及出芽率。
再生培养基配方：
(a)MS+BA 2．0 mg·L一 +IBA 0．1 mg·L一 +GA3 0．1 mg L一 ；
(b)MS+BA 2．0 mg·L一’+IBA 0．5 mg·L一 +GA3 0．3 mg L一 +TDZ 0．5 mg。L一 ；
(c)MS+BA 2．0 mg·L一 +IBA 1．0 mg·L一 +GA3 0．5 mg。L一 +TDZ 1．0 mg L一 。
出愈率 (％) =出愈伤的发根数／接种发根总数 ×100；
再生率 (％) =再生发根数／接种外植体总数 ×100；
出芽率 (％) =再生芽数／接种外植体总数 ×100。
1．6 再生植株生根
发根再生植株接种到生长培养基上培养一个半月到两个月，将长约2 em生长健壮的植株接种到
生根培养基上生根。每处理接种外植体30个，重复3次。一个月后统计生根率、每株外植体平均生
根量。
每株外植体平均生根量 =生根总数／生根的外植体总数；生根率 (％) ：生根的外植体数／接种
外植体总数 ×100。
2 结果与分析
2．1 发根的诱导
2．1．1 不同发根农杆菌株系对诱导发根的影响
发根农杆菌8196和 R1601侵染植株切段8～10 d后，从切口处产生黄绿色愈伤组织并陆续开始
生成发根。侵染 15 d后，从愈伤组织上长出许多发根，部分卷曲、向上生长 (图版，a、b)。这是由
于 rolB基因表达引起转基因植株形成大量发根，表现出生长快速、斜向生长的特点 (周跃钢和王三
根，1997)。
对照也能在切口处生根，但生根迟缓，约 30 d后才生根，生根率极低，约 1％，根纤细，少根
毛，只向下生长 (图版，a)。
两个菌株侵染的山定子外植体生根能力都很强。
将生长一个月的发根和对照根切成 1 em的根段，接种到无植物生长调节剂的固体 MS培养基上，
结果发现对照根段不能生长，培养半个月后褐化死亡 (图版，e)，而发根根段在无植物生长调节剂
的 MS固体培养基上能自主生长，表现出很强的生活力 (图版，d)。这与发根农杆菌 Ri质粒 T—DNA
上携带的roz基因和生长素合成酶基因有关。
发根的这种自主生长的特性与 Petit等 (1983)报道的结果一致。可以根据发根的这种特性对其
进行初步筛选。
维普资讯 http://www.cqvip.com
962 园 艺 学 报 35卷
2．1．2 培养基对诱导发根的影响
两个菌株侵染的山定子外植体生根能力都很
强 (表 1)，均可以作为发根农杆菌转化山定子的
良好株系。
这与Tepfer(1984)报道的发根农杆菌 8196
只能诱导易生根的苹果砧木产生发根，认为是因
为缺少Ⅱ 合成基因不同。但在本试验中，山定
子试管苗较难生根，发根农杆菌8196对其也表现
出很强的诱根能力。
表 1 培养基对发根诱导率的影响
Table 1 Efects of media and strains on hairy root inducing rate
培养基 垄堡型 垦竺 型!
Medium 8196 R1601
注：邓肯氏新复极差测验，P=0．05，不同字母表示差异显
著。
Note：Duncan’S test at P：0．05．Different letters indicate signifi—
cant difference．
在供试的4种培养基中，发根诱导率明显不同。1／2MS和 1／4MS诱导效果较好，二者之间没有
显著性差异，8196发根诱导率分别达到 80．6％和81．5％。MS和 1／8MS诱导效果较差，其发根诱导
率只有48．0％和50．0％。
2．1．3 共培养时间对诱导发根的影响
共培养天数对发根诱导效果有一定的影响。其中共培养 3 d，发根诱导效率最高，达到86．67％，
共培养 1、5和7 d诱导率分别为54．44％、61．11％和42．22％，三者之间没有显著性差异 (表2)。
表2 共培养时间对发根诱导率的影响
Table 2 Efects of go—cultivation time on hairy root inducing rate
注：邓肯氏新复极差测验，P=0．05，不同字母表示差异显著。
Note：Duncan’S test at P：0．05．Diferent letters indicate significant diference
2．1．4 添加 AS对诱导发根的影响
本试验中添加 100 txmol·L AS促进山定子发根，提高了转化效率。
在不同的共培养时间下，发根诱导率都有了不同程度的提高。尤其是在共培养 1 d的时候，添加
AS使转化效率提高59．81％，发根诱导率达到87．00％，而共培养 3 d和5 d时，加入 AS作用不显著
(表 3)。
表3 添加 AS对发根诱导率的影响
Table 3 Efects of AS on hairy root inducing rate
注 ：邓肯氏新复极差测验，P：O．05，不同字母表示差异显著。
Note：Duncan’S test at P：0．05．Diferent letters indicate significant difference
维普资讯 http://www.cqvip.com
7 期 963
2． 2 发根的鉴定
发根经 过 G U S 组 织 化学检测后呈 现蓝 色反应 (图版 ， e )， 说 明 G U S 基 因在发根 中得 到 了整合和
表达 。
本试验 中用 100 条发根进行 了 G U S 组 织化学检测 ， 其 中有 95 ％ 的发根呈 现 蓝 色反应 ， 由此 可 以
判断发根农杆 菌的转化根 系 。 对照根均没 有蓝 色反应 。
图版 说 明
：．二兰_咿 jI J —■一
对照
C oIIlrO l
R 1 601
k
d
f
l处 友 生 ； c ，
愈 伤再 生 植树
v roots indu ced
殳根 在 无 植 物 生 长 调 节 剂 的 固体 M S 培 养 基
： 再生 植 株生 根 。
组 靶觚舭
斛Ⅲ
根 ．。毙 Ⅲ
k 山
卜 酞 ?
维普资讯 http://www.cqvip.com
园 艺 学 报
2．3 植株再生
发根切段在再生培养基上培养半个月后，观察到发根开始形成愈伤组织。3种再生培养基上发根
的出愈率均达到 80％以上。
愈伤组织总体有3种类型，分别为淡黄色松软型 (图版，f)、浅绿色致密型 (图版，g)和红色
致密型 (图版，h)，各占22．1％、33．1％和44．8％。3种类型的愈伤组织培养 6个月后，只有浅绿
色致密型的愈伤分化出芽 (图版，i)。
组合试验表明植物生长调节剂水平对再生的影响很大 (表 4)，其中再生培养基 (a)的再生率
最高为3％，出芽率达到29％；(b)的再生率 1％，出芽率 8％；(C)的再生率与出芽率均为 0，只
在侧根处产生一个畸形的子叶形胚状体 (图版，J)，但是在继续培养过程中不能发育成正常芽而死
亡。
待再生芽伸长到 1 cm时，从愈伤组织上切下，接种到生长培养基中培养 (图版，k)。至此，再
生植株的形成需要 7个月。
表4 植物生长调节剂对发根再生植株的影响
Table 4 Efects of plant growth regulator on regeneration from hairy roots
注：邓肯氏新复极差测验，P=0．05，不同字母表示差异显著。
Note：Duncan’S test at P=0．05．Diferent letters indicate significant diference
2．4 再生植株的生根
8196和R1601共培养以及对照的再生植株在生根培养基上培养半个月后陆续生根，三者根的形
态不同，8196再生植株的根呈簇状，侧根较少；R1601再生植株的根较粗，侧根较多；对照生根较
少，侧根少 (图版，1)。
再生率及生根量统计结果表明，R1601和 8196发根再生植株生根率显著高于对照，分别达到
86．67％和98．89％，比对照提高了30％ ～40％；生根量也有提高，分别达到平均每株 5条和 18条主
根，尤其是8196再生植株生根量显著增加，比对照提高了5倍 (表5)。
van der Salm等 (1996)在用 r0 基因转化月季的研究中也曾发现，转化的外植体不定根形成数
量显著增加，生根对生长素的敏感性提高了 1O倍，转化植株移植后其生根能力提高了3倍。
表5 不同菌株共培养的再生植株生根
Table 5 Rooting of regenerated shots CO—cultured witll A．rhizogenes
注：邓肯氏新复极差测验，P=0．05，不同字母表示差异显著。
Note：Duncan’S test at P =0．05．Diferent letters indicate sign ificant difference
维普资讯 http://www.cqvip.com
7期 武 姣等：发根农杆菌介导山定子遗传转化及发根再生植株 965
3 讨论
本试验对影响发根农杆菌转化山定子的影响因素进行了优选，其中培养基、共培养时间以及乙酰
丁香酮对发根诱导的影响较大。
诱导发根的培养基选择 1／4MS，这是由于试管苗生根大多需要在低盐培养基中进行 (Pasqual&
Lopes，1991；李胜 等，2003)，盐浓度变化会引起培养基渗透压变化，从而影响试管苗对营养的吸
收 (Petit et a1．，1983)，而且盐浓度的变化也使植株体内氮浓度下降到一个适合生根的有利水平
(Predieri et a1．，1999)。
共培养时间的选择也很重要，这是因为农杆菌与外植体的共培养是整个转化过程中一个非常重要
的环节。一般来说共培养时间必须超过 16 h，这是由于农杆菌的附着、T-DNA的转移及整合都是在
共培养时期完成的 (谢秀祯 等，2006)。过早结束共培养，如共培养 l d，加入头孢霉素可以有效抑
制细菌的生长从而达到最佳除菌效果，但降低了转化效率，使发根诱导率降低到 54．44％。但是共培
养时间过长，如共培养7 d，由于农杆菌过量增殖，增加了除菌的难度，外植体被过量繁殖的农杆菌
侵蚀而受到毒害，组织有坏死现象，导致发根转化效率降低，诱导率只有42．22％。
乙酰丁香酮提高转化率是由于当发根农杆菌感染植物时，被损伤的植物细胞合成创伤信号分子，
在 virA基因产物介导下，使 区的其他基因活化，促使 T．DNA复制和 T一链蛋白复合体的形成，
T一链蛋白复合体通过细菌细胞膜的转运，进入植物细胞核，将 T．DNA整合进植物基因组，从而 T．
DNA中的r0Z基因表达产生发根 (Stachel et a1．，1986)。本试验中，在共培养 l、3、5、7 d时，添加
乙酰丁香酮均提高了转化效率，尤其是共培养 l d时，添加乙酰丁香酮显著的提高了转化率。而共培
养3、5、7 d时，添加乙酰丁香酮虽然也能提高转化率，但是作用不显著，可能是因为在较长时间的
共培养中，植株切口处产生足够的酚类物质，本身足以激活 区基因，过多的乙酰丁香酮不再起作
用。
本试验中发根再生植株难度较大，再生率较低，只有 3％。分析其原因可能是由于山定子自身基
因型所决定，也可能是试用植物生长调节剂水平不适合发根的再生。从3种再生培养基看，植物生长
调节剂水平较低的组合再生率相对较高，这与通常的再生规律不同，可能是因为 roz基因的导入增强
了根段对外源植物生长调节剂的敏感性，使得发根在较低的外源植物生长调节剂水平下再生植株，植
物生长调节剂水平高反而不利于再生，原因还需进一步探讨。
再生植株呈现矮化、节间缩短及黄化现象，与 Tep~r(1984)报道的关于发根再生植株节间缩
短、植株矮化等现象一致，推测其与发根农杆菌 Ri质粒上的roID和roIA基因有关，其机理还待进一
步研究。
再生植株生根试验显示，发根再生植株的生根能力及根系生长显著增强，推测原因是山定子导入
roIA、B、C基因增加了细胞对生长素的敏感性，使植株在较低的生长素水平下生根能力显著提高，
从而极大地提高了植株的根冠比，更有利于根系对水分和营养物质的吸收，这对山定子根系抗性研究
很有意 义。
References
Chihon M D，Tepfer D A，Petit A，David C，Casse—Delbart F．Temp6 J．1982．Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genonne of host
plant root cells．Nature．295：432—434．
David C，Petit A，Tempe J．1988．T-DNA len~h variability in mannopine hairy root：More than 50 kilobasepairs of pRiT．DNA can integrate in
plant cells．Plant Cell Report．7：92—95．
维普资讯 http://www.cqvip.com
园 艺 学 报 35卷
Liang Ji，Chen Xiao—yang，Lin Shan—zhi，Xie Xiang—ming．2002．Advance of studies on Agrobacterium rhizogenes Ri plasmid rol genes and their
applications for forest tree genetic improvement．Chinese Buletin of Botany，19(6)：650—658．(in Chinese)
梁 机，陈晓阳，林善枝，谢响明．2002．发根农杆菌 Ri质粒 r0z基因研究进展及在林木改良上的应用．植物学通报，19(6)：
650—658．
Li Sheng， Yang De—long，LiWei，Wu Ji-ling，Cao Zi-yi．2003．Advance of research on rootingin vitro of planttest—tube plantlet．Journal ofGan—
su Agricultural University，38 (4)：373—384．(in Chinese)
李 胜，杨德龙，李 唯，武季玲，曹孜义．2003．植物试管苗离体生根的研究进展．甘肃农业大学学报，38(4)：373—384．
Maknight T D，Lillis M T，Simpon R B．1987．Segregation of genes transferred to one plant cell from two separate Agrobacterium strains．Plant Mo-
lecular Biology，8 (6)：439—445．
Murashige T，Skog F．1962．Revised media for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture．Physiol Plant．15：473—479．
Pasqual M，Lopes P A．1991．Influence of diferent factors on in vitro rooting of pear(JPy丌 caleryana)rootstock．Pesquisa Agropecuaria Brasil-
eira，26 (3)：331—334．
Pawlicki-Jullian N，Sedira M，Welander M．2002．The use of Agrobacterium rhizogenes transformed roots to obtain transgenic shoots of the apple
rotstock Jork 9．Plant Cel，Tissue and Organ Culture，70(2)：163—171．
Petit A，David C，Dahl G，Eilis J G，Guyon P，Casse-Delbart F，Tempe J．1983．Further extension of the opine concept：Plasmids in Agrobacte—
rium rhizogenes cooperate for opine degradation．Molecular and General Genetics，190(2)：204—214．
Predieri S，Brizzi G，Gati E．1999．Efect of nitrogen supply on rooting of pear(JP，71 communis L．)cv．Conference microcuttings．Advances
in Horticultural Science，13 (2)：68—70．
Qu Ze-zhou，Sun Yun-wei．1990．The types of fruit trees．Beijing：China Agricultural Pres：19—20．(in Chinese)
曲泽洲，孙云蔚．1990．果树种类论．北京：农业出版社：19—20．
Stachel S E，Nemter E W，Zambryski P C．1986．A plant cell factor induce Agrobacterium tumefaciens vir gene expresion．Proceedings of the Na—
tional Academy of Sciences，83：379—383．
Tepfer D．1984．Transformation of several species of highe plants by Agrobacterium rhizogenes：Sexual transmission of the transformed genotype
and phenotype．Cell，37 (3)：959—967．
van der Salm T PM，van derTom C JG，Hanischten Cate ChH．van derKriekenW M．Dons J JM．1996．The effects 0f ex0gen0us auxin and
rol genes on rot formation in Rosa hybrida L． ‘Moneyway’．Plant Growth Regulation
， 19 (2)：123—131．
Wang Guan‘lin，Fang Hong-jun．1998．The principle and technology of plant gene engineering．Beijing：Science Press：552—556．(in Chinese)
王关林，方宏筠．1998．植物基因工程原理和技术．北京：科学出版社：552—556．
Xie Xiu—zhen，Lin Qiao—hui，Guo Cheng—shuan，Guo Yong．2006．Agrobacterium tumefaciens．mediated genetic transformation of rosele cel1．Jour．
nal of South China University of Technology ：Natural Science Edition
， 34(5)：43—48．(in Chinese)
谢秀祯，林俏慧，郭成栓，郭 勇．2006．根癌农杆菌介导的玫瑰茄细胞遗传转化．华南理工大学学报：自然科学版，34(5)：
43—48．
Xu Z Q，Jia J F．1997．Enhancement by osmotic treatment of hairy root transformation of Alfalfa suspension cuhures．and chrosnosomal variati0n
in the transformed tissue．Australian Journal of Plant Physiology，24：345—35 1．
Ye Nai-hao，Zhai Heng，Du Zhong-jun，Xu Hong．2004．Evaluation of drought resistance of ten apple rotstocks．Journal of Fruit Science，2 1
(5)：395—398．(in Chinese)
叶乃好，翟 衡，杜中军，许 宏．2004．水分胁迫条件下10种苹果砧木抗旱性评价．果树学报，21(5)：395—398．
Zhou Yue。gang，Wang San-gen．1997．Review of studies on rol genes of Ri plasmids from Agrobacterium rhizogenes
． Hereditas，19(6)：45—
48．(in Chinese)
周跃钢，王三根．1997．发根农杆菌Ri质粒 r0z基因研究的综述．遗传，19(6)：45—48．
维普资讯 http://www.cqvip.com