全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (4) : 865 - 870
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 02 - 01; 修回日期 : 2007 - 04 - 17
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30160054) ; 吉林省教育厅项目 (吉教合字 00第 36号 )3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hncao@ybu1edu1cn)
桃花粉可育基因连锁的 RAPD 标记与 SCAR标记
的转化
王　成 1 , 曹后男 13 , 宗成文 1 , 赵成日 2 , 庄得凤 1 , 朴日子 1 , 赵　恺 1
(1 延边大学农学院 , 吉林龙井 133400; 2 歧阜大学应用生物科学部 , 日本歧阜 5011193)
摘 　要 : 桃品种以重阳红 (花粉不育 ) ×大久保 (花粉可育 ) 的 52株 F1代群体为试材 , 应用 RAPD
技术 , 结合集群分组分析法 (Bulked Segregate Analysis, BSA ) 构建花粉可育 /不育基因池 , 利用 180个
随机引物 , 筛选在花粉可育基因池中稳定扩增的一个 RAPD标记 OPW 032900。经过重复性验证和群体单
株验证 , 该标记仅在花粉可育个体 (重组型除去 ) 中出现 , 与桃花粉可育 /不育位点的连锁距离为 5180
cM。将该特异性片段回收、克隆、测序 , 并设计一对特异 SCAR引物 , 再对 F1代个体进行 PCR扩增 , 发
现该特异带的位点及重组型个体的数目与 RAPD扩增结果一致 , 片段大小为 906 bp, 命名为 SCW 032906,
表明 RAPD标记已成功转化为与桃花粉可育基因连锁的 SCAR标记。该序列已被 GenBank收录 , 登录号
为 DQ659676。
关键词 : RAPD标记 ; BSA; SCAR标记 ; 花粉可育基因
中图分类号 : S 66211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0420865206
Iden tif ica tion of RAPD M arker L inked to Pollen Fertility Gene and Conver2
sion to SCAR M arker in Peach
WANG Cheng1 , CAO Hou2nan13 , ZONG Cheng2wen1 , ZHAO Cheng2ri2 , ZHUANG De2feng1 , P IAO R i2zi1 ,
and ZHAO Kai1
(1A gricu ltura l College, Yanbian U niversity, Longjing, J ilin 133400, Ch ina; 2 Facu lty of A pplied B iolog ical Sciences, Gifu U ni2
versity, Gifu 5011193, Japan)
Abstract: In this study, a RAPD marker (OPW 032900) linked to pollen fertility gene was screened
from 180 RAPD arbitrary p rimers in 52 F1 individuals from the cross‘Chongyanghong’ בOkuba’, pollen
fertility / sterility pool was constructed respectively by using RAPD technique and BSA method. After repeating
tests and checking up individuals of population, thismarker could only be amp lified in the pollen fertility indi2
viduals ( excep t recombinants) , the linkage distance was 5180 cM with the pollen fertility / sterility locus. This
band was collected and sequenced to synthesize a pair of SCAR p rimer which was used to amp lify the individu2
als of the F1 p rogeny, the locus of the special band and the number of recombinantswere the same as the result
of RAPD amp lification, the size of this marker was 906 bp, which was designated as SCW 032906, indicating
the RAPD marker has been successfully converted into a SCAR marker which linked to pollen fertility gene in
peach. This sequence was adop ted by GenBank, the logging number was DQ659676.
Key words: RAPD marker; BSA; SCAR marker; Pollen fertility gene
桃的花粉育性是由一对单基因 Ps / ps控制 , 可育 ( Ps) 对不育 ( ps) 为完全显性 , 花粉不育的品
种和植株均属于隐性同质结合的基因型 (Connors, 1927; B lake, 1937)。
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桃的花粉育性性状是衡量果实产量的一个重要指标。生产中一部分桃品种 , 如晚黄金、重阳红、
深州蜜桃等 , 由于本身没有健全的花粉 , 栽培中必须配置授粉树 , 如果遇到花期阴雨、低温等不适于
传粉昆虫活动时常导致减产 (景士西和吴禄平 , 1996)。利用高信息量的分子标记技术 , 筛选与桃花
粉育性基因紧密连锁的分子标记 , 不仅可以及早判断、淘汰不符合经济性状要求的植株 , 也可缩短桃
的育种年限 , 为桃的果实产量提供保证。
目前 , 在苹果 ( Yang & Korban, 1996; 田义轲 等 , 2004)、桃 (杨英军 等 , 2000; Jun et al. ,
2002)、葡萄 (徐炎 等 , 2003) 等果树上 , 已经找到了很多与主要性状基因连锁的分子标记。其中
在桃花粉育性性状方面的研究中 , 根据拟南芥雄性不育序列标记设计的引物扩增出的两个片段 NNJ2I
(600 bp) 和 NNJ2I (900 bp) , 与桃的花粉不育性状之间的遗传距离为 0 cM ( Elisabeth et al. , 2004)
把桃的花粉育性基因 ( Ps / ps) 定位在第 6连锁群 , 与矮化基因 (Dw / dw ) 的距离最近 (俞明亮 等 ,
2006)。但关于桃花粉可育 /不育性状的 SCAR标记未见报道。
本试验利用 RAPD技术与 BSA法相结合 , 寻找与桃花粉育性基因连锁的 RAPD标记 , 再将其转
化为更稳定而有效的 SCAR标记 , 应用于桃的辅助选择育种中 , 旨在为今后及早期鉴定桃的花粉育性
性状提供新的理论基础。
1　材料与方法
111　材料
桃品种为重阳红 (花粉不育 ) 和大久保 (花粉可育 )。1998年 , 以重阳红为母本 , 大久保为
父本进行杂交 , 获得杂种 F1代 52株 , 其中花粉可育 23株 , 不育 29株。试材采自河北科技师范学
院。
112　基因组总 D NA的制备
采用改良的 CTAB法 (Cheng et al. , 1997) 提取基因组 DNA。经过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光
光度计检测样品的纯度及浓度 , 然后用 TE缓冲液稀释成 50 ng·μL - 1备用。
113　桃花粉育性基因池的构建
根据 BSA法原理 (M ichelmore, 1991) , 分别从 F1代的可育、不育个体 DNA样品中 , 随机选取 5
株 , 等量混合 , 构成花粉可育基因池和花粉不育基因池。
114　RAPD技术体系
反应体系及扩增程序采用 Cao (1999) 的方法。利用 DB80240233型 PCR仪进行扩增 , 并进行了
优化。最终确定总反应体系 25μL, 其中模板 DNA 40 ng, 10 ×PCR缓冲液 215μL, dNTP 150μmol·
L - 1 , MgCl2 210 mmol·L - 1 , Taq DNA聚合酶 1 U, 引物 20 pmol·L - 1 , 余下用 ddH2 O补充。
扩增程序为 94℃预变性 5 m in; 94℃变性 1 m in, 36℃退火 1 m in, 72℃延伸 5 m in, 40个循环 ;
72℃终延伸 5 m in。
扩增后的产物在 114%琼脂糖凝胶中 (含 015μg·L - 1 EB ) 电泳 , 制胶和电泳缓冲液为 015 ×
TBE (pH 810) , 在 3～5 V·cm - 1恒压下电泳 3～4 h, 用 GDS28000凝胶成像系统照像 , 进行 RAPD
分析。
115　特异片段的回收、克隆及 SCAR标记的转化
用 DNA凝胶回收试剂盒 ( Takara) 回收目的片段 , 经过与 T载体的连接、转化及质粒 DNA的
PCR鉴定后 , 送上海博亚公司进行 DNA测序。
利用软件 O ligo 610对特异性片段的测序结果进行分析 , 将设计的一对特异 SCAR引物送上海英
骏公司合成。
扩增体系为 25μL, 其中包括模板 DNA 10 ng, MgCl2 115 mmol·L - 1 , dNTP 150μmo·L - 1 , 上游
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　4期 王 　成等 : 桃花粉可育基因连锁的 RAPD标记与 SCAR标记的转化 　
引物 014μmo·L - 1 , 下游引物 014μmol·L - 1 , 10 ×PCR Buffer 215μL, Taq DNA聚合酶 1 U , ddH2 0
16117μL。
PCR扩增程序为 94℃ 5 m in; 94℃ 45 s, 68℃ 45 s, 72℃ 1 m in, 35个循环 ; 72℃ 5 m in。扩增后
的产物分析过程同上。
2　结果与分析
211　桃花粉育性基因池的 RAPD引物筛选及分析
从 180个随机引物中 , 筛选出在花粉可育基因池和不育基因池之间具有较高多态性 , 且扩增稳
定、带型清晰的引物 15个 , 经重复性验证后 , 只有引物 OPW 03在花粉可育 /不育基因池中稳定的扩
增出一条分子量大小为 900 bp的差异带。
如图 1所示 , 大久保和可育基因池可以稳定的扩增一条 900 bp特异带 , 而重阳红和不育基因池
无此带。由此推断 , RAPD标记 OPW 032900 bp与桃花粉可育基因可能存在一定的连锁关系。
图 1　引物 O PW 03在不同花粉育性植株基因池中和亲本的 PCR扩增结果
M: 200 bp DNA标记 ; 1、3、5、7、9: 可育植株基因池 ;
2、4、6、8、10: 不育植株基因池 ;
P1 : 大久保 ; P2 : 重阳红。
F ig. 1　The result of PCR am plif ica tion w ith pr im er O PW 03 in paren ts
and d ifferen t pollen ster ility pools
M: 200 bp DNA marker; 1, 3, 5, 7, 9: Fertility pool of different individuals;
2, 4, 6, 8, 10: Sterility pool of different individuals;
P1 : Okuba; P2 : Chongyanghong.
212　桃花粉可育 /不育性状的 RAPD标记
利用引物 OPW 03对 F1代 52株个体进行 PCR扩增 , 其部分结果如图 2所示。
从图 2可知 , RAPD标记 OPW 032900 bp在 F1代群体中发生了共分离。大久保扩增出一条 900
bp的特异性带 , 重阳红无此带 ; 23株花粉可育个体中 22株扩增出 900 bp的特异性带 , 1株无此
带 ; 29株花粉不育个体中 27株无 900 bp的特异性带 , 2株有此带 , 共有 3株发生了重组 , 重组率
为 5177%。
利用 JoinMap 310软件 , 调整 LOD = 310, REC < 014时 , 计算得出该标记与花粉可育基因的连
锁距离为 5180 cM , 连锁较为紧密。
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图 2　引物 O PW 03在分离群体中的 PCR扩增结果
M: 200 bp DNA标记 ; P1 : 大久保 ; P2 : 重阳红 ; 1～16: 可育个体 ;
17～32: 不育个体 ; 15, 28: 重组个体。
F ig. 2　The result of PCR am plif ica tion w ith pr im er O PW 03 in segrega te popula tion
M1 : 200 bp DNA marker; P1 : Okuba; P2 : Chongyanghong;
1 - 16: Fertility individuals; 17 - 32: Sterility individuals;
15, 28: Recombinant individuals.
213　特异片段的序列测定及 SCAR引物的设计
对该特异性片段进行回收、克隆、测序 , 其结果如图 3所示。从序列图的上下游找到了引物
OPW 03自身及其互补碱基序列的位置。除去接头部分序列后 , 所得特异片段长度为 906 bp, 与引物
OPW 03扩增产生的回收片段 (900 bp) 的大小结果相一致 , 且该序列已被 GenBank收录 , 登录号为
DQ659676。
图 3　特异性片段的测序结果
F ig. 3　Sequenc ing result of spec if ic fragm en t
根据测序结果 , 应用 O ligo 610软件进行分析 , 考虑到引物设计中 GC的含量 , 设计了一对 26 bp
的正反链 SCAR引物 , 序列如下。
正链引物 SCW 03: 5′L2GTCCGGAGTGTCAACTATATCTATGT23′L; 负链引物 SCW 03: 5′L2GTCCG2
GAGTGGGGCCTACAAGGGGTG23′L。
214　SCAR标记在 F1代群体中的验证
利用设计的 SCAR引物 ———SCW 03对 52株 F1代群体 ( 23株花粉可育 , 29株花粉不育 ) 进行
PCR扩增、验证。部分结果见图 4, 表明大久保及 23株花粉可育个体扩增出一条 906 bp的特异性带 ,
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重阳红及 29株花粉不育个体无此带 , 52株后代中 , 有 3株重组 , 且 3株重组个体与 RAPD 引物
OPW 03扩增产生的重组个体完全一致 , 说明此 RAPD标记已被成功转化为 SCAR标记 , 是与桃花粉
可育基因连锁的 SCAR标记 , 命名为 SCW 032906。
图 4　SCW 032906引物在分离群体中 PCR扩增结果
M: 200 bp DNA标记 ; P1 : 大久保 ; P2 : 重阳红 ; 1～16: 可育个体 ; 17～32: 不育个体 ; 15、28: 重组个体。
F ig. 4　The result of PCR am plif ica tion w ith pr im er SCW 032906 in separa te popula tion
M: 200 bp DNA marker; P1 : Okuba; P2 : Chongyanghong; 1 - 16: Fertility individuals;
17 - 32: Sterility individuals; 15, 28: Recombinant individuals.
3　讨论
我国桃的种质资源非常丰富 , 但在基础研究方面 , 如品种的选育、资源的开发和利用等与国外相
比还存在一定的差距。目前 , 在果树农艺性状基因分子标记的筛选和应用研究方面已取得了长足的发
展 , 将这些研究的成果充分应用到育种实践中 , 可大大缩短育种年限 , 提高育种效率 , 解决果树育种
过程中占地多、投资大的不足。
W arburton等 (1996) 利用 BSA法从桃与油桃杂交后代中筛选出与果肉硬质、离核、黄肉连锁的
RAPD标记 ; 姚春潮等 ( 2005 ) 也利用 BSA 法获得了与猕猴桃雄性基因连锁的 RAPD 标记 S10322
850。
本研究获得的与桃花粉可育基因连锁的 RAPD标记 ———OPW 032900, 经重复验证和 F1代群体验
证 , 只有 3株个体发生重组 , 重组率较低 (5177% ) , 符合分子标记辅助育种的要求 , 这也是目前首
次报道与桃花粉育性基因连锁 RAPD标记转化成功的 SCAR标记。
在利用特异引物 SCW 03扩增时 , 发现退火温度对扩增的效果有一定的影响。该特异引物的 Tm
值分别为 58℃和 69℃, 使用梯度 PCR仪摸索最适宜的退火温度 , 当退火温度在 60～67℃时 , 双亲及
F1代群体全部或大部分都能扩增出特异性片段 , 多态性消失 ; 当退火温度提高到 68℃时 , 在大久保、
花粉可育 (除重组型个体 ) 的 F1代群体中能稳定地扩增出一条 906 bp的特异带 , 而重阳红、花粉不
育的 F1代群体没有此带 ; 当退火温度高于 68℃时 , 双亲及 F1代群体中有部分特异性片段消失 , 甚至
完全没有条带。因此 , 最终确定退火温度为 68℃, 这与 Paran和 M ichelmore (1993) 研究的结果相
似 , 即将退火温度由 60℃提高到 67℃时 , 多态性消失的片段又得到正确扩增。至于出现 SCAR引物
扩增对退火温度很敏感的原因可能由于引物的设计问题 , 今后可以考虑在上、下游引物所测序列向内
延伸一部分 , 设计一对新的 SCAR引物 , 并优化反应体系中的各反应成分 , 以便于将获得的 SCAR标
记更简便、稳定的应用。
由于获得的连锁标记位于桃花粉育性基因的一侧 , 遗传距离大于 5 cM。今后的努力方向是寻找
与其连锁更紧密的分子标记 (如 AFLP、SSR等 ) , 共同定位花粉育性基因 , 最终实现早期对桃的花
粉育性性状快速、准确的鉴定 , 加速我国在桃花粉育性方面的选育进程。
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