全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 781 - 786
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 01 - 02; 修回日期 : 2008 - 05 - 12
基金项目 : 高校博士学科点专项科研基金项目 (B200523)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: nnzs@ njau1edu1cn)
钙调素对梨自花及异花授粉后花柱自发荧光变化的
影响
周建涛 1 , 姜雪婷 1 , 刘珠琴 1 , 张绍铃 13
(1南京农业大学园艺学院 , 南京 210095)
摘 　要 : 采用激光共聚焦显微镜研究了外源钙调素 (CaM ) 及其抗血清对 ‘丰水 ’梨自花 (不亲和 )
和异花 (亲和 ) 授粉后花柱自发荧光变化的影响。结果表明 : 授粉 12 h后 , CaM处理后异花授粉花柱荧光
值与未处理异花授粉花柱荧光值相比 , 花柱上部荧光值降低 , 下部升高 ; 而 CaM处理后自花授粉花柱自发
荧光值除距柱头 2 500～3 000μm外其余部分均高于未处理自花授粉花柱 ; CaM抗血清处理后异花授粉花
柱荧光值除距柱头 1 000～2 000μm外其余部分均高于未处理异花授粉花柱 ; CaM抗血清处理自花授粉花
柱自发荧光与未处理自花授粉花柱相比 , 分布规律发生改变 , 最高值位于距柱头 1 000～1 500μm处。授
粉 72 h后 CaM处理后异花授粉花柱荧光值高于未处理异花授粉花柱 , 最高值位于子房端 ; CaM处理后自
花授粉与未处理自花授粉花柱自发荧光值相比 , 分布规律发生改变 , 最高值位于距柱头 1 500～2 000μm
处 ; CaM抗血清处理后异花及自花授粉花柱自发荧光与未处理异花及自花授粉花柱相比较 , 分布规律均发
生了改变 , 最高值均位于 0～500μm处。证实了外源 CaM及其抗血清对自花、异花授粉的生理代谢过程均
有影响。
关键词 : 梨 ; 钙调素 ; 自交不亲和性 ; 自发荧光
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620781206
The Var ia tion of Style Auto2fluorescence after Ca lm odulin Trea tm en t on
Self2and Cross2pollina tion in Pyrus pyrifo lia Naka i
ZHOU J ian2tao1 , J IANG Xue2ting1 , L IU Zhu2qin1 , and ZHANG Shao2ling13
(1 College of Horticulture, N an jing A gricu ltura l U niversity, N an jing 210095, Ch ina)
Abstract: Confocal laser scanning m icroscopy (CLSM ) were used to investigate the role of exogenous
calmodulin (CaM ) and anti2CaM serum in pear‘Hosui’style auto2fluorescence characterization after self2
and cross2pollination for 12 h and 72 h. The results showed that the auto2fluorescence of cross2pollination top2
side style treated with CaM for 12 h reduced and the bottom increased, but the auto2fluorescence of self2polli2
nation style treated with CaM increased excep t 2 500 - 3 000μm behind stigma. Anti2CaM serum treated
cross2pollination style increased the whole auto2fluorescence excep t 1 000 - 2 000μm behind stigma and the
tip top of self2pollination after anti2CaM serum treatment moved to 1 000 - 1 500μm behind stigma. After pol2
lination 72 h, the style of cross2pollination treated with CaM increased its auto2fluorescence and the highest
value was at ovary. Self2pollination style treated with CaM changed the distributing discip linarian of auto2fluo2
rescence, its tip top were at 1 500 - 2 000μm behind stigma. The highest auto2fluorescence of self2and cross2
pollination treated with anti2CaM serum moved to 0 - 500μm behind stigma. This p rimary evdience showed
here confirmed that exogenous calmodulin and anti2CaM serum have effected on metablism of the self2 and
cross2pollination.
Key words: pear; calmodulin; self2incompatible; auto2fluorescence
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　　梨 ( Pyrus) 与其他配子体型自交不亲和植物一样 , 其不亲和反应是雌蕊与花粉相互识别、相互
作用结果的综合表现。虽然有关基于自交不亲和复等位基因的配子体自交不亲和性反应中花粉萌发和
花粉管伸长特性的研究有一些报道 ( Franklin2Tong et al. , 2003) , 但多限于在离体或半离体条件下的
研究成果 , 对活体花柱内花粉管生长及其代谢特性的研究较少 , 有关活体花柱的代谢特性研究更少。
据报道 , 花粉细胞外钙调素 ( calmodulin, CaM ) 对花粉萌发和花粉管伸长可能具有启动作用
(Ma & Sun, 1997) , 并控制花粉萌发、花粉管生长的速度及方向 ( Feijo et al. , 1995; Malho & Trewa2
vas, 1996; Pierson et al. , 1996; Taylor & Helper, 1997) , 一定浓度的胞外 CaM可以促进花粉管在花
柱内的伸长 , 而 CaM抗血清则抑制花粉的萌发和生长 (崔素娟 等 , 1998)。但是 , 有关 CaM在活体
自花、异花授粉生理代谢中作用的资料较少。
本试验中利用激光共聚焦显微镜研究了钙调素及其抗血清对自花、异花授粉后花柱自发荧光的影
响 , 为研究钙调素在植物自交不亲和性反应中的作用提供试验依据。
1　材料与方法
以南京农业大学江浦实验站的盛果期砂梨 ( Pyrus pyrifolia Nakai) 品种 ‘今村秋 ’ (S1 S6 ) 和
‘丰水 ’ (S3 S5 ) 为试材。采集开花前 1～2 d的花蕾 , 收集花药 , 用透明光面纸包裹 , 置于密闭的硅
胶瓶中常温干燥 1 d, 散粉后贮于 - 20 ℃冰箱中备用。采集开花前带花芽的 2年生枝条 , 置于光照培
养箱中 25 ℃条件下培养 , 选用花瓣即将展开的大花蕾进行人工授粉。异花授粉 : ‘丰水 ’ ב今村
秋 ’; 自花授粉 : ‘丰水 ’ ב丰水 ’。
参考崔素娟等 (1998) 的方法 , 花柱培养介质组成是 : 10%蔗糖 , 20%聚乙二醇 4000, 0101%
硼酸 , 0103%硝酸钙 , 溶解于 30 mmol·L - 1的 MES溶液 , pH为 615。‘今村秋 ’和 ‘丰水 ’花柱用
处理液 (10 - 7 mmol·L - 1钙调素及 1∶400钙调素抗血清 , 分别用上述培养介质稀释而成 ) 浸湿的棉球
覆盖柱头处理 15 m in后 , 进行人工授粉。花柱再置于 25 ℃下半活体培养 12 h及 72 h后 , 用镊子紧
挨子房端将其取下 , 立即置于 Leica激光共聚焦显微镜下观察 , 并通过计算机采集数据。将花柱从柱
头开始分段向子房端进行平行于柱头长轴方向的激光扫描 , 每段长度 500μm。激发波长为 488 nm。
以未授粉花柱为对照。
2　结果与分析
211　授粉 12 h后花柱自发荧光的比较
如图 1和图 2所示 , 柱头及花柱在没有进行授粉处理时 , 除柱头顶端自发荧光值较高 (200133)
外 , 其他部分的都很弱 (2167～24133)。异花授粉 12 h后 , 花柱自发荧光值 (图 2, a) 也表现为柱
头最高 , 子房端降低 ; 与对照相比 , 2 500～4 000μm处荧光值降低 ( 0～6) , 其余各部分均提高 ,
1 500～2 000μm处变化最大 , 由对照的 5133升高到 23100。自花授粉 12 h后 , 花柱自发荧光值 (图
2, d) 呈两端高中间低的分布 ; 与对照相比 , 柱头自发荧光值降低至 81100, 1 000～1 500μm处降
低至 12167, 0～1 000μm、1 500～3 000μm均提高约 1倍左右 , 3 000～3 500μm和 3 500～4 000
μm分别提高到 13167 和 38167。自花授粉柱头处自发荧光值 ( 81100 ) 显著低于异花授粉处理
(223167)。
与异花授粉后 12 h的花柱相比 , CaM处理后异花授粉花柱自发荧光值 (图 2, b) 的分布规律没
有明显变化 , 但柱头荧光值略降低至 213100, 0～2 000μm各处均显著降低 , 2 000～4 000μm各处
则显著升高 , 由处理前的 6100～13100升高到 14167～24100。CaM处理后自花授粉花柱自发荧光值
(图 2, e) 两端值高于中间值 , 最高值仍位于柱头区域 , 除 2 500～3 000μm外各部分的值均高于自
花授粉花柱 , 500～1 000μm由处理前的 18100升高至 86133。
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　6期 周建涛等 : 钙调素对梨自花及异花授粉后花柱自发荧光变化的影响 　
CaM抗血清处理后异花授粉花柱自发荧光值 (图 2, c) 的布也呈柱头高子房端低的趋势 , 1 000
～2 000μm处比异花授粉花柱低 , 其余部分均高于异花授粉花柱 , 0～500μm处由处理前的 73167升
高至 169167。CaM抗血清处理后自花授粉花柱自发荧光值 (图 2, f) 的分布规律发生明显变化 , 最
高值 (139100) 位于花柱中部 1 000～1 500μm区域 , 与自花授粉花柱相比除 3 500～4 000μm区域
略有降低外 , 其余各部分均有所提高 , 最高由处理前的 12167升高至 139100 (1 000～1 500μm)。
图 1　授粉 12 h和 72 h后花柱荧光强度值
F ig. 1　Fluorescence va lue of style after be ing pollina ted 12 h and 72 h
212　授粉 72 h后花柱自发荧光的比较
异花授粉及自花授粉后 72 h的花柱自发荧光值的分布规律如图 1、图 2的 A和 D所示 , 最高值
都位于柱头 , 异花授粉花柱自发荧光的最低值 (15167) 位于 3 000～3 500μm处 , 而自花授粉的最
低值 (33133) 则位于 1 500～2 000μm处。对照 (未授粉花柱 ) 72 h时自发荧光值最低值 (13133)
位于距柱头 2 500～3 000μm处 , 最高值 (238167) 位于柱头处 (图 1; 图 2, CK)。与异花授粉花
柱自发荧光值从柱头到花柱中部区域荧光值递减不同的是 , 自花授粉花柱自发荧光值变化较为剧烈 ,
在 500～1 000μm , 1 000～1 500μm之间急剧下降 , 而后在 1 500～2 000μm , 2 000～2 500μm之间
又急剧升高。
CaM处理后进行异花授粉的处理 , 在 72 h后花柱自发荧光值 (图 2, B ) 与异花授粉自发荧光值
相比 , 除柱头略有降低外其余各部分荧光值均有显著提高 ; 分布也呈两端高中间低的规律 , 但最高值
位于子房最末端。CaM处理后自花授粉 72 h后花柱自发荧光值 (图 2, E) 的最高值 (211167) 位于
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1 500～2 000μm处 , 最低值 (10167) 则位于距柱头 0～500μm区域内 , 这与自花授粉花柱自发荧
光值的分布规律相反 , 柱头荧光值 (38133) 约为自花授粉柱头荧光值 (234100) 的 1 /6。
CaM抗血清处理后异花授粉 72 h花柱自发荧光值 (图 2, C) 除在 2 500～3 000μm区域内略高
于异花授粉花自发荧光值外 , 其余各部分均降低 , 柱头处荧光值 (73100) 仅为异花授粉 ( 254100)
的 1 /3; 其分布规律与异花授粉花柱荧光值不同 , 最高值位于距柱头 0～500μm区域内 , 略高于柱
头 , 其余各部分荧光值均显著降低。CaM抗血清处理的自花授粉 72 h后花柱自发荧光值 (图 2, F)
的最高值位于 0～500μm处 , 略高于柱头 , 最低值位于子房末端 , 柱头处荧光值 (95100) 约为自花
授粉 (241167) 的 1 /2, 分布规律与 CaM抗血清处理后异花授粉荧光值相似。
图 2　授粉 12 h ( ck, a～f) 和 72 h ( CK, A～F) 后花柱自发荧光
ck, CK: 未授粉 ; a, A: 异花授粉 ; b, B: CaM处理后异花授粉 ; c, C: CaM抗血清处理后异花授粉。
d, D: 自花授粉 ; e, E: CaM处理后自花授粉 ; f, F: CaM抗血清处理后自花授粉。
F ig. 2　Auto2fluorescence of style after pollina ted for 12 h ( ck, a - f) and 72 h ( CK, A - F)
ck, CK: Unpollinated; a, A: Cross2pollination; b, B: Cross2pollination after CaM treatment;
c, C: Cross2pollination after anti2CaM serum treatment; d, D: Self2pollination; e, E: Self2pollination after CaM treatment;
f, F: Self2pollination after anti2CaM serum treatment.
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　6期 周建涛等 : 钙调素对梨自花及异花授粉后花柱自发荧光变化的影响 　
213　授粉不同时间后花柱自发荧光的差异
植物自交不亲和性反应是一个动态的过程 , 不同处理后进行自花、异花授粉的花柱自发荧光也随
着时间的变化而发生变化。72 h未授粉花柱各部分的荧光值显著高于 12 h时的荧光值 , 0～1 500μm
及子房端荧光值升高最为明显。异花授粉、CaM处理后异花授粉及自花授粉花柱自发荧光随时间变
化的趋势与对照相似 , 异花授粉花柱自发荧光值升高明显的区域为 0～2 500μm及 3 500～4 000μm
处 ; CaM处理后异花授粉自发荧光值除柱头外都有较明显的升高 ; 而自花授粉自发荧光值明显升高
区域为柱头、0～1 000μm、2 000～3 500μm及 4 000～4 500μm处 , 1 500～2 000μm和 3 500～
4 000μm处荧光值降低。
CaM抗血清处理后异花授粉柱头及 0～500μm处荧光值随着时间变化明显下降 , 3 000～3 500
μm处略有下降 , 其他部分荧光值升高。CaM处理自花授粉花柱荧光值的分布规律随着时间的变化发
生了明显的变化 , 由 12 h的两端高中间低变为 72 h时最高值位于花柱中部、柱头端荧光值低于子房
端。CaM抗血清处理自花授粉 12 h与 72 h的变化规律相似 , 但是荧光最大值由 1 000～1 500μm处
移至 0～500μm处。
3　讨论
生物体自发荧光检测是研究生物体内代谢的一种辅助手段 , 如利用检测的自发荧光对其细胞壁组
分进行研究 , 贺新强等 (1999) 利用细胞壁由于酚类物质的存在在紫外光激发下产生蓝色自发荧光
的特性研究了毛竹细胞壁的成分。本实验室徐国华等 (2003) 研究指出 , 自花授粉及异花授粉荧光
的差异与活体花柱内自花花粉管有关 , 自花授粉柱头自发荧光值低于异花授粉柱头自发荧光 , 这与本
试验中 12、72 h时未处理异花及自花授粉后花柱的自发荧光的变化相同。在本试验中部分处理授粉
72 h后花柱子房端自发荧光显著高于 12 h, 认为与花粉管随时间生长到子房端有关 (陈迪新 等 ,
2004)。
通常认为钙调素 (CaM ) 是一种胞内 Ca2 +重要的多功能受体 , 是细胞内信号转导途径中的重要
信号分子。近年来 , 人们发现它还存在于细胞外 , 并具有诸如促进细胞增殖、原生质体壁再生等生物
学功能 (孙大业 等 , 1995)。Polito等 (1983) 最先发现外源钙调素及钙调素抑制剂可以影响花粉萌
发。在此基础上尚忠林等 (2001) 曾用大分子的钙调素拮抗剂与抗体进行研究 , 发现外源钙调素可
以促进花粉离体生长 , 而钙调素抑制剂则抑制其萌发及生长。崔素娟等 ( 1998) 在半体内试验中观
察到用 CaM抗血清处理柱头表面可以显著抑制花粉在柱头上的萌发 , 说明了花粉在柱头上萌发过程
中 , 除花粉细胞外 , 花柱细胞外 CaM对花粉在柱头上的萌发也同样有促进作用。同样 , 在显微注射
纯化 CaM和 CaM抗血清试验中也观察到提高花柱引导组织中细胞外 CaM活性可以促进花粉管在花柱
引导组织中的伸长 , 而抑制其细胞外 CaM活性则抑制花粉管在其中的伸长 , 表明花柱引导组织细胞
外 CaM可能对花粉管在其中的生长也具有促进作用。
本试验中观察到 12及 72 h时 CaM处理使异花授粉花柱子房端及自花授粉花柱自发荧光值升高 ,
认为这是由于 CaM处理促进花粉管在花柱中生长造成的 ; CaM抗血清处理自花授粉以及 72 h时 CaM
抗血清处理自花、异花授粉花柱自发荧光值的分布规律改变 , 柱头处荧光值明显降低 , 这与前人对于
CaM抗血清抑制花粉管在柱头上萌发的研究相符。但 12 h时 CaM抗血清处理异花授粉荧光值除了在
中部降低外其余部分的荧光值均升高这一现象与 CaM抗血清处理抑制花粉管生长的结论不符 , 72 h
时 CaM处理异花授粉花柱自发荧光值变化规律发生改变 , 虽然柱头处荧光值显著下降 , 但子房端荧
光值明显升高。产生上述现象的原因还正在研究中。
本试验在前人基础上研究了胞外 CaM及其抗血清处理对自花及异花授粉花柱自发荧光分布规律
的显著影响 , 结果表明这是由于细胞外 CaM及其抗血清处理对花粉在柱头上萌发的促进及抑制作用
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造成的 , 但由于花粉萌发后本身自发荧光很弱 , 无法观察到花粉在花柱中的生长情况 , 也无法得出花
柱自发荧光与花粉生长之间准确的相关关系。在本试验中 , 由于花柱在 488 nm激发光下 , 产生的荧
光为绿色 , 与先前研究中由于酚酸引起的蓝色自发荧光不同 , 目前还不清楚究竟是由何种物质引起
的。同时 , 自交不亲和反应是一种复杂的花粉与柱头之间识别的过程 , 在这一过程中 CaM起到的具
体作用 , 对于花柱的自发荧光为何有这样的影响 , 都有待于进一步研究。
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