全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (5) : 655 - 660
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 01 - 26; 修回日期 : 2008 - 04 - 17
基金项目 : 西南科技大学与日本青旗株式会社合作项目 (052046)3 E2mail: liurendao@ swust1edu1cn
草莓和蓝莓果实花青素提取及定量方法的比较
刘仁道 13 , 张　猛 1 , 李新贤 2
(1 西南科技大学生命科学与工程学院 , 四川绵阳 621010; 2 日本青旗株式会社果品加工研究中心 , 日本广岛
72922392)
摘 　要 : 本研究旨在比较果实花青素提取液的提取效果以及花青素分析方法的准确性。用丙酮 —水 —
甲酸 (A)、乙腈 —乙酸 (B)、乙醇 —水 —乙酸 (C)、甲醇 —水 —乙酸 (D ) 以及含有盐酸的甲醇 ( E)
等 5种提取液分别提取了草莓和蓝莓果实中的花青素 , 用比色法和液相色谱法分别测定了花青素的含量。
试验结果表明 : 由于提取液中有机溶剂和酸种类的不同 , 提取效果差异甚大。提取草莓花青素时 , 以 D的
提取效果最好 , 其次是 E、C和 A, B的提取量最低 , 还不到 D的 1 /3。提取蓝莓花青素得到的结果与草莓
相似。用比色法分析 , D、E、C提取液提取的草莓和蓝莓果实的花青素含量明显低于液相色谱分析的结
果 , 但 B提取液比液相色谱结果高 2倍以上 , A提取液提取蓝莓时比色法与液相色谱法的结果相近 , 而提
取草莓时比色法比液相色谱结果高出约 50%。建议花青素的定量方法应尽量使用液相色谱法 , 对同一种果
实 , 尤其是以低沸点醇类作提取液时可以用比色法。
关键词 : 草莓 ; 蓝莓 ; 花青素 ; 分析方法 ; 提取液
中图分类号 : S 66814; S 66312　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520655206
Com par ison s of Extraction Solven ts and Quan tita tive2m ethods for Ana lysis of
An thocyan in s in Strawberry and Blueberry Fru its
L IU Ren2dao13 , ZHANG Meng1 , and L I Xin2xian2
(1 School of L ife Science and Engineering, Sou thw est U niversity of Science and Technology, M ianyang, S ichuan 621010, China;
2 Fruit Processing Research Cen ter, A ohata Corpora tion, H irosh im a 72922392, Japan)
Abstract: In this study, the extraction efficiency of different types of solvent and p recision of quantita2
tive2methods for analysis of anthocyanins in fruits were compared. Five solvents, acetone ∶water ∶form ic acid
(A) , acetonitrile ∶acetic acid (B ) , ethanol ∶water ∶acetic acid (C) , methanol ∶water ∶acetic acid (D ) ,
and methanol ∶HCl ( E) were used to extract anthocyanins in strawberry and blueberry fruits and the anthocya2
nin content in the extracts was determ ined with colorimetry and HPLC. The results showed that the extraction
efficiency varied among the solvents with different organic2solvent and acid2type. In strawberries, the extrac2
tion efficiency of anthocyanin with D was the best, followed by E, C, and A. However, B was the worst to ex2
tract the anthocyanin, with its value being less than 1 /3 that obtained using the extract containing D. A sim i2
lar tendency was found in blueberries. The anthocyanin contents determ ined by colorimetry with extracts con2
taining D, E, and C in both fruits were respectively lower than that shown by HPLC. But the value was ob2
tained by colorimetry with extracts containing B was 22fold to that by HPLC. In blueberries, obvious differ2
ences were not found in the results obtained using the extract containing A emp loying both methods, although
in strawberries the anthocyanin content determ ined using the spectrophotometric method was higher by about
50% than with those obtained using HPLC. These results suggest that the HPLC method should be utilized to
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
determ ine the anthocyanin content and that the colorimetry could be used to compare samp les from the same
kind of fruit, especially, using a low boiling2point alcohol as a solvent.
Key words: strawberry; blueberry; anthocyanin; determ ination method; extraction solvent
花青素是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一 , 不仅使花卉、水果和蔬菜呈现美丽的颜色 , 还赋
予更高的功能性 , 因此日益受到重视。
近年 , 有关花青素的研究报道很多 , 主要包括花青素的提取、分离、鉴定和分子生物学水平的合
成机理以及对人体的功能、消化吸收和体内代谢研究等方面。
关于花青素的定量研究 , 传统的提取方法是在低沸点的醇类中添加盐酸。但是 , García2V iguera
等 (1998) 研究认为 : 添加盐酸可能引起花青素的分解 , 而且丙酮的提取效果显著高于乙醇。因此 ,
现在主要使用的提取液是丙酮添加弱有机酸 ( Zheng et al. , 2003)。
关于花青素的定量方法 , W rolstad (1976) 确立了不同 pH值的缓冲液比色法后 , 一直到现在仍
然作为测定花青素总量的最简便的方法得到广泛的应用。
本文作者在花青素的研究工作中注意到不同提取溶剂或配比的提取效果有差异。因此 , 使用最近
常用的几种提取液提取草莓和蓝莓果实中的花青素 , 并用不同 pH值的缓冲液比色法和高效液相色谱
分析法 (HPLC) 比较其提取效果 , 以期选择最佳的提取和分析方法。
1　材料与方法
111　材料
冷冻草莓 ‘Camarosa’和 ‘A lbion’从美国 Del Mar Food Products Corp. 购入 ; ‘W ellp ict’从美
国 W ellp ict Inc. 购入 ; ‘丰香 ’草莓 ( Toyonoka) 取于四川省绵阳市涪城区丰谷镇栽培的成熟果实 ;
冷冻矮丛蓝莓从加拿大 Oxford Frozen Foods L im ited购入。
112　提取液的配制
A , 丙酮 ∶水 ∶甲酸 = 80∶20∶012 ( Zheng et al. , 2003)。
B , 乙腈 ∶乙酸 = 96∶4 ( Prior et al. , 1998, 2001)。
C, 乙醇 ∶水 ∶乙酸 = 80∶20∶1 (Montefiori et al. , 2005)。
D , 甲醇 ∶水 ∶乙酸 = 85∶15∶015 (W u & Prior, 2005)。
E, 含有 011% 盐酸的甲醇 ( Zanatta et al. , 2005)。
以上 5种提取液均采用分析纯有机溶剂以及高纯水按照体积比配制。
113　花青素的提取
试验 1: 分别取 ‘Camarosa’、‘A lbion’和 ‘W ellp ict’草莓材料 100 g左右 , 置于家用打浆机中
粉碎 2 m in, 再用高速匀浆机 15 000 r·m in - 1 , 2 m in破碎细胞结构。称取 1 g破碎物于离心管中 , 加
入提取液 14 mL, 振荡 20 m in后离心 ( ×20 000 g, 10 m in) , 上清液经 0145μm滤膜过滤后用于花青
素的测定。用上述 5种提取液中使用频度较高的 A和 E分别做提取处理 , 每个处理 3次重复。
试验 2: 分别取 ‘丰香 ’草莓和矮丛蓝莓材料 100 g左右 , 按试验 1的步骤提取过滤后 , 用上述
5种提取液分别做提取处理 , 每个处理 3次重复。
114　比色法测定花青素总含量
取制备的样品 1 mL, 加入 pH 415的 014 mol·L - 1醋酸钠缓冲液或 pH 110的 0125 mol·L - 1氯化
钾缓冲液 4 mL, 摇匀 , 转入光路长 1 cm的比色皿后 , 用岛津 UV2m ini 1240紫外 —可见光分光光度计
分别以 520 nm和 700 nm为吸收波长测定其吸光度。
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　5期 刘仁道等 : 草莓和蓝莓果实花青素提取及定量方法的比较 　
　　提取液的花青素浓度按下式计算 :
花青素浓度 (mg·L - 1 ) = A /εL ×103 ×MW ×稀释倍数。式中 A 为最终吸光度 , A =
(A520 nm, pH 110 - A700 nm, pH 110 ) - (A520 nm, pH 415 - A700 nm, pH 415 ) , MW 为摩尔质量 , ε为摩尔吸光系数 , L为
比色皿光路长 ( cm )。
草莓以主要花青素天竺葵 - 3 - 葡萄糖苷 (pelargonidin232glucoside) 的摩尔吸收系数计算 , 蓝莓
以主要花青素之一的矢车菊定 - 3 -葡萄糖苷 ( cyanidin232glucoside) 的摩尔吸收系数计算。
最终以 1 g试样含有花青素的量 (mg) 来表示 , 用 SSR法进行差异显著性分析。
115　液相色谱法测定花青素总含量
取各种提取液制备的样品 , 用液相色谱仪分离定量花青素。进样量 200μL, 色谱柱为 Inertsil
ODS23 (416 mm ×250 mm, GL Science) , 流动相流速为 1 mL·m in - 1 , 温度恒定在 35 ℃。A、B泵的
梯度为 : B泵在 0 m in时为 0, 55 m in时升至 55% , 59 m in时升至 75%保持 4 m in, 到 65 m in时降至
0并保持 5 m in。二极管阵列检测器的波长设定在 250～600 nm之间 , 最终计算使用 520 nm的色谱图。
草莓的花青素总量以标样天竺葵 - 3 -葡萄糖苷的相应面积计算浓度 , 蓝莓花青素总量以矢车菊定 -
3 -葡萄糖苷的相应面积计算浓度。以 1 g试样含有花青素的量 (mg) 来表示 , 用 SSR法进行差异显
著性分析。
2　结果与分析
211　标样花青素的摩尔吸收系数
用含有 011% 盐酸的甲醇溶解标样花青素天竺葵 - 3 -葡萄糖苷和矢车菊定 - 3 -葡萄糖苷 , 再用
各提取液稀释后 , 测定其摩尔吸收系数。提取液之间 (表 1) 以及同 Giusti等 ( 1999) 和 W rolstad
(1976) 报道的数值之间存在着一定的差异。
天竺葵 - 3 -葡萄糖苷与矢车菊定 - 3 -葡萄糖苷相比 , 虽然各提取液的组成不同 , 但前者的摩尔
吸收系数低于后者。
表 1　花青素天竺葵 - 3 - 葡萄糖苷和矢车菊定 - 3 - 葡萄糖苷的摩尔吸收系数 ( 520 nm )
Table 1　M olar absorptiv ity of pelargon id in232glucoside and cyan id in232glucoside (520 nm)
提取液
Extract
天竺葵 - 3 - 葡萄糖苷
Pelargonidin232gucoside 矢车菊定 - 3 - 葡萄糖苷Cyanidin232glucoside
A,丙酮∶水∶甲酸 = 80∶20∶012 Acetone∶water∶form ic acid = 80∶20∶012 22 980 30 130
B,乙腈∶乙酸 = 96∶4 Acetonitrile∶acetic acid = 96∶4 26 510 32 210
C,乙醇∶水∶乙酸 = 80∶20∶1 Ethanol∶water∶acetic acid = 80∶20∶1 23 010 29 870
D,甲醇∶水∶乙酸 = 85∶15∶015 Methanol∶water∶acetic acid = 85∶15∶015 27 520 29 470
E,含有 011% 盐酸的甲醇 Methanol including 011% HCl 24 460 29 020
212　两种提取液对 ‘Camarosa’、‘A lb ion’和 ‘W ellp ict’草莓中花青素的提取效果
从液相色谱的分析结果来看 , 含有 011%盐酸的甲醇提取液 ( E) 提取的 3个草莓样品中总花青
素含量均比丙酮 —水 —甲酸提取液 (A ) 高出近 1倍 (表 2)。A是被广泛用于提取花青素的提取液
( Zheng et al. , 2003) , 特别是 García2V iguera等 (1998) 在对比了甲醇后 , 认为丙酮是最适宜的有机
溶剂。本试验尽管没有单独使用丙酮作为处理 , 但丙酮 —水 —甲酸 (A ) 作为提取液不如含有 011%
盐酸的甲醇 ( E) 的提取效果好。
比色法测定花青素含量的结果 , 与液相色谱分析的结果相反 , 也就是说 A提取液提取的花青素
含量明显高于 E提取液。
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表 2　不同提取液和分析方法间的草莓花青素含量的差异
Table 2　D ifference of strawberry an thocyan in con ten ts between two extraction solven ts
and two ana lysis m ethods / (mg·g - 1 )
分析方法
Analysis method
提取液
Extract Camarosa A lbion W ellp ict
比色法 A 01349 a 01364 a 01326 a
Absorbance in buffers E 01303 b 01310 b 01280 b
高效液相色谱 A 01275 b 01228 b 01220 b
HPLC E 01554 a 01435 a 01433 a
　　注 : 同列不同小写字母显示 0105水平差异显著。
Note: D ifferent letters within the same column indicate significant differences ( P < 0105) .
213　5种提取液对 ‘丰香 ’草莓和矮丛蓝莓中花青素的提取效果
不同提取液提取的 ‘丰香 ’草莓和矮丛蓝莓花青素含量如表 3所示。
从表 3可以看出 , 高效液相色谱分析中 , D的提取效果最好 , 比最低的 B提取液高出 2倍以上。
因此 , 添加少量的乙酸到甲醇中比添加盐酸有着更好的提取效果。另外 , C也较广泛地被用于花青素
的提取 (W u & Prior, 2005) , 但其提取液中的花青素含量也显著低于甲醇类提取液。最为广泛应用
的丙酮 —水 —甲酸 (A ) 的提取液中 , 花青素含量只比乙腈 —乙酸 (B ) 的高 , 但显著低于其他 3
种 , 而且还不到甲醇 —水 —乙酸 (D ) 的一半。矮丛蓝莓的结果显示 , 虽然 5种提取液中花青素含量
之间的比例与 ‘丰香 ’草莓的结果有些差异 , 但趋势相似。
从表 3还可以看出 , 比色法分析与液相色谱分析结果相比 , 5种提取液的效果有所不同。用比色
法分析 , D、E和 C提取 ‘丰香 ’草莓和矮丛蓝莓果实的样品中的花青素含量明显低于液相色谱法的
定量结果 , 特别是 D提取液提取的样品 , 比色法测定出的花青素含量只有液相色谱法定量结果的一
半左右 ; 相反 , B提取液提取的样品 , 比色法测定的结果比液相色谱法定量的结果高 2倍以上。用 A
提取蓝莓时 , 两种分析方法的结果极为接近 ; 而提取草莓时 , 比色法分析结果比液相色谱定量结果高
出约 50%。
表 3　不同提取液和分析方法间的草莓和蓝莓花青素含量的差异
Table 3　D ifference of strawberry or blueberry an thocyan in between two extracting solven ts and
two ana lysis m ethods / (mg·g - 1 )
分析方法
Analysis method
提取液
Extract
‘丰香’草莓
Toyonoka strawberry
矮丛蓝莓
B lueberry
比色法 A 01101 a 11264 b
Absorbance in buffers B 01080 c 11041 c
C 01093 b 11314 a
D 01066 d 11346 a
E 01089 b 11352 a
高效液相色谱 A 01068 d 11267 d
HPLC B 01032 e 01494 e
C 01102 c 11672 c
D 01151 a 21383 a
E 01120 b 11783 b
　　注 : 同列不同小写字母显示 0105水平差异显著。
Note: D ifferent letters within the same column indicate significant differences ( P < 0105) .
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　5期 刘仁道等 : 草莓和蓝莓果实花青素提取及定量方法的比较 　
3　讨论
本研究表明 , 高效液相色谱分析中 , 提取草莓和蓝莓花青素时 , 以 D提取液的提取效果最好 ,
其次是提取液 E、C和 A, B提取液的提取效果最差。用比色法分析 , D、E、C提取液提取的草莓和
蓝莓果实的花青素含量明显低于液相色谱分析的结果 , 但 B提取液比液相色谱结果高 2倍以上 , A提
取液提取蓝莓花青素时比色法与液相色谱法的结果相近 , 而提取草莓花青素时比色法比液相色谱结果
高出约 50%。
Rap isarda等 (1994) 用血橙果汁比较比色法和液相色谱定量花青素的结果时 , 尽管后者是前者
的 018～112倍 , 但二者之间有着极高的相关性 , 本结果与之不同。在比较不同有机溶剂和不同方法
分析血橙果汁花青素时 , 有人认为比色法分析的结果最接近液相色谱定量的结果 (Rap isarda et al. ,
2000) , 但这些结果都只是分析已经作为成品的果汁的花青素含量 , 没有提取花青素过程。而直接从
果实中提取花青素时 , 可能因为果实的各种内含成分影响花青素的提取效果 , 对此需作进一步的研
究。
另外 , 因为花青素在较强的酸性条件下相对稳定 , 在提取液中有必要添加酸来维持其稳定性。但
是 , 添加酸的种类不同对花青素本身会产生影响 , 比如添加较强的酸可能引起糖苷键的断裂 ( Zheng
et al. , 2003) , 这会对定量结果产生影响 , 特别是对鉴定花青素种类产生的影响更大。因此 , 在鉴定
花青素种类时应避免向提取液中添加较强的酸。总之 , 在提取各种果实花青素时 , 应作提取液比较的
预备试验 , 确定提取液的种类。
对定量方法而言 , 液相色谱定量法是经过将混合状态的成分分离以后 , 再行定量 , 因此混杂物的
影响较小 , 其定量结果较为准确。比色法是利用花青素在 pH 110的条件下在 500～540 nm的波长之
间具有明显的吸收峰 , 而在 pH 415时不具吸收峰 (W rolstad, 1976) , 根据其在两种缓冲液中的吸光
度的差值来测量花青素的含量。这对于标样或者提纯的提取样品有较高的准确性 , 但对于提取液提取
的样品 , 未经提纯而直接供试的话 , 会受到其中所含其他成分的影响而降低其准确性。因此 , 不同种
材料的花青素含量应尽量选用液相色谱进行定量 , 而作同种材料之间的花青素含量比较时可以使用比
色法测定。
References
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收稿日期 : 2008 - 01 - 30; 修回日期 : 2008 - 04 - 14
基金项目 : 国家转基因植物研究与产业化开发专项项目 (JY042B202)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wangzhongwei@ cjaas1com; ysdong@cjaas1com)
山楂海棠的离体培养与快速繁殖
李海云 , 王中伟 3 , 马 　瑞 , 邢少辰 , 刘艳芝 , 董英山 3 　
(吉林省农业科学院生物技术研究中心 , 长春 130033)
In V itro Culture and Rap id Propaga tion of M a lus kom a rovii ( Sarg1) Rehd1
L I Hai2yun, WANG Zhong2wei3 , MA Rui, X ING Shao2chen, L IU Yan2zhi, and DONG Ying2shan3
(B iotechnology Research Cen ter, J ilin A cadem y of A gricultural Sciences, Changchun 130033, China)
关键词 : 山楂海棠 ; 茎段 ; 离体培养 ; 快速繁殖
中图分类号 : S 66114　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520660201
山楂海棠 [M alus kom arovii ( Sarg. ) Rehd. ] 仅零星分布于长白山 , 现处于濒危状态。山楂海棠极耐严寒 , 植株
低矮 , 是培育苹果属矮化品种和研究抗寒性的宝贵材料。用播种、扦插及压条法都能繁殖 , 但生长和繁殖速度极慢。
2005年 7月在吉林省长白县 (长白山南麓 ) 采集健壮的山楂海棠新梢 , 剪掉叶片 , 流水冲洗 30 m in后剪成带腋
芽的 115 cm左右的单芽茎段 , 在超净工作台上用 75%酒精灭菌 30 s, 无菌水冲洗两遍 , 再用 011% HgCl2溶液震荡灭
菌 8 m in, 无菌水冲洗 3～4次。用无菌滤纸吸干茎段表面水分 , 于芽上下各留约 015 cm处剪切 , 接种在 MS + 62BA
015 mg·L - 1 +NAA 0102 mg·L - 1启动培养基上。温度 (25 ±2) ℃。2 000～3 000 lx, 16 h·d - 1。培养基中含琼脂粉
7 g·L - 1 , 蔗糖 30 g·L - 1 , pH 518。接种 1周后腋芽开始萌动生长。
腋芽长至 2 cm时切下接种到 MS + 62BA 110 mg·L - 1 +NAA 011 mg·L - 1上增殖培养 , 10 d后芽基部产生少量愈
伤组织并分化出丛芽。将丛芽与带腋芽茎段转接到上述增殖培养基 , 每 20～25 d继代 1次。健壮丛芽繁殖系数为 3～4。
将长约 3 cm的无根苗 (图版 , 1) 基部切成楔形 , 速蘸 100 mg·L - 1的 IBA溶液 , 接到 1 /2MS培养基中诱导生根
(图版 , 2)。约 3 d有少量白色愈伤组织形成 , 7 d可见幼根发生 , 须根逐渐产生。生根率达 90%。
在根长 2～3 cm时打开瓶盖 , 在瓶内注进一薄层水 , 避免培养基干燥 , 进行 2～3 d的炼苗。然后洗去根部培养
基 , 移栽到含有蛭石、壤土和泥炭土 , 具备良好透气性、营养度和保湿性的基质中 ; 前 3 d用 1 /2MS无机盐溶液浇
灌 ; 塑料膜覆盖 , 喷雾保持空气高湿度 , 待移栽成活后除去塑料膜。两周后逐渐增加光照 , 约 4周可移入大田 (图
版 , 3)。移栽成活率可达 80%以上。
图版说明 : 1. 山楂海棠的增殖培养 ; 2. 生根苗 ; 3. 移栽苗。
Explana tion of pla tes: 1. Multip lication culture; 2. Rooted seedling; 3. Transp lanted seedling.
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