全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (2) : 411～413
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 29; 修回日期 : 2005 - 11 - 30
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (39870541)
魔芋的遗传转化研究
李贞霞 1, 2 　张兴国 2
(1河南科技学院园艺系 , 新乡 453003; 2西南大学园艺学院 , 重庆 400716)
摘 　要 : 通过农杆菌介导和基因枪法 , 首次将 AGPS1反义基因导入魔芋基因组 , 并对获得的转基因植
株进行了 PCR和 PCR2Southern检测。
关键词 : 魔芋 ; AGPS1反义基因 ; 遗传转化
中图分类号 : S 63213　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0220411203
Stud ies on Tran sforma tion of Am orphopha llus
L i Zhenxia1, 2 and Zhang Xingguo2
( 1D epartm ent of Horticulture, Henan Institu te of Science and Technology, X inx iang 453003, China; 2 College of horticulture
Southw est U niversity, Chongqing 400716, China)
Abstract: AGPS1 antisense gene was transformed into Am orphopha llus genome for the first time via
Ag robacterium mediated and gene 2gunmethod. The transgenic p lantswere detected by PCR and PCR 2Southern.
Key words: Am orphopha llus; AGPS1 antisense gene; Genetic transformation
1　目的、材料与方法
魔芋是天南星科 (A raceae) 魔芋属 (Am orphopha llus B lume) 的多年生草本植物。魔芋品质的主
要指标为葡甘露聚糖 ( KGM ) 含量的高低 , 魔芋加工的重要内容就是除去淀粉等杂质 , 提取以葡甘
露聚糖为主的结晶体 ———精粉。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (AGP) 是植物淀粉生物合成的关键
酶〔1〕, 该酶的大亚基〔2〕和小亚基 cDNA 片段已从其球茎组织中克隆 ( GenBank 登记号分别为
AF316326和 AF316327)。AGP的小亚基在进化上较为保守〔3, 4〕, 在催化反应中起主导作用。Leidreit2
er
〔5〕等利用光合细胞特异启动子与 AGP小亚基 cDNA 构建成反义表达载体 , 获得的转基因马铃薯叶
片中显著抑制淀粉的合成。本研究将来自魔芋的 AGP小亚基 (AGPS1) 的 cDNA片段构建成反义表
达载体 , 并通过农杆菌和基因枪介导 , 导入魔芋基因组 , 获得转基因魔芋植株 , 期望能够培育高品质
的魔芋育种材料。
用白魔芋 (Am orphopha llus a lbus L iu et Chen) 愈伤组织进行试验 ; 农杆菌菌株 LBA4404, 含有质
粒 pB IN2AGPS1, 含有 AGPS1反义基因和 Kan抗性基因 ; 基因枪转化中质粒为 pPAT2AGPS1, 含有
AGPS1反义基因和 PA T基因。
农杆菌转化时 , 将待侵染愈伤材料在 25℃恒温培养箱暗培养 1～4 d后取出侵染 , 侵染后的材料
在 26～28℃的恒温培养箱共培养 2 d, 转接于加有抑菌剂 Carb 100～600 mg/L的愈伤培养基上暗培养
6～7 d, 再转接于加有 Carb 300 mg/L和 Kan 25～200 mg/L的分化培养基 , 在约 25℃, 昼 /夜为 16 h /
8 h光暗条件下培养。平均每隔 14 d换 1次培养基 , 进行芽诱导和抗性材料的筛选。
基因枪转化时 , 早期用 1 mg/L Basta作为选择压 , 后期筛选使用 2 mg/L较高浓度的 Basta, 能确
保获得真正的转化子 , 氦气压力 /轰击距离以 1 100 p si/9 cm较适宜 , 在轰击前 4 h和轰击后 16 h用
附加有 014 mol/L甘露醇的 MS培养基进行高渗处理 , 轰击后恢复培养 6～7 d, 有利于减少逆境伤害 ,
增加转化成功的几率〔6〕。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
　　基因组 DNA提取时 , 试剂盒购自上海生工生
物工程有限公司。为了区别 AGPS1反义基因与魔
芋基因组含有的 AGPS1正义基因 , 根据所设计的
AGPS1反义基因特点 , 特设计如下 4个引物 , A:
ATGACGCACAATCCCACTATCC ; B: ATCGCAAG 2
ACCGGCAACAGG; C: TCTAGAGTACCAATGTCTT2
CCCAGT; D: GAGCTCGGTACTGCAGATGCTGT 。
因 35S启动子与 nos终止子为魔芋基因组中所没
有的序列 , 如果抗性植株基因组 DNA 经 PCR扩
增后 , 采用 A /B、A /D和 C /B其中任何 1对引物
图 1　AGPS1反义基因表达盒及其 PGR引物
A: 位于 35S启动子上的引物 ; B: 位于 nos终止子上的引物 ;
C: AGPS1 3pi引物 ; D: AGPS1 5pi引物。
F ig. 1　Expression box of AGPS1 an tisen se gene
and the designed PCR pr im ers
A: The p rimer on 35S p romoter; B: The p rimer on nos term inator;
C: 3pip rimer of AGPS1; D: 5pip rimer of AGPS1.
能扩增出相应条带 , 则说明 AGPS1反义基因已整合进魔芋基因组中 (图 1)。 PCR 反应体系为 , 200
μL薄壁管中有无菌水 171378 μL, 10 ×PCR buffer 215 μL, 25 mmol/L MgCL2 115μL, 10 mmol/L
dNTPs 015μL, 5pi引物 1μL, 3pi引物 1μL, TaqDNA酶 01125μL, 模板 DNA 1μL, 共 25μL。程序
为 94℃ 3 m in, 1个循环 ; 94℃ 1 m in, 55℃ 1 m in 30 s, 72℃ 2 m in 30 s, 共 35个循环 ; 72℃ 10 m in,
1个循环。以质粒 pB IN2AGPS1的 DNA为阳性对照 ( + CK) , 非转化植株基因组 DNA为阴性对照 ( -
CK)。10μL PCR产物在含 EB的 1%琼脂糖凝胶中电泳 , 紫外灯下观察照相。抗性植株的 PCR2South2
ern检测均按 Roche公司的 D ig2Labeling and Detecting Kit试剂盒使用说明进行。
2　结果分析与讨论
211　农杆菌介导的魔芋遗传转化
21111　Kan筛选压的确定 　为了确定最适宜于魔芋的 Kan筛选压 , 我们设定了不同 Kan浓度 , 重复
3次发现 : 当筛选压浓度大于 125 mg/L时 , 愈伤组织在缓慢的膨大中逐渐死亡 ; 当筛选压浓度为 100
mg/L时 , 几乎没有芽的萌发 , 其中 1个重复在培养 60 d后仅得到 1个很小的绿芽 , 且该芽不能继续
生长 ; 当筛选压为 75 mg/L时 , 60 d后 , 3个重复共得到 8个芽 , 其芽分化率为 17%。差异显著性分
析结果显示 100 mg/L与 75 mg/L的 Kan在 0105水平上差异显著。因此 , 为了保证试验中能够获得真
正的 Kan抗性植株 , 在试验初期选择 75 mg/L Kan做为选择压。试验证明 , 真正的带有抗性基因的转
化子在 75 mg/L的选择压条件下不仅能够正常生长 , 而且也能忍耐 100 mg/L Kan的较高浓度选择压。
21112　抑菌剂浓度对魔芋愈伤芽分化的影响 　羧苄青霉素做为抑菌剂时 , 它对外植体芽的分化是否
有影响及程度如何是影响遗传转化效率不可忽视的因素。为了验证其对魔芋的影响 , 设定了 3个重
复 , 结果发现 : 抑菌剂浓度在 300 mg/L时 , 芽的分化率比对照降低 7146% ; 浓度增大到 500 mg/L
时 , 芽的分化率比对照降低了 11177% ; 随着抑菌剂浓度的增大 , 对芽分化的抑制也增强 , 但这种抑
制效果在试验浓度范围内与对照的差异不显著 , 因此在筛选时采用 300 mg/L做为抑菌剂。
21113　预培养时间对转化的影响 　预培养时间对魔芋外植体的再生有较大的影响 , 未经预培养的外
植体直接感染农杆菌后 , 几乎没有分化 ; 预培养时间短 , 外植体易褐化 , 且分化的芽瘦弱 ; 预培养时
间长 , 伤口易于愈合不利于农杆菌的侵染和吸附 , 不利于转化。比较试验的结果 , 采用 2 d预培养时
间较为适宜。
21114　转化子的初步筛选结果 　农杆菌侵染魔芋愈伤组织后共培养 2 d, 并在含抑菌剂的培养基上
培养 1周后转入筛选培养基。筛选 1～2个月后 , 大部分愈伤白化或褐化死亡 , 只有少部分色泽正常 ,
并分化少量绿芽 ; 再继续培养后一部分绿芽逐渐白化死亡 , 其中的一少部分仍能继续生长 , 并对 Kan
表现抗性 (图 2) , 证实单子叶植物魔芋不易被农杆菌侵染 , 在高浓度农杆菌感染时未发现有明显的
毒害现象。因此 , 在转化研究中把刚活化的农杆菌液直接滴加到预培养后的魔芋愈伤组织上 , 在高浓
度菌液中进行共培养 , 寄希望提高转化魔芋的机会。结果证实获得了转基因魔芋植株 , 为今后魔芋转
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　2期 李贞霞等 : 魔芋的遗传转化研究 　
基因遗传改良奠定了基础 , 可供其他难于转化的
单子叶植物转化研究借鉴。
21115　抗性植株的 PCR检测 　农杆菌侵染 3 000
～4 000个白魔芋愈伤组织外植体 , 获抗性不定芽
39个 , 用引物 A /B 进行 PCR 扩增有 18个呈阳
性。用引物 A /D对扩增呈阳性的植株再次扩增 ,
检测结果再次证实这 18个植株呈阳性。
研究中发现 : 魔芋基因组 DNA的提取较其它
植物更困难 ,一是其球茎组织含有大量的葡甘露
聚糖 , 水浴后糊化膨胀而吸不出上清液 , 二是魔
芋地上部茎及叶片组织中因含有过多的酚类化合
图 2　经过初步筛选的抗性转化子
右 : 对照 ; 左 : 转化植株。
F ig. 2　Resistance tran sforman t after the prelim inary screen ing
R ight: Control; Left: transformant.
物 , 抽提时整个离心管中液体变红 , 经水浴后无 DNA沉淀。试验中我们对 CTAB法略作了改进 , 即
在 2 ×CTAB抽提液中加入 30%的乙醇以沉淀部分葡甘露聚糖 , 水浴后加入氯仿 ∶异戊醇 ( 24∶1) 离
心 , 虽有上清液出现 , 但最终仅能得到极少的 DNA沉淀。改用正在培养的魔芋愈伤组织来抽提 DNA
时 , 试剂盒的效果稍好于 CTAB法 , 但也是仅能满足 PCR的要求 , 远远不够 Southern所需求的 DNA
用量。因此探索有效的魔芋 DNA提取方法是分子水平上研究魔芋的重要一步。
21116　转基因植株的 PCR2Southern检测 　为排除
PCR扩增假阳性的可能 , 以 PCR的扩增产物进行
Southern杂交分析。魔芋转基因植株及阳性质粒
对照都扩出 1条杂交带 , 而未转化植株却无此带 ,
表明扩增产物就是 AGPS1反义基因片段 (图 3)。
212　基因枪法介导的魔芋遗传转化
共轰击 5次 , 每次 5枪 , 轰击魔芋愈伤组织
近 1 000块 , 经 6～9个月的培养 , 共获得抗性植株
图 3　转基因植株的 PCR2Southern检测
1～10: 转化植株 ; 11: 未转化植株 ; 12: pB IN2AGPS1。
F ig. 3　D etection of the tran sgen ic plan ts by PCR2Southern
1 - 10: Transgenic plants; 11: No2transgenic p lants; 12: pB IN2AGPS1.
91株 , 用引物 A /B进行 PCR扩增有 21株呈阳性 , 用引物 A /D扩增 , 结果再次证实这 21株呈阳性。
魔芋农杆菌介导法和基因枪介导法虽然都获得了转基因植株 , 比较两种方法时发现 : 在农杆菌转
化时进行 PCR扩增时带型专一 , 利用基因枪转化的基因组 DNA在进行 PCR扩增时出现很多的非特异
带型出现 , 对扩增条件进行优化 , 但效果并不明显 , 估计可能与轰击后 DNA的整合有关。
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